Name: 前体小鼠膈肌三方突触细胞特异性钙信号的影像学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 探索小鼠神经肌肉接头处特定细胞群体的钙信号成像方法，用于研究神经刺激期间肌肉与施万细胞的钙动态变化。该技术可实时观察细胞激活过程，为神经肌肉传递机制提供重要见解。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）GM103554 和 GM110767 项目（T.W.G.）以及美国国家研究资源中心 5P20RR018751 和美国国家普通医学科学研究所 8P20 GM103513（G.W.H.）的资助。

动物饲养和实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及内华达大学动物照护与使用委员会（IACUC）的规定进行。
1. 转基因小鼠膈肌和膈神经的制备
<ol>
	<li>购买转基因小鼠及用于基因分型的寡核苷酸引物。 
	注意：每种小鼠的引物均列在其对应的“信息”页面上。
	<ol>
		<li>培育一只3至6月龄的小鼠，该小鼠表达一份适当的转基因/基因敲入型Cre驱动等位基因，且不表达任何拷贝的条件性等位基因 GCaMP3/6 与同龄的另一只表达一个或两个拷贝条件性等位基因的小鼠杂交 GCaMP3/6 等位基因且不含Cre驱动等位基因的零拷贝。</li>
		<li>对幼鼠进行基因型鉴定，并标记出同时携带Cre和条件性GCaMP3/6等位基因的个体——这些小鼠此后称为双转基因小鼠（例如, Myf5-Cre, 条件性 GCaMP36. 
		注意：通过这种方法，所有数据将来源于同时携带一份 Cre 基因和一份条件性 GCaMP3/6 等位基因的小鼠。当引入其他突变小鼠时，这一点尤为重要。例如，敲除）引入这些杂交中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当双转基因小鼠达到适当年龄时（例如出生后第0天或第5天（P0或P5）或成年小鼠，使用剪刀断头处死（适用于P10之前的小鼠），或将其置于异氟烷吸入麻醉舱中进行安乐死——当小鼠对镊子夹捏尾部无反应时，即可进行后续操作。</li>
	<li>通过剪刀断头法处死动物。</li>
	<li>用虹膜剪在肝脏下方、心脏和肺部上方横切整个动物体。</li>
	<li>分离肝脏、心脏和肺，注意保留足够长度的膈神经，以便将其吸入吸电极中即，1 - 2 厘米。 
	注意：左膈神经可被识别为一条进入左膈肌内侧部分的白色组织，取出肺脏时不得切断。右膈神经走行于一块筋膜内，该筋膜同时包含上腔静脉，且右膈神经比上腔静脉更细、颜色更白。两者共同穿行通过右膈肌内侧部。</li>
	<li>进一步去除肋骨和脊柱，仅保留膈肌周围的一圈薄脊。</li>
	<li>将膈肌和膈神经样本置于含有Krebs-Ringer溶液的微量离心管中，加入1 µg/mL 594-αBTX，避光孵育10分钟。 
	注意：该浓度的594-αBTX可标记乙酰胆碱受体（AChRs）而不阻断其功能（个人观察）。</li>
</ol>
2. 肌肉动作电位的刺激与记录
<ol>
	<li>使用显微细针，将膈肌固定在涂有硅胶介电凝胶的6 cm培养皿中，并加入约8 mL充氧的Krebs-Ringer溶液，然后将培养皿置于显微镜载物台上。以8 mL/min的流速持续灌注Krebs-Ringer溶液30分钟。 
	注意：此步骤可洗去未结合的594-αBTX，同时使组织在分离后达到平衡状态。</li>
	<li>按照既定方法制备吸吮电极7。
	<ol>
		<li>在4倍放大倍率下，使用显微操作器将吸吮电极移至左侧膈神经上方，通过拉动连接在吸吮电极管路上的5 mL注射器筒来施加负压。 
		注意：当膈神经成功被吸入吸吮电极时，神经会呈现紧绷状态。打开刺激器，通过切换手动开关一次来刺激膈神经。</li>
		<li>在1 Hz刺激下，通过明场照明目视观察膈肌是否发生收缩。若无收缩，逐步调节电压旋钮以获得超最大刺激脉冲，可通过肌肉收缩的视觉观察进行验证。若仍无可见反应，可用注射器将神经吹出，再次施加负压尝试吸入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭灌注，向溶液中加入肌肉特异性肌球蛋白抑制剂BHC6或电压门控钠通道拮抗剂µ-芋螺毒素8，使其终浓度达到100 µM。
	<ol>
		<li>配制100 µM BHC：取4 µL浓度为200 mM的DMSO储备液，预先稀释于1 mL Krebs-Ringer溶液中。</li>
		<li>从培养皿中移除1 mL Krebs-Ringer溶液。</li>
		<li>将预稀释的BHC加入培养皿中。 
		注意：此预稀释步骤有助于防止未稀释的DMSO在表达GCaMP3的细胞中诱导非瞬时荧光反应。</li>
		<li>等待30分钟后，重新开启新鲜Krebs-Ringer溶液的灌注，持续20–30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备记录电极。
	<ol>
		<li>佩戴手套，将外径（OD）为1 mm、内径（ID）为0.4 mm的含丝硼硅酸盐玻璃毛细管插入微电极拉制仪中，旋紧旋钮将其固定到位，关闭拉制仪门。</li>
		<li>使用P-97拉制仪，设置如下参数：加热值900，拉力120，速度75，时间250，气压500，不添加额外循环。 
		注意：电阻（R）通过放大器的软件控制进行测量：数据采集软件通过求解公式V = IR来确认电阻值。软件控制器向电极施加已知电流（I）（通常为1 nA），并测量电压（V）的变化，从而计算出R值。</li>
		<li>对于胚胎期膈肌，确保电极电阻接近60 MΩ；对于较年长的膈肌，电阻应为10–20 MΩ。用3 M KCl溶液填充记录电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在10倍放大倍率下，使用位于载物台另一侧的第二个显微操作器，将电极缓慢插入肌肉组织中，作为刺激电极。</li>
	<li>使用电生理数据采集软件，等待静息膜电位从0 mV下降至-65 mV或更低。</li>
	<li>以1 Hz频率进行刺激，通过检测是否出现具有适度超射（即电位从-65 mV或更低起始并升至0 mV以上）的大振幅电位，确认肌细胞动作电位的存在。注意不要将刺激伪迹与动作电位混淆。 
	注意：动作电位的持续时间显著长于刺激伪迹（约5 ms）。</li>
</ol>
3. 样品荧光成像
<ol>
	<li>在20倍放大倍数下，通过绿色/黄色光激发（550 nm）观察594-αBTX标记的神经肌肉接头（NMJ），定位肌肉中央的终板带。切换至蓝光激发（470 nm）以成像肌细胞、运动神经元或施万细胞中的Ca2+反应。</li>
	<li>如需要，可设置图像分光器，配备带通滤光片和单边二向色滤光片，用于双波长成像。</li>
	<li>为计算表达GCaMP3/6的组织所呈现的最大荧光强度（Fmax），向膈肌标本中加入12 µL的3 M氯化钾（KCl）6。
	<ol>
		<li>进行实验时，将查找表栏上的亮度条设置为GCaMP3/6表达组织在20倍放大倍数下对KCl无binning响应达到饱和时亮度水平的110%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以每秒20帧的速度进行记录，以确保不遗漏任何快速事件。</li>
	<li>使用负压电极施加1–45秒、20–40 Hz的神经刺激，或通过浴式给药或灌流添加药理学激动剂，同时采集某一细胞亚群的动态荧光Ca2+反应以及静态的594-αBTX标记的NMJ信号。 
	注意：若可在NMJ研究中使用组织特异性的红色或远红光GECI或GEVI小鼠，则可同时采集反映NMJ中两个不同细胞组分的两种动态信号。</li>
	<li>当成像或电生理实验因已获得预期结果而结束时，通过灌流管路灌注清水，并用负压电极反复吸取清水2–3次，以确保盐分不会积聚。</li>
</ol>
4. 基于荧光强度标准差图（SDiu16）的数据导出与分析
<ol>
	<li>将记录的图像序列作为 16 位 TIFF 图像栈进行保存，并将其加载到所需的成像数据分析系统中进行分析。</li>
	<li>在软件的 8d 文件菜单中，选择 Image stack of interest 并点击加载。
	<ol>
		<li>视频加载完成后，浏览时间轴以确定一个无细胞荧光活性的区域。 
		注意：该区域将用于创建背景样本。</li>
		<li>按住 Shift 键，然后在已确定为背景样本的区域中绘制感兴趣区域（ROI）框。</li>
		<li>创建框后，按下 空格键 以生成背景活性变化的曲线图。</li>
		<li>右键单击曲线图，选择 assorted 选项，然后选择 Dump ROI as text，将曲线图导出为 xy 坐标文本文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>返回到目标视频，再次浏览以确定目标活性发生的时间区域。
	<ol>
		<li>使用鼠标中键，在黄色时间框中选择该时间区域。</li>
		<li>右键单击视频，选择 Stack OPS，然后选择 Stat map 选项 5。 
		注意：这将在左侧窗口生成标准差图（SD 图）。</li>
		<li>单击 SD 图，然后连续按 ] 键 19 次，以应用适当的彩色热图。</li>
		<li>右键单击 SD 图，选择 STM load and save，然后选择 Save stm as tiff 以保存 SD 图。</li>
		<li>然后，连续按 [ 键 19 次，恢复为灰度颜色图。</li>
		<li>按下 C 键，然后按下 D 键以调出密度图工具。使用鼠标左键和中键调整阈值，以包含 SD 图中显示的所有荧光活性。</li>
		<li>按下 C 键关闭密度工具，同时保留当前阈值设置。</li>
		<li>再次右键单击 SD 图，选择 STM particles，然后选择 Find PTCLS。 
		注意：这将识别出表达荧光活性的单个细胞。</li>
		<li>再次右键单击 SD 图，选择 Create Particle ROIs。 
		注意：这会将所选细胞叠加到原始目标视频上。</li>
		<li>在按住 Shift 键的同时，右键单击原始视频中任意一个已识别的粒子 ROI。</li>
		<li>选择 ROI Marker 和 Measure Int in ROI。 
		注意：这将为目标视频中每个已识别的 ROI 生成单独的荧光活性曲线图。可通过右键单击任意一条曲线，选择 Assorted，然后选择 Dump ROI as text 来保存这些曲线图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>有关这些操作的详细逻辑，请参见源代码文件9。</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了利用表达GECI的小鼠在完整神经肌肉组织中特定细胞内测量Ca2+反应的一些示例。为了成功实施这些实验，解剖过程中必须避免损伤膈神经。在施万细胞中以低倍或高倍（即，20X或60X）成像Ca2+反应时，必须使用BHC或µ-芋螺毒素来抑制组织运动。在低倍镜下对肌细胞的Ca2+反应进行成像时，可在不使用上述药物的情况下进行测量，从而能够在高频神经刺激期间同时获取肌细胞Ca2+瞬时信号强度和肌肉长度变化6。当在同一标本上进行多个实验时，每次实验之间必须间隔至少15分钟，在此期间可对组织进行灌流。这些步骤使得在同一标本的同一视野中，至少在3至5小时内可重复成像刺激诱导的Ca2+反应。此外，对于溶解于DMSO中的药物，必须按照BHC的处理方法预先稀释，因为将DMSO直接施加到表达GCaMP的组织上会引发不可逆的、与刺激无关的荧光反应。
我们发现，原因尚不明确，Wnt1-Cre; cond...

神经肌肉接头（NMJ）与所有突触一样，由三个部分组成：源自神经元的突触前终末、突触后神经元/效应细胞，以及突触周胶质细胞1,2。尽管突触传递的基本特征最初是在该突触上得到证实的3，但这一过程的许多方面仍不明确，部分原因在于该突触的不同细胞组分表达相同的分子。例如，在脊椎动物NMJ处，运动神经元共同释放嘌呤类腺苷三磷酸（ATP）和乙酰胆碱（ACh），而肌肉细胞、施万细胞和运动神经元均表达这两种物质的受体，这使得对这些物质所引发的任何功能效应（例如，递质释放或反应、肌肉力量产生）的解释变得复杂4。此外，尽管与中枢神经系统中通常具有多个突触输入的神经元相比，NMJ的三部分结构相对简单，但目前尚不清楚运动神经元、肌细胞或施万细胞对刺激的反应是否因其内在异质性（例如，胚胎起源、纤维亚型、形态）而存在差异。为解决上述问题，理想的方法是能够同时追踪同一突触组分内多个细胞的反应，并在同一时间追踪其他两个独立组分中任一组分的此类反应。传统的使用化学染料检测钙信号的方法无法实现这两个目标，因为灌流施加的染料在应用于组织后会被多种细胞类型摄取，而细胞内加载的染料仅可用于观察单个或少量细胞群体。本文通过利用表达基因编码钙离子指示剂（GECIs）的转基因小鼠，结合特定的成像技术和软件工具5，实现了上述两个总体目标中的第一个，并讨论了新增转基因工具将如何帮助实现第二个目标。该技术对于任何希望同时追踪多种细胞群体中钙动力学或其他可通过基因编码光学传感器观察到的细胞信号事件的研究者均具有重要应用价值。

<table><tbody><tr><td>Myf5-Cre 小鼠</td><td>Jax</td><td>#007893</td><td>可在 E13 时期即驱动肌细胞表达&lt;sup class=&quot;xref">6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre 小鼠</td><td>Jax</td><td>#003829</td><td>在 E13 时期驱动所有&amp;nbsp;施万细胞的表达，但在 P20 时期无此作用&lt;sup class=&quot;xref">9&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Sox10-Cre 小鼠</td><td>Jax</td><td>#025807</td><td>在较年长的小鼠中驱动施万细胞表达</td></tr><tr><td>条件性 GCaMP3 小鼠</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>以细胞特异性方式表达 GCaMP3</td></tr><tr><td>条件性 GCaMP6f 小鼠</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>以细胞特异性方式表达 GCaMP6f</td></tr><tr><td>BHC（3-(N-丁基乙亚胺酰基)-4-羟基-2H-香豆素-2-酮）</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>可阻断骨骼肌肌球蛋白，但不影响神经传递&lt;sup class=&quot;xref">6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>CF594-&amp;alpha;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>标记神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体簇</td></tr><tr><td>&amp;micro;-芋螺毒素 GIIIb</td><td>Peptides Int'l</td><td>#CONO20-01000</td><td>阻断 Nav1.4 电压依赖性钠通道&lt;sup class=&quot;xref">8&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>硅胶介电凝胶；又称 Sylgard</td><td>Ellswoth Adhesives</td><td># Sil Dielec Gel .9KG&amp;nbsp;</td><td>可通过细针将膈肌固定于其上</td></tr><tr><td>细针（0.1 mm 直径）</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>将膈肌固定在硅胶介电凝胶上</td></tr><tr><td>Eclipse FN1 直立显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>用于样本的定位与观察</td></tr><tr><td>带手动 XY 显微镜位移器的基本固定显微镜平台&amp;nbsp;</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>实现样本的移动</td></tr><tr><td>手动显微操作器&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>用于固定记录电极和刺激电极&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微电极放大器&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td>实现尖锐电极的细胞内电生理记录</td></tr><tr><td>微电极低噪声数据采集系统</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1550&amp;nbsp;</td><td>实现电生理数据的采集</td></tr><tr><td>微电极数据分析系统</td><td>Molecular Devices</td><td>PCLAMP 10 Standard</td><td>进行电生理数据分析</td></tr><tr><td>方波刺激器</td><td>Grass</td><td>S48</td><td>刺激神经以兴奋肌肉</td></tr><tr><td>刺激隔离单元</td><td>Grass</td><td>PSIU6</td><td>降低&amp;nbsp;刺激伪迹</td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管，外径 1.0 mm，内径 0.5 mm&amp;nbsp;</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>用于刺入并记录神经诱发的肌肉电位</td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管，外径 1.5 mm，内径 1.17 mm&amp;nbsp;</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>经拉长后用作吸吮电极</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97&amp;nbsp;</td><td>拉制并制备记录电极</td></tr><tr><td>1200×1200 像素背照式 cMOS 相机&amp;nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>高灵敏度相机，支持高分辨率、高速成像</td></tr><tr><td>光源</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>提供 LED 照明，用于荧光观察</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;无限远校正荧光浸水物镜，工作距离 2 mm&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>提供较长工作距离，便于样本观察</td></tr><tr><td>带卤素灯的光纤照明器</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>提供明场观察所需的照明</td></tr><tr><td>W-View Gemini 图像分光器&amp;nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>通过二向色镜将一对双波长图像投射至单个相机</td></tr><tr><td>单波段带通滤光片&amp;nbsp;（512/25-25 和 630/92-25）&amp;nbsp;</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>支持双波段成像</td></tr><tr><td>560 nm 单边二向色分光镜</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>作为二向色镜，分离光束以实现双波长成像</td></tr><tr><td>成像数据采集系统</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements - MQS31000</td><td>实现成像数据的采集</td></tr><tr><td>波长控制模块</td><td>Nikon</td><td>MQS41220</td><td>用于成像数据采集的模块</td></tr><tr><td>发射光分光硬件模块&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS41410</td><td>用于成像数据采集的模块</td></tr><tr><td>成像数据分析系统</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D&lt;sup class=&quot;xref">5&lt;/sup&gt;, Fiji</td><td>用于分析荧光强度及其他成像数据</td></tr></tbody></table>

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

组织中细胞的电活动可通过电生理技术进行监测，但这些技术通常仅限于对单个细胞的分析。由于细胞质内钙离子（Ca2+）浓度的升高常常由电活动引起，或响应多种其他刺激而发生，因此可通过使用荧光钙敏感染料标记细胞并进行成像来监测这一过程。&#160; 然而，在完整组织中对特定细胞类型的此类响应进行成像较为困难，因为这些染料会被组织中的所有细胞类型摄取。相比之下，基因编码的钙指示剂（GECIs）可在特定细胞类型中表达，并在细胞内Ca2+浓度升高时产生荧光，从而允许对特定细胞类型的整个细胞群中的Ca2+信号进行成像。本文中，我们将GECIs GCaMP3/6应用于小鼠神经肌肉接头（NMJ），即运动神经元、骨骼肌和终末/突触周施万细胞之间的三元突触结构。我们展示了该技术在经典的ex vivo组织制备中的应用价值。通过使用光学分光器，我们实现了动态Ca2+信号与神经肌肉接头（NMJ）静态标记的双波长成像，该方法可轻松扩展用于同时监测两种细胞特异性的GECI或基因编码的电压指示剂（GEVI）。最后，我们讨论了用于获取荧光强度空间图谱的成像流程。综上所述，这些光学、转基因及分析技术可被广泛应用于多种情境下研究NMJ处不同细胞亚群的生物学活动。

通过细胞内 Ca2+ 浓度升高介导的荧光强度变化的多个实例，展示了该方法在神经肌肉接头（NMJ）特定细胞类型中的应用价值。这些结果以空间荧光强度图的形式呈现，不仅可显示响应细胞的位置，还能反映其响应强度，从而评估有多少细胞对特定刺激产生反应以及每个细胞的反应程度。例如，如图1所示，我们记录了出生后第7天（P7）Wnt1-Cre; 条件性表达GCaMP3 小鼠膈肌神经肌肉接头处终末/突触周施万细胞（TPSCs）群体在膈神经刺激下的 Ca2+ 反应，并利用空间荧光强度图鉴定了响应细胞的亚群。这些荧光强度图以热图形式呈现，并依据“火焰”颜色查找表（Fire CLUT）进行颜色编码。我们在分割图像以同时观察膈肌中部经α-BTX标记的乙酰胆碱受体（AChRs）簇的情况下和未分割图像的情况下均进行了视频记录（视频1 和 视频2），该方法可轻松改进用于同时捕获两种不同细胞类型的动态...

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。

可通过电生理技术监测组织中细胞的电活动，但这些技术通常仅限于分析……

该方法有助于解答神经肌肉领域中的关键问题，例如钙信号在肌肉或施万细胞对神经刺激反应中的作用。该技术的主要优势在于能够对特定细胞类型在神经刺激下的活化过程进行成像观察。首先，获取转基因小鼠，并按照文本方案中详述的方法进行基因型鉴定。安乐死后，使用虹膜剪在肝脏下方、心脏和肺脏上方横切整个动物体。分离并去除肝脏、心脏和肺脏，注意保留足够长度的膈神经，以便将其吸入吸电极中。进一步去除肋骨和脊柱，但保留膈肌周围的一圈细嵴。将膈肌和膈神经样本放入含有荧光标记的α-银环蛇毒素（浓度为每毫升1微克）的克雷布斯-林格溶液的微量离心管中。将标本置于避光条件下，在溶液中孵育10分钟。使用微细针将膈肌固定在直径六厘米、涂有硅胶绝缘凝胶并盛有约八毫升充氧克雷布斯-林格溶液的培养皿中。将培养皿置于显微镜载物台上，随后以每分钟八毫升的速度用更多克雷布斯-林格溶液灌注膈肌，持续30分钟。在四倍放大倍率下，使用显微操作器将吸电极移至左侧膈神经上方。通过拉动连接在吸电极导管上的5毫升注射器的筒身来施加负压。使用明场照明目视观察膈肌是否在1赫兹刺激下发生收缩，以确认刺激反应。 如果未达到，通过逐步调节电压旋钮来调整电压，以获得可由肉眼观察肌肉收缩确认的超最大刺激脉冲。若仍不可见，用注射器向神经吹入液体将其吹出，然后通过施加负压尝试再次将其吸入。现在，关闭灌流系统，加入肌肉特异性的肌球蛋白抑制剂 BHC 或电压门控钠通道拮抗剂 μ-芋螺毒素（mu-conotoxin）。通过移液将4微升二甲基亚砜（DMSO）中200毫摩尔的BHC储备液加入1毫升克雷布斯-林格溶液中，配制BHC预稀释液。从培养皿中移除1毫升克雷布斯-林格溶液，然后将预稀释的BHC加入培养皿中。30分钟后，开启新鲜的Krebs-Ringer溶液灌流，持续20至30分钟。戴上手套，通过将外径为1毫米、内径为0.4毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管放入微电极拉制仪中，制备记录电极。旋紧旋钮以固定玻璃管位置，并关闭拉制仪门。然后按照文本方案中所述设置拉制仪。对于胚胎期膈肌，使用放大器的软件控制功能测量电阻。确保胚胎期膈肌的电阻接近60兆欧，而对于较年长个体的膈肌，电阻应为10至20兆欧。现在，用3摩尔的氯化钾溶液填充记录电极。在10倍放大倍数下，使用位于载物台对侧的第二个显微操作器作为刺激电极，将记录电极缓慢插入肌肉组织中。通过电生理数据采集软件进行监测，直至静息膜电位从0毫伏变化至-65毫伏或更低。以1赫兹频率进行刺激，并通过检查是否存在具有轻微超射的大幅电位来确认肌肉动作电位的存在。注意不要将刺激伪迹与动作电位混淆。在20倍放大下，通过在黄绿光激发下观察荧光标记的α-银环蛇毒素神经肌肉接头，定位肌肉中心的终板带。切换至蓝光激发以成像肌肉、运动神经元或施万细胞中的钙反应。本示例中，GCaMP3在肌细胞中表达。如需要，可使用带通滤光片和单边二向色滤光片设置图像分光器，以实现双波长成像。将查找表栏上的亮度条设置为基因编码钙指示剂组织在氯化钾刺激下、20倍放大未 binning 时达到饱和状态的110%，并在此条件下进行实验。以每秒20帧的速度进行记录，以确保不遗漏任何快速事件。使用吸吮电极传递一串脉冲，以每秒20至40赫兹的频率对神经进行1至45秒的刺激，同时采集一种细胞亚型的动态荧光钙反应信号，以及静态荧光标记的α-银环蛇毒素神经肌肉接头信号。药理学激动剂也可通过浴式给药或灌流方式加入，动态的荧光钙信号响应可采用相同方法采集。当成像或电生理实验因已获得预期结果而结束时，需通过灌流管路灌注清水，并用吸液电极反复吸取清水两到三次，以确保盐分不会积聚。对出生后第七天的Wnt1-GCaMP3小鼠膈肌进行膈神经刺激后，施万细胞钙响应的空间图谱显示，该响应局限于神经肌肉接头处的终末旁突触施万细胞。同一膈肌在使用荧光标记的α-银环蛇毒素染色后成像，该毒素可结合神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体。同一膈肌还在明场照明下成像，以引导记录电极至神经肌肉接头附近的肌肉突触后区域。图中显示了用于分析单个钙瞬变的、以颜色编码的细胞或感兴趣区域的空间划分。在存在肌球蛋白抑制剂 BHC 的情况下，对出生后第4天（P4）表达 mth 5 GCaMP3 的小鼠膈肌进行膈神经刺激，其肌细胞钙反应的空间图谱显示，所有膈肌细胞的整个区域均出现钙反应。相比之下，在存在μ-芋螺毒素（mu-conotoxin）的情况下对同一膈肌进行刺激，则仅在所有膈肌细胞的内侧区域出现空间受限的钙反应，该区域对应于富含乙酰胆碱受体簇的终板带。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如免疫组织化学或免疫印迹，以回答更多问题，例如：通过电生理学或钙成像鉴定出的细胞具有怎样的分子特征？该方法可用于研究正常新生小鼠中施万细胞和肌细胞对神经刺激的群体反应，也可应用于对较大小鼠或表达与神经肌肉疾病相关蛋白的小鼠的研究。

ex-vivo-imaging-cell-specific-calcium-signaling-at-tripartite-synapse

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

前体小鼠膈肌三方突触细胞特异性钙信号的影像学研究

来源： Heredia, D. J., et. al. 小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号的离体成像。J. Vis. Exp. (2018)...

转基因小鼠膈肌神经肌肉接头处钙动力学的荧光成像

来源：Shannonhouse, J., 等. 活体背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像. 《视觉化实验杂志》...

小鼠完整背根神经节中神经元集群的活体钙成像

来源： Fried, D. E., Gulbransen, B. D. 肠神经系统原位 Ca2+ 成像. J. Vis. Exp.

小鼠结肠肌间神经丛中肠神经元与胶质细胞活动的钙成像

来源： Ishimoto, H. et. al.,利用离体钙成像技术可视化果蝇脑对内分泌信号的响应。J. Vis. Exp. (2018)...

离体钙成像研究Drosophila脑对神经肽的反应

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca2+指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP3介导的局部Ca2+事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。...

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

本文描述了一种实验方案 离体 钙成像 果蝇...

离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

本文介绍了一种用于成像和定量分析异质性细胞群体（如胰岛细胞）中钙动力学的实验方案。将荧光报告分子递送至胰岛外周层细胞，随后对胰岛进行固定并成像，进而对单个细胞的荧光强度动力学进行分析。...

小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像

本方案描述了制备一个大型（6 x 3 mm）2) 使用食品保鲜膜、透明硅胶和盖玻片制作颅窗。该颅窗可允许 体内...

体内 宽场与双光子钙成像技术在小鼠大颅窗中的应用

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体...

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

我们介绍了利用表面组织粘合剂固定样品，对Drosophila幼虫嗅觉神经元进行钙成像的实验方案。该方法提高了实验稳定性，有助于开展可靠的活体（in-vivo）和离体（ex-vivo）实验。通过定制的R语言脚本分析钙信号，为深入的神经生理学研究提供了高效平台。...

体内与离体条件下对三龄Drosophila melanogaster幼虫嗅觉环路神经元的钙成像

探索小鼠神经肌肉接头处特定细胞群体的钙信号成像方法，用于研究神经刺激期间肌肉与施万细胞的钙动态变化。该技术可实时观察细胞激活过程，为神经肌肉传递机制提供重要见解。

离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

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