Name: 新生儿初乳喂养前后离散催产素分泌脑核细胞应激与炎症的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解新生大鼠初乳喂养前后脑核分离技术，用于研究营养应激对脑发育的影响。该方法可捕获特定脑区并分析应激信号通路，为理解哺乳行为与脑生理机制提供重要工具。

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作者感谢 Manon Ranger 和 Alexandra Schulz 在准备本方案过程中提供的帮助。

本研究已获得哥伦比亚大学和纽约州精神病学研究所机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 组织制备
<ol>
	<li>从供应商处订购配孕时间明确的大鼠。</li>
	<li>在大鼠到达后的数周内，通过观察其腹部逐渐增大来跟踪配孕情况，并在预计分娩日每隔2小时检查笼子一次，以确认仔鼠出生。</li>
	<li>在首次哺乳前（观察腹部无白色乳糜腹）或首次哺乳后（此时腹部可见白色胃区）用戴手套的手抓住仔鼠尾部将其取出，具体时间点参见时间线（图S1）。 
	注意：首次初乳喂养称为“启动”仔鼠，因此仔鼠在首次喂养前为未启动状态，喂养后则为初乳启动状态。</li>
	<li>使用锋利、洁净的手术剪对未麻醉的仔鼠迅速进行断头处理。</li>
	<li>沿颅骨中线及顶部表面剪开皮肤至鼻部以暴露脑组织，然后用镊子轻轻剥离颅骨，暴露大脑（图1A），定位前囟（bregma），并在去除骨板时用笔标记前囟位置（图1B）。</li>
	<li>迅速将完整大脑置于室温下的聚甲基丙烯酸甲酯脑模中，用于在室温下进行冠状切片（图1C）。</li>
	<li>立即使用新的剃刀刀片切割出500 μm厚的脑片，并将切片按头端至尾端顺序放置于培养皿中，以保持切片方向（图2）。</li>
	<li>迅速加入不含葡萄糖的人工脑脊液（ACSF；1.0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118.6 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 203.3 mM MgCl2-6H2O），并将切片在28–30 °C条件下孵育60分钟，同时在旋转摇床上持续搅拌，以对未启动与初乳启动组织进行代谢和差异性刺激。</li>
	<li>根据脑图谱33及组织切片上的解剖标志确定需打孔取材的脑核团。将含有目标核团的切片放入培养皿，并转移至解剖显微镜下。</li>
	<li>在显微镜下观察后，立即使用打孔工具快速取出6个不同核团中的4个，选择合适的打孔尺寸以准确获取目标核团，并确保各样本间操作一致（图2）。 
	注意：剩余脑切片将在组织被取出处留下孔洞。本研究中使用以下坐标切除核团。所有前后（A/P）坐标均以前囟（Bregma）为参考点（除孤束核NTS外，其参考点为笔杆脚Calamus Scriptorius）。所有背腹（D/V）坐标均以皮层表面为参考（除NTS外，其以延髓表面为参考）。以下坐标包括A/P、内外侧（M/L）和D/V，单位为mm：1）孤束核（NTS，A/P，0.4至0.8；L，±0.2；D/V，0.3（自延髓表面）），2）室旁核（PVN，-0.8；±0.2；0），3）视上核（SON，-1.1；±1.4；4.3），4）皮层（CX，部分皮层区域1，-2.8；±1.5；0.6），5）纹状体核（STR，-0.0；±1.6；1.8），6）内侧视前核（MPO，-0.6；±0.2；4.2）。</li>
	<li>迅速将打孔所得核团组织浸入0.06 mL冰浴的蛋白提取缓冲液中，缓冲液中含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，孵育60分钟（见步骤2.3）。</li>
</ol>
2. 蛋白质提取
<ol>
	<li>使用蛋白裂解试剂盒配制蛋白提取液（材料表在预计分娩前一天</li>
	<li>将裂解缓冲液试剂盒中蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷冻水溶液（-20 °C）置于冰上解冻，并将裂解缓冲液以及含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的DMSO溶液置于冰上。</li>
	<li>向一个洁净的预冷15 mL离心管中加入1.85 mL裂解缓冲液，然后加入0.1 mL水溶性抑制剂溶液和0.05 mL DMSO溶解的抑制剂溶液。最后盖紧管盖，短暂涡旋混匀，置于-20 °C保存备用。</li>
	<li>标记24个干净的微量离心管（每管0.5 mL），用于裂解步骤。为初乳未致敏组（U）每个脑组织分配12个管（左侧（L）和右侧（R）脑核各6个），并根据脑核缩写、侧别和条件进行标记例如NTS-L-U，NTS-R-U 等等。）为第二组12个试管标记初乳预处理样品。</li>
	<li>另取两组试管，按照步骤2.4的方法进行标记，分别用于储存蛋白质提取物（使用1.5 mL Eppendorf型试管）和第一组样品制备（使用0.5 mL试管）。将这两组试管分别存放于两个独立且已标记的冻存盒中（每个冻存盒设计可容纳100支试管），一个冻存盒用于存放未诱导样品，另一个用于存放诱导后样品。</li>
	<li>在仔鼠出生当天将裂解液置于冰上解冻，同时在ACSF中孵育脑切片时，将0.06 mL裂解液分装至裂解程序管（步骤2.4）中，加入核团穿孔组织，冰上孵育60分钟。</li>
	<li>将孵育后的裂解细胞核在预冷的微型离心机中以14000 rpm（10,000 × g）离心30分钟，用校准好的移液器小心吸取0.055 mL上清液。将上清液转移至预冷的1.5 mL储存管（步骤2.5）中，并置于冰上。在将蛋白储存管于-20 °C冷冻前，取0.012 mL上清液转移至0.5 mL预冷离心管（步骤2.5）中用于首次样品制备，并保持在冰上。</li>
</ol>
3. 毛细管内蛋白质检测的样品制备
<ol>
	<li>使用试剂盒并根据制造商说明配制用于分离的试剂。将 0.003 mL 的主混合试剂加入冰上预冷的 12 个 0.5 mL 标记离心管（来自步骤 2.5）中，每管含有 0.012 mL 蛋白质提取物。</li>
	<li>将加热模块预热至 95 °C，并向含有 0.016 mL 去离子水的试管中的生物素标记分子量（MW）标准品加入 0.004 mL 步骤 3.1 中配制的试剂。为使标准品和样品变性，将标准品管和 12 个未致敏大鼠蛋白提取物样品管置于 95 °C 加热模块中孵育 5 分钟，随后于 4 °C 保存备用。</li>
	<li>对初乳致敏大鼠的 punched 核样本，重复步骤 2.0 至 3.2，从蛋白质提取到样品制备。</li>
</ol>
4. 电泳准备
<ol>
	<li>将生物素标记试剂（储存在-80 oC超低温冰箱中）在室温下解冻，并按照制造商说明在冰上（4 °C）准备蛋白检测试剂盒。</li>
	<li>将0.15 mL鲁米诺与0.15 mL过氧化物混合，取0.01 mL加入自动Western仪微孔板的25个孔中（E行，1-25号孔）；从试剂盒中取0.008 mL链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）加入D1至D25号孔。</li>
	<li>将0.01 mL抗体稀释液加入C1至C25号孔以及B1号孔。</li>
	<li>将24个蛋白样品管和蛋白ladder管在小型离心机中短暂离心（2-3秒），以收集管盖内壁蒸发的冷凝液。</li>
	<li>将0.003 mL的12个未初乳刺激样品加入A2至A13号孔，0.003 mL的12个初乳刺激样品加入A14至A25号孔，以及0.005 mL生物素标记的蛋白ladder加入A1号孔。</li>
	<li>F行保持空置，并在F行下方每排的5个槽中各加入0.45 mL洗涤缓冲液。用塑料盖盖住微孔板，以防止后续操作过程中液体蒸发。</li>
	<li>将解冻后的生物素标记试剂短暂涡旋混匀，取0.15 mL加入指定样品管中；再加入0.15 mL总蛋白重悬试剂，充分混匀至均匀溶液。</li>
	<li>打开微孔板盖，将试剂1和试剂2各0.01 mL加入B2至B25号孔。盖上盖子后，在1,000 × g条件下离心10分钟，以去除各溶液中的气泡。离心时使用空板配平。</li>
</ol>
5. 电泳
<ol>
	<li>在平板旋转的同时，通过计算机上的下拉菜单从“文件”中选择运行总蛋白检测，并点击相应位置，在自动 Western 仪连接的计算机中打开一个运行文件。</li>
	<li>在计算机中按孔位标注样品。然后将平板从离心机中取出，移去盖子，并小心地剥离分离液腔室上的铝箔盖。</li>
	<li>将平板放入自动 Western 仪器中，撕去毛细管盒上的覆盖膜，将毛细管盒插入指定位置，然后关闭仪器门。</li>
	<li>点击“运行”按钮，当提示输入检测类型（“总蛋白”）时，输入样品名称（例如，“未致敏 2-13 和初乳致敏 14-25”）。点击“确定”，当提示输入激活的运行日期和运行文件的 ID 编号时，记录下运行结束的时间。</li>
	<li>运行结束后（自开始起 170 分钟），打开仪器门，取出毛细管盒，并将其丢弃至锐器废弃物容器中。将平板丢弃至生物废弃物容器中。</li>
	<li>在运行文件的分析页面中点击分离曲线图标，检查所有样品是否正常运行，并确认所有毛细管中均显示多条蛋白曲线。</li>
</ol>
6. 信号蛋白的分析
<ol>
	<li>在已标记的 1.5 mL 离心管中，加入 0.003 mL 兔抗磷酸化 eIF2α (p-eIF2α) 抗体，并用检测试剂盒中的抗体稀释液将其稀释至 0.3 mL（1:100 稀释），混匀后置于冰上保存。</li>
	<li>标记一个鲁米诺（luminol）管，从检测试剂盒中加入 0.15 mL 鲁米诺溶液和 0.15 mL 过氧化物溶液，然后将 0.01 mL 混合液分别加入新的全自动 Western 板的 E1 至 E25 孔中。</li>
	<li>将 0.01 mL 二抗（抗兔抗体）加入 D2 至 D25 孔中，并在 D1 孔中加入 0.01 mL 试剂盒提供的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）。</li>
	<li>将 0.01 mL 一抗（来自步骤 6.1）加入 C2 至 C25 孔中，并在 C1 孔以及 B1 至 B25 孔中各加入 0.01 mL 抗体稀释液 2 溶液。</li>
	<li>保持 F 行各孔为空，并在 F 行下方三行的 5 个区室中各加入 0.45 mL 洗涤缓冲液。</li>
	<li>将冷藏的样品短暂离心 3 秒，然后按照总蛋白检测时相同的顺序，从 A2 至 A25 孔开始，向 A 行各孔中加入 0.003 mL 样品；在 A1 孔中加入 0.005 mL 生物素标记的分子量标准（MW ladder），随后盖上板盖。</li>
	<li>按照步骤 4.8 的条件离心该板。在离心过程中，打开与全自动 Western 系统配套的软件和计算机，创建一个新的运行文件，并在“文件”下拉页面中选择相应的选项，启动分子大小检测程序。</li>
	<li>在检测页面中，输入每个毛细管对应的样品名称，然后在指定位置输入一抗的名称，并在其下方输入二抗（抗兔抗体）的名称。</li>
	<li>离心结束后，重复执行步骤 5.3–5.5，但此次运行文件的名称应设为“p-eIF2a on unprimed 2–13 and colostrum-primed 14–25”。</li>
	<li>电泳分离完成后，检查运行文件中抗原在 40–43 kDa 分子量范围内的免疫反应峰。若该大小范围内出现峰但未标注分子量，可在曲线下方右键点击，并在下拉列表中选择“添加分子量至峰”，以确保记录该峰的大小及曲线下任意单位的定量值。</li>
</ol>
7. 结果处理
<ol>
	<li>为自动 Western 运行文件中的总蛋白运行打开一个电子表格文件，并提供一个编号。</li>
	<li>在分析页面的曲线模式下打开总蛋白检测的运行文件，标记各个毛细管中的所有峰。然后将其复制并粘贴到电子表格中，并计算整个毛细管记录的所有峰曲线下面积的总和。</li>
	<li>在另一列中，按毛细管编号、相应脑核名称以及运行文件的编号，排列每列的总蛋白量。</li>
	<li>为 p-eIF2α 抗原打开一个电子表格，在单列中并列记录每个毛细管的曲线下面积、相应的毛细管编号、脑核名称以及运行文件的编号。</li>
	<li>将总蛋白列（与 p-eIF2α 曲线量平行）复制到第三个电子表格中，并在第三列中计算 p-eIF2α 与总蛋白的比值。</li>
	<li>收集步骤 4 至 6 中每个脑核的结果，按脑核分组整理，并生成柱状图。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于显微解剖新生大鼠脑中离散且富含催产素受体（OTR）脑核团的技术。众所周知，即使在脑内已被充分表征的核团中，神经元也具有高度特化性。这种高度可重复的特异性富含OTR核团分离方法，能够实现可靠的假设检验。通过采用自动化Western印迹技术，进一步提高了结果的一致性和可重复性。尽管该技术仍存在一定程度的脑组织取样变异性的局限性，但相较于单细胞、全脑或脑切片方法，已有所改进。单细胞方法因仅能提供极为有限的瞬时信息而变得复杂；若使用全脑组织，当效应局限于特定脑区或神经元亚型时，任何发现都可能被稀释。在未进行显微解剖的情况下使用脑切片方法，可能在切片内仅数微米范围内就引入显著的结果变异性，这对于本研究中的下丘脑尤为不利，因其不同核团排列紧密。通过使用标准化的取样钻头并借助显微镜辅助，有效降低了蛋白质检测中的变异性。
本方案中有多个关键步骤，包括严格遵循首次喂养后组织采集的时间点、使用最小体积的蛋白质提取缓冲液、将脑切片在人工脑脊液（ACSF）中孵育以便使用分子抑制剂或激动剂，以及采用高灵敏度的免疫电泳装置。可能的改进包括选择不同的孵育试剂、调整孵育时间，以及延长未预处理的饥...

与我们对产后数天至数周内大脑早期发育的理解相比，关于大鼠出生后最初数小时内发生的多种动态变化，目前所知甚少。一个主要挑战在于新生大鼠脑体积微小，且需要高技术手段才能分离出特定脑区或单个细胞。现有研究通常仅检测基因转录水平，而非翻译水平1,2，因此无法准确反映激活信号分子的功能水平。另一些研究采用免疫组织化学方法来定位脑区表达，但该方法无法对表达水平进行定量分析3。迄今为止，尚无研究探讨新生大鼠首次摄入初乳后在特定脑区中相关信号通路的激活情况，而此类研究需要快速完成脑组织分离、动物处死，并通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达及蛋白磷酸化水平。尽管脑微解剖技术已常用于年龄较大、体积更大的脑组织，但我们未发现任何文献报道在出生0天（P0）大鼠脑上实施非单细胞级别的脑组织打孔操作。本文介绍一种利用相对低技术含量的打孔法分离新生大鼠脑特定区域，并结合蛋白质印迹法检测小样本中蛋白表达的实验方案。该方案可能适用于需要评估任何物种小型脑组织中特定区域蛋白表达及翻译后修饰（e.g., 磷酸化）的研究问题，前提是操作者能够借助脑图谱和可识别的解剖标志在视觉上准确定位目标脑区。
该技术旨在研究新生大鼠首次摄入富含催产素（OT）的初乳后，其大脑所发生的变化。长期以来，人们已知OT具有促进乳汁排出和子宫收缩的作用。然而，目前研究发现OT在调控多种生理功能和行为中发挥着广泛作用4。例如，OT可协同适应性亲社会行为对抗应激和炎症5，延缓胃排空，并减缓肠道蠕动。在肠神经系统神经元和肠上皮细胞中均已鉴定出OT受体（OTR）6,7,8。OT对胃肠道的作用在出生后早期对婴儿尤为重要。例如，母乳喂养可将大量OT输送至新生个体的肠道9,10，且研究数据显示，在哺乳期间，十二指肠绒毛中OTR呈现显著高表达8。
体外实验利用肠道细胞系已在细胞水平上证明，催产素可调节应激信号通路中的重要分子11,12，并在蛋白质翻译过程中发挥调控作用12。这些研究表明，母乳中的成分（包括来自母体的外源性催产素）在新生儿未折叠蛋白反应中具有重要作用，有助于减轻细胞应激13。
体内和体外研究表明，初乳中的催产素（OT）可调节新生大鼠肠绒毛的细胞应激反应、炎症反应及自噬标志物。当肠道同时暴露于初乳中来自母体的微生物群以及多种蛋白质（包括催产素等激素）时，新生肠上皮细胞在其管腔侧会遭受显著的细胞应激14,15，而催产素在此过程中发挥调节作用9,10,16。
催产素（OT）对大脑的影响已被广泛研究17。然而，OT在出生后早期肠道中的信号传导机制尚未在大脑中进行类似研究。本文采用一种利用电泳技术分离新生大鼠脑干和下丘脑中特定脑核的方法，以对分离出的脑区进行分子表达谱分析。该方法的总体目标是在出生前后、首次哺乳前后，尽可能接近出生状态时捕获脑组织中细胞信号传导的状态，且所用脑组织具有最低的胶质细胞/神经元比例。该技术的开发依据在于，它能够快速分离新生幼鼠中范围局限、微观的脑区，获得神经元组成更均一的样本，用于后续基于自动化Western印迹法的离体（ex vivo）研究，从而在相对微小的解剖样本上获得高度一致的结果。以往研究的不足之处在于多采用较粗略的解剖方式（如脑切片或全脑）且使用较年长的动物18,19。幼鼠大脑具有极强的动态变化特征，出生后会出现多轮胶质细胞分化过程。为了研究幼鼠首次进食所引发的大脑变化，必须对特定的神经核团进行可重复的精确解剖研究。
乳汁喂养通常用于分析其对健康或基因表达的免疫学和营养学影响（例如，在肠上皮细胞中的影响20,21），而其在脑发育期间对脑区的影响却鲜有研究。已有研究分析了乳汁在肠道中通过时对脑功能的影响，相关机制涉及肠道胆囊收缩素受体经迷走神经向脑干核团的信号传递，但未涉及细胞内信号通路22。目前有大量文献报道了孕期母体营养不良对新生儿发育中脑部的易损性，但并未关注应激和炎症信号的作用23。重要的是，本方法利用了出生当天（出生第0天）大鼠新生儿的一种现象，可将来自血液的初乳刺激与内脏刺激的迷走神经传导通路分离开来。这种现象被称为“应激低反应期”，其特征是出生后立即出现的孤束核（NTS）-下丘脑环路尚未发育成熟24,25，从而限制了孤束核（NTS）、室旁核（PVN）和视上核（SON）仅对血液传播的刺激产生反应。
该方法适用于分析多条信号通路，且主要限于神经元细胞，前提是大鼠在出生后第0天采集脑组织，无论母鼠在妊娠期间是否接受过任何处理。可通过同窝仔鼠分析初乳喂养与喂养前信号的影响。在比较蛋白质产量较低与较高脑区之间的信号时，该方法能够在毛细管内平行进行多肽条带的总蛋白测定，同时实现对蛋白质抗原的免疫定量。该方法能够使用任意单位对同一抗体获得的结果进行定量比较，无需标准定量曲线，而是以每根毛细管的总蛋白量作为参照。不同抗体获得的结果仅可通过定量标准曲线进行比较。
该方法可用于评估肠道与大脑之间发生的双向信号传导，这种信号传导可影响两个器官的功能26。近年来，关于催产素与食物摄入之间关系的研究已广泛开展27，这些研究支持催产素信号增强与营养物质可利用性之间存在关联。这些研究还支持相反的观点，即能量缺乏与下丘脑催产素信号的降低相关联。
早期关于催产素（OT）对脑活动影响的研究表明，诱导的肠道炎症可引起下丘脑室旁核（PVN）、杏仁核和梨状皮层中cFos的转录，且该反应不受迷走神经切断术的影响28。然而，系统性输注催产素联合分泌素可降低大脑对肠道诱发炎症反应的cFos表达28。这提示外源性催产素的作用可能通过非迷走神经通路介导，可能经由经后极区传递的血液循环信号分子实现6,29。
本研究评估了先前在肠道中观察到的细胞应激信号通路在脑组织中的表现。研究假设认为，乳汁成分可能保护或延缓炎症对肠道通透性的影响，从而减少微生物及其他代谢物的透过，进而影响脑功能。在初乳13预处理前后，绒毛中IκB与BiP信号通路表现出明显的拮抗性差异，这提示仍处于发育阶段的新生儿大脑可能感知到由初乳诱导的肠道信号。
检测了先前肠道实验中与内质网应激相关的信号蛋白标志物，包括内质网分子伴侣 BiP、翻译起始因子 eIF2a（作为应激反应整合因子30）、eIF2a 激酶 p-PKR，以及两种炎症信号蛋白（NF-kB 及其抑制因子 IkB）。
根据成年个体中分泌或响应催产素（OT）的能力，选择了六个脑区。位于延髓上部的孤束核（NTS）是内脏传入信号的第一级中继站，接收来自肠道迷走感觉神经元的直接信号31，并可能通过邻近的极后区接收血液循环中的细胞因子、毒素和激素信号32。室旁核（PVN）、视上核（SON）、纹状体核（STR）、大脑皮层（CX）以及内侧视前核（MPO）通过NTS接收来自肠道的信号。
结果显示，在初乳启动前的新生儿早期以及首次喂养后即刻，NTS 与 PVN 和 SON 的细胞应激反应存在差异。CX、STR 和 MPO 中的信号传导也不同于 PVN 和 SON。先前研究表明，催产素（OT）具有调节肠道细胞应激和炎症的独特保护功能，大脑某些区域可能感知到这些功能。综合数据表明，在出生后最初数小时内，大脑在细胞水平上会对营养不足所引起的代谢应激产生反应。数据还显示，初乳喂养的调节作用程度和方向具有脑区依赖性，且在某些脑区中，这种作用与先前在肠道中观察到的 OT 效应相似。

<table><tbody><tr><td>Bradford 溶液</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白裂解试剂盒</td><td>Protein simple</td><td>CBS403</td><td>Bicine/CHAPS</td></tr><tr><td>WES 试剂盒</td><td>Protein simple</td><td>WES-小鼠 12-230 主试剂盒 (PS-MK15)、WES-兔 12-230 主试剂盒 (PS-MK14)、WES 12-230 kDa 总蛋白主试剂盒 (PS-TP07)</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG HRP 偶联物</td><td>Protein simple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗磷酸化 eIF2α</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>SER51, 9721</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体抗 PKR</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2103</td><td></td></tr><tr><td>兔抗磷酸化 PKR</td><td>Millipore</td><td>Thr451, 07-886</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗体抗 PKR</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12297</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗体抗 GAPDH</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体抗磷酸化 IκB</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9246</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体抗 IκB</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4814</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 BiP</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3183</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 GCN2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3302</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗体抗磷酸化 GCN2</td><td>BIORBYT</td><td>T899</td><td></td></tr><tr><td>妊娠 Sprague-Dawley 大鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>打孔装置</td><td>WellTech Rapid Core 或 Harris Uni-Core</td><td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td><td></td></tr></tbody></table>

评估新生大鼠首次初乳喂养前后离散催产素分泌脑核中的细胞应激与炎症反应

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

本实验方案的目的是在新生个体初次摄入初乳前后，分离大脑中富含催产素受体的脑核。通过蛋白质印迹法检测了已知对代谢应激有响应的蛋白质在分离出的脑核中的表达水平，以评估机体因营养不足引发的代谢应激是否触发了神经元应激。我们先前已证实，新生儿体内营养不足会在肠道中引起代谢应激。此外，初乳中的催产素可在新生大鼠初次进食前后调节肠道绒毛细胞的细胞应激反应、炎症及自噬标志物。本研究检测了与内质网应激相关的信号蛋白标志物［内质网分子伴侣结合免疫球蛋白蛋白（BiP）、真核翻译起始因子2A（eIF2a）以及eIF2a激酶——RNA依赖性蛋白激酶（p-PKR）］，以及两种炎症信号蛋白［核因子-κB（NF-κB）和抑制因子κB（IkB）］在新生大鼠脑核［孤束核（NTS）、室旁核（PVN）、视上核（SON）、皮层（CX）、纹状体核（STR）和内侧视前核（MPO）］中的表达水平，分别在首次进食前（未受初乳启动）和哺乳开始后（受初乳启动）进行检测。结果显示，在未受初乳启动的NTS组织中，BiP/GRP78和p-eIF2a表达上调，而在受初乳启动后则下调。NF-κB在CX、STR和MPO的细胞质中保持较高水平（持续存在），而在NTS、PVN和SON中，两种条件下NF-κB水平均较低且无变化。综合BiP和p-eIF2a的结果，提示存在应激反应。在SON、CX、STR和MPO中，eIF2a由双链RNA依赖性激酶（p-PKR）介导发生磷酸化；然而，在NTS（以及在较小程度上的PVN）中，eIF2a则由另一种激酶——通用控制非抑制性激酶2（GCN2）介导磷酸化。此前在新生个体肠道上皮细胞中观察到的应激调节机制，似乎在某些富含催产素受体（OTR）的大脑区域中也存在类似表现。NTS和PVN可能在营养缺乏条件下采用不同于其他脑区的磷酸化机制，并对营养不足的影响具有抵抗性。总体而言，这些数据表明，大脑对营养不足应激的反应可能被经初乳启动的肠上皮细胞发出的信号所抵消。

免疫反应性相对于总蛋白的代表性条带显示，某些脑核团收获的蛋白量极低。因此必须采用自动化Western印迹技术，该技术相较于传统的Western印迹具有更高的灵敏度。与传统Western印迹每泳道所需的蛋白量相比，该方法每个毛细管所需的蛋白量可减少至四十分之一。
初乳启动对脑核中 BiP 水平的差异性影响
在首次初乳喂养前（未致敏）和首次喂养后（致敏），采集大鼠脑组织的冠状切片。样品通过毛细管电泳（在WES上）进行分馏，并使用毛细管内总蛋白染色试剂盒对蛋白质进行定量（见方案）。在自动化Western系统上进行的额外免疫毛细管分馏可鉴定相应的蛋白质抗原。在图3A中，上方图显示了BiP蛋白表达的代表性结果，下方为对应的总蛋白。BiP是一种内质网分子伴侣蛋白。在<strong class...

本文介绍了一种在新生大鼠初次摄入初乳的同时分离其脑核的实验方案。该技术可用于研究由肠上皮细胞信号调节的营养不足应激对大脑的影响。

本实验方案的目的是在新生儿初次摄入初乳前后，分离富含催产素受体的脑核团。其表达……

该方法有助于解答哺乳期后发育领域中的关键问题，即乳汁吮吸如何影响大脑中的应激信号传导。该技术可用于在首次自然饥饿期期间捕获特定脑区，并将其与初次自然初乳喂养后不久的相应脑区进行比较。了解吮吸行为如何影响行为与情绪的生理机制，有助于在离体脑组织分析过程中使用多种受体的拮抗剂。为获取核团穿孔样本，应用戴手套的手抓住幼鼠尾部将其取出。取出脑组织后，迅速将整个器官置于室温下的聚甲基丙烯酸甲酯脑模具中，并立即使用新的剃须刀片将组织切成500 µm厚的切片。将所得切片按从头端到尾端的顺序依次放置于培养皿中，以保持切片的正确方位。当整个脑组织切片完成后，迅速向培养皿中加入不含葡萄糖的人工脑脊液，并将脑片置于28至30摄氏度条件下，在轨道摇床上持续振荡孵育60分钟。利用脑图谱及每块组织上的解剖学标志，确定需要 punched 的脑核团，并将含有目标核团的脑片转移至新的培养皿中，在解剖显微镜下进行操作。一旦目标核团清晰可见，立即使用打孔工具快速切取4至6个不同的核团，并迅速将每个切取的核团浸入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂、已预先标记好的微量离心管中，每管含0.06 mL冰冻蛋白提取缓冲液，孵育60分钟。孵育结束后，将提取的细胞核在预冷的微型离心机中离心，并用微量移液器小心地从每根离心管中转移 0.055 mL 上清液至冰上预冷的相应 1.5 mL 微量离心管中。在将样品于负 20 摄氏度保存之前，从每根蛋白储备管中转移 0.012 mL 上清液至冰上相应的 0.5 mL 预冷离心管中，用于第一次样品制备。为进行毛细管内蛋白定量，向标记好的 0.5 mL 离心管中的每个样品加入 0.003 mL 蛋白裂解试剂盒中的主混合试剂。接下来，将 0.004 mL 的主混合试剂加入含有 0.016 mL 去离子水的生物素化分子量标准品溶液中，并将标准品和蛋白提取物样品置于 95 摄氏度的加热块中变性，5 分钟后将所有离心管置于 4 摄氏度保存。进行信号蛋白分析时，向新的全自动 Western 板的 E-1 至 E-25 孔中各加入 0.01 mL 新鲜配制的鲁米诺过氧化物溶液，向 D-2 至 D-25 孔中各加入 0.01 mL 二抗（抗小鼠抗体），并向 D-1 孔中加入试剂盒提供的 0.01 mL 链霉亲和素-辣根过氧化物酶。向 C-2 至 C-25 孔中各加入 0.01 mL 新鲜配制的一抗，向 C-1 以及 B-1 至 B-25 孔中各加入 0.01 mL 抗体稀释液二溶液。将F行的孔留空，并在F行下方三行的五个孔中各加入0.45 mL洗涤缓冲液。接着，将冷藏的样品短暂离心30秒，然后从A-2孔开始，向A行的每个孔中加入0.03 mL样品。随后，向A-1孔中加入0.005 mL生物素标记的分子量标准品，并盖上酶标板准备离心。在离心板的同时，在自动 Western 杂交相关软件中打开一个新的运行文件，并启动分子大小检测。在检测页面中，将样品名称输入至每根毛细管，并输入一抗和二抗的名称。离心结束后，将板放入自动 Western 杂交仪中，并撕去毛细管盒的盖膜。离心后，务必检查是否存在气泡，因为毛细管中的气泡会阻断电泳电流，导致整轮实验失败。将卡盒插入仪器指定位置，并关闭舱门。点击开始。当系统提示输入检测类型时，在相应的文本框中输入实验名称，然后点击“确定”。当系统提示输入运行激活日期和运行文件上的编号时，记录下运行结束的时间。运行结束后，将毛细管盒弃置于锐器废弃物容器中，将板弃置于生物危害物废弃物容器中。电泳分离后，检查运行文件中分子量为40至43千道尔顿的抗原免疫反应峰，该峰代表磷酸化的真核翻译起始因子2A。若缺失此大小的分子量峰，可在曲线下方单击右键，选择“添加分子量至峰”，以确保记录曲线下的分子量大小及任意单位数量。在未致敏的组织样本中，孤束核区域细胞核内的结合性氨基球蛋白水平显著高于其他所有区域。初乳对肠道组织的预处理可降低孤束核中结合性氨基球蛋白的核内水平，但对室旁核和视上核无影响。相反，与未经预处理的组织相比，预处理会提高大脑皮层、纹状体核和内侧视前核中结合性氨基球蛋白的蛋白水平，表明在不同脑核中，结合性氨基球蛋白的水平对肠道预处理的反应存在差异，且目前尚未发现所检测的各脑核之间存在明确的相互作用。在未经预处理的情况下，真核翻译起始因子2A及其磷酸化形式的水平高于其他核团。 引物处理后，与未引物处理的组织相比，孤立轨迹细胞核中真核翻译起始因子2A及其磷酸化形式的水平均有所降低。而在所有其他检测的细胞核中，引物处理均使其真核翻译起始因子2A及其磷酸化形式的水平相对于未引物处理的组织升高。然而，在孤立轨迹的细胞核中，未引物处理样本的磷酸化蛋白激酶受体水平相对于引物处理样本较低，这强烈提示另一种激酶参与了真核翻译起始因子2A的磷酸化过程。该技术建立后，为研究出生后发育领域的科研人员探索组织生长和分化相关的信号通路铺平了道路，有助于阐明这些通路是否受吮吸行为的影响或与其无关。请注意，在准备该实验过程中，使用二硫苏糖醇等挥发性还原剂可能存在危险，因此必须采取预防措施，例如在通风橱内进行配制。

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Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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我们描述了一种创伤后应激障碍（PTSD）的大鼠模型，该模型揭示了神经内分泌功能的持续性改变以及延迟出现的长期过度恐惧反应，这些特征与PTSD患者的表现一致。本文所述的动物模型和方法可用于关联脑核团中的生物标志物（具有机制性意义但无法在患者中检测）与外周白细胞中的生物标志物（可检测）。...

用于揭示创伤后应激障碍神经、血液学及行为相关性的动物模型中的生物标志物

本视频展示了从新生大鼠脑组织中分离富含催产素受体的脑核团。通过冠状面切片，随后识别并精确 punched...

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通过高尔基-考克斯染色法观察早期积极经验——触觉刺激对树突形态和突触连接的影响

我们正在测量经历早期生活应激范式——新生儿期母体分离的雄性C57BL/6小鼠前列腺中的会阴部机械敏感性及肥大细胞活化情况，以建立慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的临床前模型。...

新生儿期母体分离小鼠模型中肛周感觉敏感性及前列腺肥大细胞活化的评估

应激性生活事件会损害认知功能，增加精神障碍的风险。本方案阐述了如何利用自动化操作性策略转换范式，研究应激对雄性和雌性Sprague...

使用操作性策略转换范式评估应激对认知灵活性的影响

慢性心理社会应激（CGS）范式在小鼠妊娠期间采用临床相关应激源，以模拟母亲及婴儿的精神疾病。本文提供了应用CGS范式及后续评估方法的逐步操作流程，以验证该模型的有效性。...

使用妊娠期心理社会应激的小鼠模型作为母体与婴儿精神疾病具有转化相关性的研究范式

本文介绍了一种建立早产大鼠模型的简明方案，以促进新生儿期疼痛管理的研究。该方法包括在预产期前3天进行剖宫产手术，通过子宫切除术取出早产仔鼠，并将其与代孕母鼠的亲生仔鼠混合哺育。...

用于疼痛研究的早产大鼠模型

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

本方案描述了一种动物模型，用于研究生命早期逆境（由贫瘠的环境和出生后早期阶段不可预测的母体照料所引发）对大脑发育及未来精神障碍风险的影响。...

有限垫料和筑巢作为小鼠早期生活逆境的模型

本文提供了一种全面的方案，用于建立母体免疫激活（MIA）小鼠模型，以研究妊娠早期炎症对神经发育的影响，包括确保实验可靠性和可重复性的关键指标。...

建立早孕期母体免疫激活小鼠模型以评估产前炎症对神经发育的影响

了解新生大鼠初乳喂养前后脑核分离技术，用于研究营养应激对脑发育的影响。该方法可捕获特定脑区并分析应激信号通路，为理解哺乳行为与脑生理机制提供重要工具。

评估新生大鼠首次初乳喂养前后离散催产素分泌脑核中的细胞应激与炎症反应

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