Name: 肩上粘 Capsulitis 大鼠模型的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: 了解利用关节内固定技术建立大鼠肩关节粘连性关节囊炎模型的方法。该模型可有效模拟关节僵硬和活动度下降，为研究关节纤维化的治疗策略提供可靠的体内实验平台。

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作者谨此感谢 Tom 和 Phyllis Froeschle 先生及夫人对本项目提供的资金支持。

该研究已获得贝斯以色列女执事医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准。操作过程中注意避免不必要的长时间麻醉，并防止低体温。每次进行关节活动度（ROM）测量时均对动物进行称重，并监测其体重变化。
1. 研究对象
<ol>
	<li>使用10只13周龄的Sprague-Dawley大鼠进行手术，体重范围为250–300 g。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
	<li>在麻醉后、手术固定前，测量外旋60°至内旋80°范围内旋转角度对应的基线扭矩（见步骤5）。</li>
	<li>在诱导室中通过吸入5%异氟烷诱导麻醉，随后在手术过程中通过鼻罩持续给予2%异氟烷维持麻醉。
	<ol>
		<li>在麻醉期间，使用动物下方的水浴加热装置维持其体温。</li>
		<li>为控制疼痛，根据大鼠体重，以1.2 mg/kg的剂量皮下注射缓释布托啡诺。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将左侧肩盂肱关节固定于60°外展角度（肱骨干与肩胛冈之间的夹角）10,11.
	<ol>
		<li>以平行于肱骨干的方向，在肩肱关节稍下方开始做一纵向后侧切口，长度约3厘米。</li>
		<li>使用两条缝线（编织聚酯线）穿过肩胛骨外侧缘及肱骨干远端三分之二处，环绕固定肩肱关节，并按图示收紧 图1A特别注意避免压迫肱动脉等重要结构。 
		注意：该手术技术的优势在于能够将盂肱关节限制在60°外展（Z）而不影响其他平面（X） &amp;#38; Y）。通过在肱骨周围及肩胛骨外侧缘穿缝线，使这两个结构在肩胛骨体平面上接近并保持固定。收紧缝线后，手臂固定于休息位，以考虑 X 的因素。 &amp;#38; Y 平面，以及在考虑 Z 平面时为外展 60°。这被认为有助于限制因未能在三个平面上精细调节关节位置而在动物之间产生的变异性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 关闭切口
<ol>
	<li>止血完全后，使用皮夹关闭皮肤切口。</li>
	<li>停止麻醉，在温暖环境中于监督下让动物恢复。待动物恢复足够意识以维持胸卧位后，将其放回笼中。</li>
	<li>手术后立即让动物恢复正常活动，允许其自由活动，主要依靠内部缝线固定肩关节。</li>
	<li>术后第一周内，每天检查切口部位，以监测可能的感染。</li>
	<li>术后第10天拆除伤口夹th 术后第1天 
	注意：手术过程中未对肌肉进行任何操作，该技术不涉及关节内创伤，从而保留了关节囊和关节的连续性及解剖完整性。本方案中未采用任何外部固定或活动限制。</li>
	<li>使用缓释型丁丙诺啡，于麻醉诱导时开始，按1.2 mg/kg剂量皮下注射给药，必要时每72小时重复一次以提供镇痛。</li>
</ol>
4. 固定后8周拆线
<ol>
	<li>在诱导室中通过吸入5%异氟烷诱导麻醉，随后在整个手术过程中通过鼻罩持续给予2%异氟烷维持麻醉。为实现镇痛，根据大鼠体重皮下注射缓释布托啡诺，剂量为1.2 mg/kg。</li>
	<li>在先前手术留下的瘢痕顶部做一切口。</li>
	<li>剪断缝线，并从肱骨和肩胛骨上移除。</li>
	<li>用伤口夹闭合切口。</li>
	<li>术后第一周每天检查切口部位，以观察是否存在感染迹象。同时监测疼痛和痛苦情况。</li>
	<li>术后第10天拆除伤口夹th 术后第1天</li>
</ol>
5. 关节活动范围与关节僵硬程度测量
<ol>
	<li>使用由臂部夹具、传感器组件和旋转轴组成的定制装置，在固定前后测量肩关节活动范围（ROM）和被动肩关节力学特性11此操作在术前（基线）及拆线后持续进行。
	<ol>
		<li>在拆线后立即（随访第0天）测量关节活动度（ROM），之后每周测量两次。</li>
		<li>当连续测量值与前一时间点相比变化小于10%时，将测量频率减少至每周一次。 
		注意：经过数周的关节活动度（ROM）测试后，每只动物在各测试时间点之间的关节活动度未出现显著变化（变化幅度小于10%）。此时关节活动度似乎已趋于稳定，因此我们认为将测试频率从每周两次减少至每周一次是足够的。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用异氟烷麻醉下进行测量 通过 使用精密蒸发器，诱导时浓度为5%，维持时浓度为2%，在整个手术过程中持续使用（约5分钟），以高效完成测量。在动物下方使用水浴加热装置，以维持麻醉期间的体温。</li>
	<li>使用激光引导辅助，将动物正确摆位以进行关节活动度（ROM）测量。将前肢置于臂夹上，保持90°前屈，使感应轴与肱骨长轴对齐。按图示方式在腕部和肘部固定前肢 图1B.</li>
	<li>通过步进电机控制前肢被动旋转，以一致的方式评估关节活动范围（ROM）和扭矩。使用微控制器控制步进电机。结合倾角仪和扭矩传感器的输入信号，确定测量的开始与结束。</li>
	<li>将微控制器连接到计算机，并使用自主开发的 MATLAB 代码进行控制。</li>
	<li>仅在进行基线测量时，将传感器组件在60°外旋与80°内旋之间循环3次，以获取初始扭矩测量值（外旋：text 和内部：tint以供后续比较。</li>
	<li>对于关节活动度（ROM）测量，使用每只动物自身基线测量时的扭矩值（text 和 t整型将预设的输入变量输入程序，以检测旋转活动度（ROM）的变化。以基线测量值作为后续ROM测量的比较基准。变化检测的分辨率为0.2°。</li>
	<li>进行刚度测量时，在程序中使用原始旋转角度作为预设输入，即外旋60°和内旋80°，以检测扭矩的变化。变化检测分辨率为0.01 Nmm。</li>
	<li>在每次关节活动度（ROM）评估的同一天对动物进行称重。将动物放置于电子秤上并记录其质量。这些数据被用作评估研究期间动物健康状况的指标之一。</li>
	<li>恢复后，将大鼠放回笼中，并监测其是否存在疼痛或痛苦的迹象。在整个测试过程中，动物均不得无人看管，直至其恢复足够的意识，能够维持胸卧姿势。 
	注意：关节活动度（ROM）和扭矩测量使用本课题组先前报道的定制设备完成{Villa-Camacho 2015}。该设备为自制夹具，包含由步进电机驱动并通过自定义MATLAB脚本控制的转轴。在样本关节活动过程中，利用扭矩传感器和惯性测量单元采集扭矩和位置数据。</li>
</ol>
6. 死后免疫组织化学分析
<ol>
	<li>在为期8周的关节活动度（ROM）测量期结束后，通过暴露于CO2对大鼠实施安乐死。</li>
	<li>解剖左侧（固定侧）和右侧（健康对照侧）肩关节，分离肱骨与尺骨，并切断肩胛骨与锁骨及胸腔的连接。</li>
	<li>将切除的肩关节组织置于10%中性缓冲甲醛溶液中固定3天，随后在pH 7.4的10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙，持续约2个月。</li>
	<li>在此过程中，将样本置于摇床上以轻柔振荡模式处理，并在4 °C下保存。每周采用微型计算机断层扫描（μCT）监测肱盂关节的脱钙进程。 
	注：EDTA是一种螯合剂，可结合羟基磷灰石晶体表面的钙离子，逐步减小晶体尺寸12,13,14。该过程缓慢而温和，适用于需保留特定组织成分的技术，如免疫组织化学（IHC）。EDTA对样本的脱钙速率取决于溶液的pH值和浓度。pH值通常在7至7.4之间，碱性更强的溶液可加快脱钙速度，但高pH值可能损伤关键的组织成分。此外，此类实验常用的EDTA浓度为10%至14%，但需注意，一旦EDTA与钙离子结合，其活性成分即被消耗，因此每周至少需更换脱钙液3至4次15。</li>
	<li>脱钙完成后，将肱盂关节组织包埋于石蜡块中，进行组织学切片。切片方向应为冠状面。图中显示的是在肱骨头50%深度处（中心，冠状中线）获取的切片，见图1。采用过氧化物酶-抗过氧化物酶法进行免疫组织化学染色，以标记关节内纤维化组织的存在4,9,10,16。</li>
	<li>通过微波照射进行抗原修复：将载玻片浸入塑料Coplin染色缸中的柠檬酸钠缓冲液（10 mM柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0，预热5分钟至95–100 °C），放入普通微波炉中，中等功率加热10分钟。随后让载玻片在室温下冷却30分钟。</li>
	<li>用山羊血清封闭30分钟，并在4 °C下与一抗小鼠单克隆抗体（1:400稀释）孵育过夜，靶标为纤维连接蛋白。</li>
	<li>与一抗孵育后，用PBS（0.5 µg/mL）洗涤样本两次，每次10分钟；然后加入二抗——山羊抗小鼠IgG-过氧化物酶偶联物（1:400稀释），孵育30分钟。</li>
	<li>在摇床上用PBS（2.5 µg/mL）洗涤样本两次，每次10分钟，随后在避光条件下用3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和30%过氧化氢孵育10分钟。最后用Carazzi苏木精复染。</li>
</ol>

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<li>Sanjai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+comparison+of+decalcification+agents+on+the+human+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation and comparison of decalcification agents on the human teeth.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 222-227 (2012).</li>
<li>Rolls, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRolls%2C+G+%22An+Introduction+to+Decalcification%22">An Introduction to Decalcification</a>. , (2013).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Sarver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+rotator+cuff+repair%2C+stiffness--but+not+the+loss+in+range+of+motion--increased+transiently+for+immobilized+shoulders+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Shoulder+and+Elbow+Surgery%22%5BJournal%5D)">After rotator cuff repair, stiffness--but not the loss in range of motion--increased transiently for immobilized shoulders in a rat model.</a> Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 17 (1 Suppl), 108S-113S (2008).</li>
<li>Macbride, M. Variations within Outbred Strains: Know Your Strains and Stocks | Taconic Biosciences. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.taconic.com/taconic-insights/quality/variations-within-outbred-strains-know-your-strains-and-stocks.html">https://www.taconic.com/taconic-insights/quality/variations-within-outbred-strains-know-your-strains-and-stocks.html</a> (2016).</li>
<li>Liu, Y. L., Ao, Y. F., Cui, G. Q., Zhu, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+histology+and+capsular+collagen+in+a+rat+shoulder+immobilization+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Changes of histology and capsular collagen in a rat shoulder immobilization model.</a> Chinese Medical Journal. 124 (23), 3939-3944 (2011).</li>
</ol>

本研究通过肩关节盂肱关节的内固定，建立了一种肩周炎（粘连性关节囊炎）的大鼠模型。此外，研究显示，在移除内固定后，总关节活动度（ROM）的显著降低至少可持续8周。为了计算不同时点关节活动度（ROM）的变化，测量结果均与各动物个体的基线数据进行比较。相比之下，Kanno et al.10&#160;则对所有动物使用标准化扭矩来测定离体（ex vivo）状态下的关节活动度（ROM）变化。
2008年，Sarver 等17报道了由非手术外固定引起的肩关节僵硬。他们的研究表明，在受伤并接受治疗的肩关节固定后，关节僵硬呈一过性增加，但在随访第8周时已恢复正常。然而，在本研究中，我们并未发现力矩与角度之间存在线性关系，而是符合多项式拟合（图3）。此外，仅在内旋评估中发现关节僵硬与基线相比具有统计学显著差异，其中在固定8周后僵硬程度仍持续增加了25.7%。
<p class="jov...

肩关节粘连性关节囊炎常被称为冻结肩或肩关节挛缩。其特征为盂肱关节活动受限并伴有疼痛，可能是由于严重的纤维化和关节挛缩所致1,2,3。该疾病涉及成纤维细胞和肌成纤维细胞的募集，导致关节囊内形成致密的胶原基质（I型和III型）2,3。发生关节挛缩的潜在危险因素较多，包括性别、糖尿病、甲状腺功能亢进、创伤性损伤以及长期制动4,5,6。
目前缺乏有效的治疗方案，主要治疗方法包括物理治疗，在保守治疗无效的极端情况下可采取手术松解。最佳治疗方案尚未确定，多年来一直是医学领域广泛关注的课题7,8。开发新的治疗手段需要建立一种可重复的动物模型，且该模型不应依赖于关节内诱导创伤。理想的粘连性肩关节囊炎模型应包含该疾病的两个主要特征：肩关节囊挛缩和关节活动范围（ROM）长期受限。Schollmeier et al.9首次通过使用石膏固定建立犬类肩关节挛缩模型。他们还报告称，在解除制动后，关节活动范围和关节内压力可恢复至正常水平9。然而，该研究中提到的一个重要局限性是，由于采用石膏固定技术，动物间肢体位置存在差异。为了获得更可重复的模型，Kanno et al.10随后提出了一种使用肩关节刚性内固定的粘连性肩关节囊炎大鼠模型。尽管该模型显著降低了关节活动范围，但作者未说明这些变化是暂时性的还是持久性的。本研究旨在通过探讨长时间关节外肩盂关节制动对关节活动范围和关节僵硬度的影响，建立一种合适的体内肩关节挛缩大鼠模型。

<table><tbody><tr><td>斯普拉格-多利大鼠</td><td>Charles River Laboratories，美国马萨诸塞州威尔明顿</td><td></td><td>250–300 克</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射针头</td><td></td><td></td><td>BD 1英寸 30号</td></tr><tr><td>持针器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% 异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% 异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鼻罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀及刀柄</td><td></td><td></td><td>11号手术刀</td></tr><tr><td>弯血管钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直血管钳</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织牵开器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>有齿组织镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无齿组织镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>缝合剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>皮肤缝合钉施加器</td><td></td><td></td><td>任何标准的伤口闭合钉</td></tr><tr><td>固定材料</td><td>Ethicon</td><td></td><td>使用2-0编织聚酯Ethibond缝线进行固定</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他材料：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制的关节活动度（ROM）装置：1）传感器组件，2）旋转轴，3）臂部夹具</td><td></td><td></td><td>该组件在松弛素论文和粘连性肩关节囊炎论文中有描述</td></tr><tr><td>方位传感器（传感器组件的一部分）</td><td>MicroStrain公司，美国佛蒙特州威利斯顿</td><td></td><td>3DM-GX3-15</td></tr><tr><td>反作用力矩传感器（传感器组件的一部分）</td><td>Futek公司，美国加利福尼亚州尔湾</td><td></td><td>TFF400</td></tr><tr><td>步进电机</td><td>SparkFun Electronics，美国科罗拉多州尼沃特，邮编80503</td><td></td><td>https://www.sparkfun.com/products/13656</td></tr><tr><td>微控制器</td><td>意大利都灵</td><td></td><td>Arduino UNO，R3</td></tr><tr><td>MATLAB代码</td><td>MATLAB 7.13.0.564，美国马萨诸塞州纳提克</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td></td><td></td><td>Ohaus</td></tr></tbody></table>

肩关节粘连性囊炎大鼠模型

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

本提案旨在创建一个 体内 用于研究粘连性肩关节囊炎及其他类似关节纤维化病因潜在治疗方案的大鼠模型。该模型包括对大鼠肩关节进行关节外固定 通过 肩胛骨至肱骨缝合，导致继发性挛缩，但未侵入关节腔，引起旋转活动范围减小和关节僵硬程度增加。
本研究使用了10只Sprague-Dawley大鼠。在肩盂关节固定前，采集了关节活动范围（ROM）的基线测量值。大鼠接受8周的固定后，拆除固定缝线，并评估ROM及关节僵硬程度的变化。为评估固定是否导致ROM显著减小，计算了运动学参数的变化。在随访期间的每个时间点测量ROM，并与基线时的内旋和外旋ROM值进行比较。为评估关节僵硬程度，通过计算达到初始60°外旋和80°内旋所需扭矩（text 和 tint）的差异，来确定关节动力学参数。
在随访第0天拆除关节外缝线固定后，我们发现总活动范围（ROM）较基线水平下降了63%。随后观察到关节活动度持续改善，至随访第5周时改善速度减缓，最终稳定在约19%的活动受限水平。在随访第8周时，关节活动范围仍存在18%的受限。此外，在随访第0天，我们发现扭矩较基线水平增加了13.3 Nmm。至第8周时，总扭矩测量值比初始测量值高出1.4 ± 0.2 Nmm。本研究建立了一种具有持续性活动范围减小和关节僵硬增加特征的大鼠肩关节粘连性关节囊炎模型。

活动范围
在随访第0天，我们发现总活动范围（ROM）较基线水平下降了63%（P &lt; .001）。我们观察到ROM逐渐改善，直至随访第5周时进展停止，此时活动受限为19%（P &lt;0.001）。在随访第8周时，残余的活动受限仍明显存在，为总ROM的18%（P &lt;0.001）。
刚度
在随访第0天，我们发现总力矩较基线水平增加了13.3 Nmm（P &lt;0.001）；其中外旋力矩增加8.9 Nmm（P = 0.002），内旋力矩增加4.4 Nmm（P &lt;0.001），导致外旋力矩增加了138.8%，内旋力矩增加了159.6%，总体力矩增加149.2%。在随访第8周时，测得的总力矩比基线高1.4 ± 0....

本方案介绍了一种用于粘连性肩关节囊炎的体内大鼠模型。该模型通过关节外缝线固定对肩盂肱关节进行内固定，并维持较长时间，从而导致关节旋转活动范围（ROM）减小和关节僵硬程度增加。

本研究旨在建立一种用于探究粘连性肩关节囊炎及其他相关疾病潜在治疗方法的活体大鼠模型。

该方法有助于解答骨科手术领域的一些关键问题，例如，对于患有关节纤维化的患者，采用该方法是否能够通过松解来改善其关节活动范围？该技术的主要优势在于，它避免了肩带肌肉的切断以及任何关节内创伤，从而保留了关节囊和关节的连续性及解剖完整性。在开始操作前，将步进电机的微控制器连接至计算机，并设置自行开发的Matlab代码以控制该微控制器。接下来，借助激光引导装置，将一只13周龄、体重250至300克的Sprague Dawley大鼠置于定制的活动范围测量设备中。然后，将大鼠的左前肢置于臂夹上，使其处于90度前屈位，并使传感器的感应轴与肱骨长轴对齐，再通过腕部和肘部固定前肢。随后，使用微控制器控制前肢的被动旋转，利用倾角计与扭矩传感器的输入信号共同确定测量的起止点，在60度外旋与80度内旋之间循环传感器组件三次，以获取基线扭矩测量值。为进行肩关节的手术固定，在确认动物对脚趾夹捏无反应后，于肩关节下方开始，沿肱骨干做一条长约三厘米的后侧纵向切口。使用两条编织聚酯缝线，分别穿过肩胛骨内侧缘及肱骨干远端三分之二处，随后收紧缝线以固定肩关节。使用伤口夹闭合切口，并在术后第一周内每天监测切口部位是否感染。固定后八周，在之前手术留下的瘢痕上方做切口，移除肱骨和肩胛骨上的缝线。然后用新的伤口夹闭合切口，并按所示方法测量肩关节的被动力学性能。为了测量活动范围，使用基线时的扭矩值作为程序中的预设输入变量，以 0.2 度的分辨率检测旋转活动范围的变化。对于刚度测量，使用初始旋转角度（外旋 60 度和内旋 80 度）作为程序中的预设输入，以 0.01 牛·毫米的分辨率检测扭矩的变化。每次活动范围评估当天对动物进行称重，作为研究期间评估动物健康状况的工具之一。然后将动物放回笼中，在第二次手术后的第一周内每天监测感染、疼痛或不适的迹象，并在术后第10天拆除伤口夹。完整组显示出肩关节囊与肱骨头关节面之间正常的分离，以及滑膜组织和关节软骨中正常的细胞排列。然而，手术固定组则表现出肩关节下方存在关节囊粘连的证据。此外，与完整的肩关节相比，周围组织显得更为致密，导致关节囊更紧，关节腔空间减小。在进行该操作时，务必注意正确安置动物体位。完成此操作后，可进一步实施其他方法，例如腹腔注射 Relaxin-2，以探讨 Relaxin-2 的全身性作用。该技术问世后，为骨科手术领域的研究人员探索利用Relaxin-2逆转不同病因所致各关节纤维化提供了新的途径。切记，动物实验存在风险，在操作过程中必须采取相应预防措施，例如规范的动物操作和佩戴个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

肩上粘 Capsulitis 大鼠模型的建立

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反式全肩关节置换术

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关节镜下治疗巨大不可修复性肩袖撕裂：利用肱二头肌近端肌腱自体移植物进行全肩袖缆绳重建

本文是一篇技术说明，介绍一种经济高效、无需打结、独立的双排缝合肩袖修复技术，适用于中到大型肩袖前上部撕裂的修复，同时可进行肱二头肌加强和肩胛下肌修复。...

无结独立双排修复联合肱二头肌加强术治疗肩袖前上部撕裂

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一种基于壳聚糖的激光激活薄膜外科粘合剂“SurgiLux”：制备与应用演示

了解利用关节内固定技术建立大鼠肩关节粘连性关节囊炎模型的方法。该模型可有效模拟关节僵硬和活动度下降，为研究关节纤维化的治疗策略提供可靠的体内实验平台。

肩关节粘连性囊炎大鼠模型

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