Name: 在小鼠和大鼠中确认青春期发作和执行生育力测定生殖能力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 了解如何通过无创技术评估小鼠和大鼠的青春期发作，包括包皮分离和阴道开口等生理标志。该方法为研究生殖能力提供了可靠的动物模型基础。

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感谢为本出版物奠定基础的初始研究工作做出贡献的作者们。感谢 Aitor Aguirre、Genevieve E. Ryan 和 Erica L. Schoeller 在手稿准备过程中提供的帮助。感谢 Jessica Sora Lee 和 Austin Chin 在手稿技术方面提供的协助。H.M.H. 的研究得到了尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health）的支持。 &amp;#38; 美国国立卫生研究院人类发展研究所，资助编号 R00HD084759。

本文所述所有方法均经密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会批准，并依照《实验动物护理与使用指南》进行操作。
1. 确定青春期起始
<ol>
	<li>遵循机构关于着装的规定，至少必须穿戴洁净的实验服和洁净的手套。始终佩戴洁净手套操作小鼠。</li>
	<li>通过在桌面上放置垫子来准备操作区域。
	<ol>
		<li>将一个洁净的小鼠笼盖网格面朝上放置在垫子上。</li>
		<li>在操作区域设置一台天平。将一个洁净的 500–1000 mL 烧杯放在天平上并归零。</li>
		<li>在操作区域旁放置一张记录表，用于记录体重以及包皮分离、阴道开口或首次动情期情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定参与研究的小鼠个体。每日检查青春期启动情况，直至达到青春期。在整个研究过程中，每天应在相同时间进行检查。青春期启动最早可发生在出生后第 11–12 天19，但在大多数实验设置中，青春期启动的监测通常从约 22 日龄开始。</li>
	<li>将小鼠笼子置于操作区域（步骤 1.2）。打开笼子，将笼盖、水瓶和食槽放在桌面上。</li>
	<li>确定雄性小鼠的包皮分离情况。
	<ol>
		<li>抓住小鼠尾巴，将其放置在步骤 1.2.1 中准备好的洁净笼盖上。轻轻握住尾巴，让小鼠在笼盖网格上自由探索约 5 秒。</li>
		<li>轻轻向后拉尾巴，通常会使动物前移并用前肢抓住网格。将另一只手靠近其颈部和耳部附近的皮肤。</li>
		<li>用拇指和食指捏住肩部与颈部之间的松弛皮肤。重要的是要牢固地抓住皮肤，以防止小鼠转头咬人。</li>
		<li>用其余手指抓住背部皮肤，并用手掌压紧固定。抓握时应稳固，但不得阻碍呼吸、血流，或损伤骨骼、肌肉或皮肤。翻转手掌以暴露小鼠腹部，同时用手掌支撑其背部。</li>
		<li>用空闲的手轻轻向后推挤阴茎周围的皮肤，不要强行操作。当发生包皮分离时，包皮会向后滑动，露出glans penis（图 2A，箭头所示为包皮分离）。记录包皮分离的存在与否。</li>
		<li>将小鼠轻轻放入步骤 1.2.2 中的 500–1000 mL 烧杯中称重，并记录体重。</li>
		<li>将烧杯置于饲养笼上方 0–2 cm 处，缓慢倾倒，使小鼠自行离开烧杯并返回笼中。用清水和温和洗涤剂清洗烧杯，干燥后放回天平并重新归零。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定雌性小鼠的阴道开口情况。
	<ol>
		<li>在操作区域（步骤 1.2）放置一个棉球、一个烧杯和一瓶无菌水。将水倒入烧杯中。用无菌水润湿棉球，并将其放置在步骤 1.2.1 的笼盖旁。</li>
		<li>将小鼠笼置于操作区域（步骤 1.2），通过抓住尾根部将小鼠从家中笼转移到笼盖（步骤 1.2.1）上。轻轻向后拉尾巴，促使小鼠向前移动。</li>
		<li>抬起尾巴，同时用空闲的手指支撑髋部。让后肢保持与笼盖接触。如果小鼠活动过多，可按照步骤 1.5.1–1.5.4 所述用手固定。</li>
		<li>用步骤 1.6.1 中润湿的棉球轻轻清洁外阴。每只小鼠使用一个新的湿润棉球。为判断阴道是否完全开放，需检查外阴并确认阴道是否已完全张开（图 2A，雌性阴道开口）。</li>
		<li>记录是否发生阴道开口。按照步骤 1.5.6–1.5.7 所述称重并将小鼠放回家中笼。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>首次动情期作为首次排卵的指标。
	<ol>
		<li>在操作区域（步骤 1.2）放置一个装有无菌水的烧杯、一张标记好的玻璃载玻片，以及一支配有洁净吸头的 200 µL 移液器。</li>
		<li>按照步骤 1.6.2–1.6.3 所述方式握住雌性小鼠。将含有约 50 µL 无菌水的移液器尖端置于阴道开口处。</li>
		<li>通过注入并重新吸取约 50 µL 水 2–4 次，轻柔冲洗阴道壁细胞。将移液器尖端内容物涂抹在标记好的显微镜载玻片上。</li>
		<li>使用明场显微镜在 10X 或 20X 物镜下仔细观察细胞形态，或让涂片在空气中干燥约 1 小时，然后用 0.1% 亚甲蓝溶液（溶于 ddH2O）复染（图 2B）。复染时，将干燥的载玻片浸入 0.1% 亚甲蓝溶液中约 30 秒，随后让其在空气中干燥 1 小时。</li>
		<li>在明场显微镜下以 10X 或 20X 观察步骤 1.7.4 的载玻片。通过观察细胞形态确定动情周期阶段（图 2B）20，从而区分动情周期的四个不同阶段（图 2B）。 
		注：动情后期（metestrus）特征为角化鳞状上皮细胞与白细胞的混合物，动情间期（diestrus）以白细胞为主，动情前期（proestrus）为白细胞与有核上皮细胞的混合物，而动情期（estrus）则以角化上皮细胞为主（图 2B）20。</li>
		<li>记录体重，并按照步骤 1.5.6–1.5.7 所述将小鼠放回家中笼。在小鼠出现首次动情期当天停止阴道涂片检查（图 2B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 理想的繁育室条件
<ol>
	<li>确保繁育室的温度为 ~20–24 °C，湿度为 55 ± 10%，距地面约 1 m 处的均匀室光照强度约为 300–400 lux21。此光照强度可使笼子中部达到理想的光照强度 25–80 lux。检测光照强度时，应使用照度计。</li>
	<li>使用自动化系统控制繁育室的照明，以确保整个实验过程中照明时间的准确性。评估啮齿类动物生育力的最佳光照周期条件包括 12 小时光照（12 小时光照和 12 小时黑暗，LD12:12），以及“夏季样”条件，即 14 小时光照和 10 小时黑暗（LD14:10）21。</li>
	<li>准备繁育笼具。
	<ol>
		<li>为每对繁育小鼠准备一个带盖的清洁小鼠笼，提供水、食物、垫料和筑巢材料。</li>
		<li>填写笼卡，注明所有必要信息，包括性别、出生日期、小鼠品系以及配对交配设置的日期。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生育力研究
<ol>
	<li>确定用于生育力研究的动物。确保动物已达到性成熟（步骤 1）。在小鼠中开展生育力研究时，通常选用 10–16 周龄的动物，此年龄段在大多数实验条件下已完成性成熟。</li>
	<li>在清洁的桌面上放置步骤 2.3 中准备好的繁殖笼。</li>
	<li>捕捉并固定小鼠。
	<ol>
		<li>将戴手套的手缓慢伸入小鼠笼内。将手留在笼中一段时间（约 5–30 秒），使小鼠适应手套和手的气味。避免剧烈或突然的动作。</li>
		<li>将手掌呈杯状靠近笼底，并缓慢接近小鼠。小鼠会逃跑，当其跑过手部时，用拇指和食指夹住其中一只小鼠的尾巴。</li>
		<li>通过尾巴将小鼠提起 2–3 秒。若需更长时间固定，应继续握住尾巴，并将小鼠置于杯状的手掌中，同时保持对尾巴的控制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过握住尾巴的方式，先将 1 只雄性小鼠，随后将 1 只雌性小鼠转移至繁殖笼中（步骤 3.3）。设置生育力检测时，应确保雌性小鼠处于相同的动情周期阶段。通过阴道涂片法确定雌性小鼠的动情周期阶段，方法见步骤 1.7。</li>
	<li>关闭笼盖，并确保小鼠有充足的食物、饮水和筑巢材料。将笼卡插入笼卡架，并固定在笼子上。</li>
	<li>将繁殖笼放置于动物饲养架上。在整个生育力研究期间，应尽可能减少对繁殖笼的干扰。生育力研究持续 30 天。对每对繁殖小鼠应详细记录以下信息：1）配对日期；2）产仔日期；3）产仔数量，包括活仔和死仔。在整个研究期间每日进行产仔检查。</li>
	<li>若在步骤 3.6 中未观察到或仅观察到较弱的生育力影响，可将生育力研究延长额外 30–60 天。</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+balance+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Energy balance and reproduction.</a> Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).</li>
<li>Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+photoperiod+on+hormones%2C+behavior%2C+and+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function.</a> Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).</li>
<li>Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+population+of+hypothalamic+neurons+govern+fertility%3A+the+critical+role+of+VAX1+in+GnRH+neuron+development+and+fertility+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+communications%22%5BJournal%5D)">A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance.</a> Neuroscience communications. 2, (2016).</li>
<li>Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differentiation+and+the+Kiss1+system%3A+Hormonal+and+developmental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations.</a> Peptides. , (2009).</li>
<li>Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronson%2C+FH+%22Reproduction%22">Reproduction</a>. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).</li>
<li>Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+onset+of+reproductive+function+in+normal+female+mice+treated+with+leptin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin.</a> Science. , (1997).</li>
<li>Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/tox/18/3/18_3_141/_article/-char/ja/">Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals.</a> J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).</li>
<li>Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+accelerates+the+onset+of+puberty+in+normal+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).</li>
<li>Bohlen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-day+photoperiod+delays+the+timing+of+puberty+in+female+mice+via+changes+in+the+kisspeptin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system.</a> Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li>
<li>Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hypothalamic+GPR54+signaling%3A+A+potential+mechanism+for+initiation+of+puberty+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).</li>
<li>Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+population+of+hypothalamic+neurons+govern+fertility%3A+the+critical+role+of+VAX1+in+GnRH+neuron+development+and+fertility+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+communications%22%5BJournal%5D)">A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance.</a> Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).</li>
<li>Navarro, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Neurokinin+B+in+the+Control+of+Female+Puberty+and+Its+Modulation+by+Metabolic+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status.</a> Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).</li>
<li>Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygous+deletion+of+ventral+anterior+homeobox+%28Vax1%29+causes+subfertility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice.</a> Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).</li>
<li>Kauffman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kisspeptin+Receptor+GPR54+Is+Required+for+Sexual+Differentiation+of+the+Brain+and+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).</li>
<li>Teles, M. G., et al. <a target="_blank" href="https://miami.pure.elsevier.com/en/publications/brief-report-a-gpr54-activating-mutation-in-a-patient-with-centra">Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty.</a> New England Journal of Medicine. , (2008).</li>
<li>Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preputial+separation+as+an+external+sign+of+pubertal+development+in+the+male+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat.</a> Biology of reproduction. , (1977).</li>
<li>Gaytan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+method+for+precise+dating+of+female+puberty+in+laboratory+rodents%3A+The+puberty+ovarian+maturation+score+%28Pub-Score%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score).</a> Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).</li>
<li>Caligioni, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19575469">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+completion+of+puberty+in+female+mice+depend+on+estrogen+receptor+-signaling+in+kisspeptin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+Vaginal+Lavage%2C+Crystal+Violet+Staining%2C+and+Vaginal+Cytological+Evaluation+for+Mouse+Estrous+Cycle+Staging+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).</li>
<li>Hedrich, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHedrich%2C+H+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Vax1+from+Gonadotropin-Releasing+Hormone+%28GnRH%29+Neurons+Abolishes+GnRH+Expression+and+Leads+to+Hypogonadism+and+Infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility.</a> Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).</li>
<li>Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postnatal+nutritional+histories+influence+reproductive+maturation+and+ovarian+function+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat.</a> PLoS ONE. , (2009).</li>
<li>Manual, R. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Breeding+Strategies+for+Maintaining+Colonies+of+Laboratory+Mice&btnG=">Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice.</a> Management. , (2007).</li>
<li>Kennedy, G. C., Mitra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+weight+and+food+intake+as+initiating+factors+for+puberty+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat.</a> The Journal of Physiology. , (1963).</li>
<li>Sisk, C. L., Foster, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+basis+of+puberty+and+adolescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural basis of puberty and adolescence.</a> Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).</li>
<li>Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+influences+on+the+timing+of+puberty+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Genetic influences on the timing of puberty in mice.</a> Biology of reproduction. , (1990).</li>
<li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL%2F6J+mice%3A+I.+Cycle+frequency%2C+length+and+vaginal+cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biology of reproduction. , (1982).</li>
<li>Falconer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weight+and+age+at+puberty+in+female+and+male+mice+of+strains+selected+for+large+and+small+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22Genetical+Research%22%5BJournal%5D)">Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size.</a> Genetical Research. , (1984).</li>
<li>Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+vaginal+opening+is+an+apoptosis-dependent+process+which+can+be+prevented+by+the+overexpression+of+Bcl2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2.</a> Developmental Biology. , (1997).</li>
<li>Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091302214000752">Epigenetic regulation of female puberty.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).</li>
<li>Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+serum+luteinizing+hormone%2C+follicle+stimulating+hormone+and+androgen+levels+in+males+of+two+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains.</a> Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).</li>
<li>Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+Dysregulation+and+Infertility+in+Mice+Lacking+the+Homeodomain+Protein+Six6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6.</a> Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).</li>
<li>Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+yield+and+composition+in+mice%3A+Effects+of+litter+size+and+lactation+number%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+--+Part+A%3A+Physiology%22%5BJournal%5D)">Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number.</a> Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).</li>
<li>Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+litter+size+on+the+postnatal+growth+of+rat+pups%3A+is+there+a+rationale+for+litter-size+standardization+in+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+research%22%5BJournal%5D)">Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies.</a> Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).</li>
<li>Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploinsufficiency+of+SIX3+Abolishes+Male+Reproductive+Behavior+Through+Disrupted+Olfactory+Development%2C+and+Impairs+Female+Fertility+Through+Disrupted+GnRH+Neuron+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration.</a> Molecular Neurobiology. , (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠的整体健康状况对于成功进行生育力检测至关重要21。在进行生育力检测时，应避免每天对小鼠进行直接的身体检查，因为这可能会引起应激反应。同时应避免频繁更换笼具，因为这同样会造成应激。理想情况下，每周更换笼具不应超过1-2次。在黑暗阶段暴露于光照会负面影响夜行性啮齿动物的繁殖行为。在黑暗时段内不得打开繁殖室的照明灯。如果必须在黑暗时段进入房间，请使用微弱的红光照明。另一个应激源是动物房在研究期间全部或部分时间内存在过强的气味、振动或噪音。为减轻应激、改善小鼠福利和繁殖表现，可为小鼠提供筑巢材料或其他类型的环境丰富化物品。筑巢是小鼠的重要行为，有助于提高繁殖成功率。巢穴还可为小鼠提供藏身和玩耍的空间。健康且营养充足的动物繁殖能力良好，因此必须提供高质量的食物和饮水，并保证自由摄取（ad libitum）。如果繁殖配对的小鼠开始出现疾病症状，例如皮炎（在C57BL/6J小鼠中较为常见）、牙齿咬合不正或其他病症，应将这些小鼠排除出研究。此外，若研究使用免疫缺陷小鼠，则保持小鼠饲养室的清洁对维持其生育力尤为关键。
为了恰当地开...

青春期的过渡是达到性成熟和生殖能力所必需的过程。青春期的转变以及成年期生育能力的维持由生殖轴调控，该轴也称为下丘脑-垂体-性腺轴（图1）。青春期启动时间及生育能力的维持受到内在因素和环境因素的严格调控，以提高子代和亲代的生存机会1,2。本方案提供了一种非侵入性方法，用于确定小鼠和大鼠青春期的启动，以便在开展评估生殖能力的生育研究之前确认其性成熟状态。
在性成熟动物中进行生育力研究，且可在动物经历青春期后开始。在青春期开始之前，生殖轴处于静止状态，而驱动性成熟的關鍵激素——促性腺激素释放激素（GnRH）——向垂体的释放量不足以启动青春期（图1）。青春期的启动是一个复杂的过程，其结果是在正中隆起处GnRH的释放增加。GnRH促进垂体分泌黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），这两种激素对性腺的成熟和生殖功能至关重要（图1）3,4,5。
生殖轴受损会导致生育力下降，并可能提前或推迟青春期的启动。已知会影响青春期启动时间和生殖功能的条件包括接触内分泌干扰化学物6,7、体重增加或减少1,8、日照长度变化2,9以及基因突变10,11,12,13,14,15。
性成熟期的开始是进行生育力检测前必须完成的关键步骤。通过包皮分离、阴道开口和首次动情期来确定青春期的开始，其优点在于这些方法具有非侵入性，无需采集血液或牺牲实验动物16,17。
确定青春期开始后，正确设置生育力研究将提供有关生殖轴完整性的关键信息，通常还具有第二个优势，即可产生用于后续研究的实验动物（优化）18。本方案中描述的生育力研究设置能够检测雄性和雌性个体生殖能力的轻度及重度缺陷。评估的关键参数包括：1）首胎所需时间，2）在特定时间范围内产生的胎仔数，以及3）每窝仔鼠数量。最后，本文还提供了可用于确定生育力障碍原因的后续研究类型的建议。
所述方案涉及小鼠，代表性数据反映的是在转基因小鼠中进行的工作。然而，所有包含的方案在大鼠中同样适用。

<table><tbody><tr><td>无菌棉球</td><td>Fisher</td><td>22456885</td><td></td></tr><tr><td>表面保护剂</td><td>Fisher</td><td>1420637</td><td></td></tr><tr><td>光度计</td><td>VWR</td><td>21800-014</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Optimouse 笼架及笼盒</td><td>动物护理系统</td><td>C89100</td><td></td></tr><tr><td>水瓶篮&amp;nbsp;</td><td>动物护理系统</td><td>C61011</td><td></td></tr><tr><td>过滤笼盖</td><td>动物护理系统</td><td>C78210</td><td></td></tr><tr><td>优化标准饲养层</td><td>动物护理系统</td><td>C40100SG</td><td></td></tr><tr><td>笼卡架</td><td>动物护理系统</td><td>C43251</td><td></td></tr><tr><td>笼位卡</td><td>动物护理系统</td><td>M52010</td><td></td></tr><tr><td>瓶组件</td><td>动物护理系统</td><td>C79122P</td><td></td></tr><tr><td>Bed R'Nest 巢穴</td><td>The Andersons</td><td>BRN4WSR</td><td></td></tr><tr><td>1/8&quot; 玉米芯垫料&amp;nbsp;</td><td>安德森斯</td><td>8B</td><td></td></tr><tr><td>标准小鼠饲料</td><td>Teklad</td><td>7904 (7004)</td><td></td></tr><tr><td>量程</td><td>VWR</td><td>10205-004</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯烧杯</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td></td></tr></tbody></table>

通过确认小鼠和大鼠青春期启动及进行生育力检测来评估生殖能力

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

评估生殖能力对于理解某种处理或基因操作对生殖轴（也称为下丘脑-垂体-性腺轴）的影响至关重要。生殖轴是整合环境和内部信号以将生育力调节至适宜繁殖条件的关键系统。在开展小鼠和大鼠的生育力研究之前，需评估其性成熟状态，以排除所观察到的生殖表型是由青春期启动延迟或缺失所致的可能性。本方案描述了一种非侵入性方法，通过包皮分离的确定来评估雄性动物青春期的启动，通过阴道开口和首次动情期来评估雌性动物青春期的启动。在确认青春期已完成并达到性成熟后，即可开始生育力研究。该操作流程介绍了小鼠和大鼠最佳的繁殖条件、如何建立生育力研究实验，以及应评估哪些参数，以确定处理因素或基因敲除是否对生育力产生影响。

本研究结果来自两种不同的转基因小鼠模型，其中转录因子腹侧前部同源框1（Vax1）在一个等位基因上全身性敲除，此处称为杂合子小鼠（HET）13，或在促性腺激素释放激素（GnRH）神经元中条件性敲除Vax122，此处称为条件性敲除（cKO）。在开展生育力研究之前，必须确认所有小鼠均已进入青春期。
首先，确定阴道开口和包皮分离的日期及体重。在 HET 小鼠中，阴道开口和包皮分离的发生年龄和体重与对照组小鼠相同（图 3A 和 F，而cKO雌性和雄性小鼠的阴道开口和包皮分离时间则显著延迟，并伴随体重增加（图3B 和 G，分别）。青春期的启动在一定程...

许多治疗方法和基因突变会影响性成熟和生育能力的时间。本方案描述了一种非侵入性方法，用于在性成熟动物中开展生育力研究之前，评估小鼠和大鼠的青春期起始时间。

评估生殖能力对于理解治疗或基因操作对生殖轴的影响至关重要，也……

该方法有助于解答生殖领域中的关键问题，例如如何通过包皮分离、阴道开口以及首次动情周期的确定来判断小鼠和大鼠的青春期起始时间，从而在开展生育力研究之前建立可靠的性成熟指标。该技术的主要优势在于，通过采用文中所示的非侵入性方法确定青春期起始，可对已达到性成熟的动物进行后续跟踪并开展生育力研究。该技术的应用意义延伸至生殖功能障碍的诊断，可用于评估由基因突变或可能影响生殖能力的处理因素（如内分泌干扰物）所导致的生殖缺陷。尽管该方法可用于评估小鼠的生殖能力，也可应用于其他模式系统，如大鼠和仓鼠。该方法的可视化演示至关重要，因其需要熟练而精细的动物操作技能。正确固定小鼠对于后续清晰识别包皮分离和阴道开口尤为关键。准备操作区域时，先在桌面上放置一个垫子。然后将一个干净的小鼠笼盖放在垫子上，网格面朝上。接着，在操作区域内放置一台天平。将一个洁净的 500 至 1000 毫升烧杯放在天平上归零。然后在工作区旁边放置一张纸以记录数据。之后，将小鼠笼具放入工作区。打开笼子，将笼盖、水瓶和食盒取下并放在桌面上。用手抓住小鼠尾巴，将其放置在干净的笼盖网格上。在持续握住尾巴的同时，让小鼠在笼盖的网格上自由探索。轻轻向后拉住小鼠尾巴，另一只手靠近其颈部和耳部附近的皮肤。用拇指和食指捏住肩部与颈部之间的松弛皮肤，然后用其余手指抓住背部皮肤，并将小鼠轻压在手掌中固定。用另一只手轻轻将阴茎周围的皮肤向后推。在包皮分离时，包皮会向后滑动，露出阴茎头。检查完毕后，记录是否存在包皮分离现象。此后，称量小鼠并记录其体重。然后将烧杯置于笼底上方，让小鼠自行离开烧杯，重新放回饲养笼中。在工作区域放置一个棉球、一个大烧杯和一瓶无菌水。将无菌水倒入烧杯中。然后，用烧杯中的无菌水润湿棉球，并将其放置在洁净的笼盖旁。将小鼠笼子放在工作区域。然后抓住小鼠尾根部，将其转移到笼盖上。轻轻牵拉小鼠尾巴，以促使其向前移动。随后，在用三根手指托住其臀部的同时，将尾巴提起。用湿润的棉球轻轻清洁外阴，然后检查外阴，确定阴道是否完全张开。记录阴道开口是否已经发生。随后称量小鼠体重，并将其放回原饲养笼中。为每对繁殖小鼠准备一个干净的鼠笼，包括笼盖、水、食物、垫料和筑巢材料。然后在笼卡上填写必要的信息。将准备好的垫料笼放在干净的桌面上，接着缓慢将戴着手套的手伸入鼠笼中，并在笼内停留一段时间。用戴着手套的手缓慢接近小鼠。当小鼠爬过手时，用拇指和食指夹住其中一只小鼠的尾巴，然后提起小鼠。小鼠可仅由尾巴提起，身体无需支撑，持续时间可达两到三秒。将小鼠放入准备好的繁殖笼中，确保雄性和雌性小鼠均有食物、水和筑巢材料后，关闭笼子。采用所述方法，研究了两种不同的转基因小鼠模型。杂合子小鼠与对照小鼠的阴道开口和包皮分离均在同一日龄和体重时发生。相反，条件性敲除雌性和雄性小鼠的阴道开口和包皮分离时间显著延迟，并伴随体重增加。在4.5周龄时，对照组雌性小鼠与条件性敲除小鼠的体重相当，而条件性敲除雄性小鼠的体重略高于对照组。这表明条件性敲除小鼠阴道开口和包皮分离的延迟与体重增长的延迟无关。在青春期启动完成后，于10至16周龄开始进行生育力研究。雄性和雌性杂合子小鼠均表现为亚生育能力。在为期三个月的研究中，杂合子雌性小鼠产仔窝数较少，且雄性和雌性杂合子小鼠所产每窝仔鼠数量均减少。为了说明在开展生育力检测前确认青春期启动的重要性，本研究对条件性基因敲除小鼠的生殖能力进行了评估。在为期70天的生育力研究中，条件性基因敲除的雄性和雌性小鼠均未产生任何窝仔。在实施该操作时，重要的是要注意轻柔地处理小鼠，并在接近和操作动物时保持冷静。完成此操作后，还可采用其他方法，如检测循环性激素水平，以回答更多问题，例如不孕或亚临床不孕是否由睾酮、雌激素、促卵泡激素和黄体生成素水平异常所致。请注意，由于存在被咬伤以及发生过敏反应的风险，操作小鼠可能存在一定危险。为减少暴露风险，在进行该操作时，应始终采取佩戴手套和实验服、小心操作小鼠等预防措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在小鼠和大鼠中确认青春期发作和执行生育力测定生殖能力

本文介绍了如何通过简单、非侵入性地采集小鼠阴道涂片样本并进行细胞学评估，来判断小鼠生殖周期的阶段（动情前期、动情期、动情后期或动情间期）。我们进一步阐述了阴道细胞学变化如何反映驱动小鼠生殖周期各阶段转变的循环激素水平。...

执行阴道灌洗、结晶紫染色及阴道细胞学评估以鉴定小鼠动情周期分期

精液液化是精子从精液凝胶中释放出来的必要条件。本研究提供了从雌性生殖道在交配后收集精液以及测定精液液化时间的操作步骤。...

从小鼠雌性生殖道收集交配后精液并测定精液液化

我们描述了一种具有多囊卵巢综合征样特征的精瘦型小鼠模型的建立过程 二氢睾酮缓释颗粒用于研究多囊卵巢综合征的病理生理学及其子代特征...

一种用于研究多囊卵巢综合征的高雄激素小鼠模型

子宫收缩对女性健康至关重要。然而，病理性增强的收缩力可能导致痛经，尤其是在年轻女性中。本文介绍一种简单的离体实验方法，可用于快速评估平滑肌松弛剂治疗痛经的疗效。...

离体评估小鼠生殖道自发性运动的方法及基于MATLAB的子宫运动追踪算法用于数据分析

本文介绍了如何在雄性小鼠中进行性行为测试。...

雄性小鼠交配行为评估

在本实验方案中，我们描述了对与先天性心脏缺陷相关的小鼠发育表型进行定性和定量分析的步骤。...

利用定性和定量组织学方法分析小鼠胚胎中的先天性心脏缺陷

本研究详细阐述了涉及雌性大鼠的实验设计中需要考虑的关键因素。从更广泛的意义上讲，这些数据有助于减少偏见，并推动开发更具包容性的诊断和干预工具。...

利用阴道灌洗法监测啮齿类动物动情周期：并不存在所谓的正常周期

本文介绍的宫颈操作方法可诱导小鼠假孕，无需使用输精管结扎雄鼠与雌鼠交配。假孕的诱导对于非手术胚胎移植和非手术人工授精的成功至关重要，这两种技术在本文中均有介绍。...

无需使用输精管结扎雄鼠诱导雌鼠假孕以进行非手术胚胎移植或人工授精

本文介绍了一种在小鼠中进行圆头精子细胞注射（ROSI）的方法，该技术具有潜在的临床应用价值，并可用于研究胚胎发育背后的机制。...

小鼠圆头精子细胞注射

安全且人道地操作实验啮齿类动物需要掌握基本的抓取与固定方法。本文将介绍安全抓取小鼠和大鼠并有效给予化合物所需的基本原则。...

小鼠和大鼠的手动保定及常用化合物给药途径

了解如何通过无创技术评估小鼠和大鼠的青春期发作，包括包皮分离和阴道开口等生理标志。该方法为研究生殖能力提供了可靠的动物模型基础。

通过确认小鼠和大鼠青春期启动及进行生育力检测来评估生殖能力

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