Name: 双光子活体显微镜感病毒感染时气管黏膜的影像细胞相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习双光子活体显微镜技术用于研究流感病毒感染小鼠气管黏膜中的免疫细胞动态。该方法可实时观察中性粒细胞与树突状细胞的相互作用，为呼吸道免疫应答研究提供重要工具。

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本工作由瑞士国家基金会（SNF）资助（资助号：176124、145038 和 148183）、欧盟委员会玛丽·居里返岗资助（612742）以及 SystemsX.ch 对 D.U.P. 的资助（2013/124）支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本研究提供了一项详细的实验方案，用于生成4D图像，以展示在流感病毒感染的小鼠气管中，过继转移的中性粒细胞的迁移过程及其与树突状细胞（DC）的相互作用。所述的双光子活体显微镜（2P-IVM）模型将有助于研究呼吸道感染过程中免疫细胞的动态行为。
近年来，已开发出多种基于气道内细胞动态可视化研究的模型9,10,11,12,13,14,15,16。然而，考虑到肺脏的解剖位置以及在呼吸周期中难以有效控制运动等因素，肺部的体内成像仍然具有挑战性<s...

双光子活体显微技术（2P-IVM）是一种用于实时成像细胞间相互作用的有效方法，可在细胞所处的自然环境中直接观察其动态过程1。该方法的主要优势之一在于，与其他传统成像技术相比，它能够对更深层的组织样本（500 µm 至 1 mm）进行观测2。同时，双光子激光产生的两个低能量光子可最大限度地减少成像过程中通常伴随发生的组织光损伤2。在过去十年中，2P-IVM 已被应用于多个研究领域，以探索不同类型的细胞间相互作用3,4,5。这些研究在免疫细胞的观察中尤为关键，因为免疫细胞具有高度动态性，并会根据其他细胞及环境信号迅速形成显著的细胞接触。此外，2P-IVM 也被用于研究病原体与宿主之间的相互作用6。已有研究证实，某些病原体能够改变免疫细胞之间接触的类型和持续时间，从而干扰免疫应答7。
气道黏膜是针对空气传播病原体产生免疫反应的初始部位8。因此，对该组织中病原体与宿主相互作用进行体内分析，对于理解感染过程中宿主防御机制的启动至关重要。然而，气道的双光子活体显微成像（2P-IVM）具有较大挑战性，主要原因是动物呼吸周期所引起的成像伪影，会影响图像采集过程。近年来，已有多种手术模型被用于小鼠气管9,10,11,12和肺组织13,14,15,16的成像研究。气管2P-IVM模型是观察上呼吸道免疫反应初期阶段的理想体系，而肺泡2P-IVM模型则更适用于研究感染的后期阶段。已建立的肺部成像模型存在一个局限性，即充满空气的肺泡会限制激光的光学穿透深度，导致肺内气道的黏膜层无法进行体内成像17。相比之下，气管由连续的上皮构成，其结构更有利于图像采集。
本文介绍了一种实验方案，详细描述了进行流感病毒感染、动物手术准备以及气管双光子活体成像（2P-IVM）所需的各个步骤。此外，我们还描述了一种特定的实验设置，用于可视化中性粒细胞和树突状细胞（DC）——这两种免疫细胞在介导抗流感病毒防御机制中发挥着重要作用18,19。最后，我们介绍了一种分析中性粒细胞与DC相互作用的方法。研究表明，这些细胞间的接触能够调节DC的活化，进而影响机体对病原体的免疫应答20。

<table><tbody><tr><td>吉加塞普特 instru AF</td><td>Sch&amp;uuml;lke &amp;amp; Mayr GmbH</td><td></td><td>4% 溶液</td></tr><tr><td>CD11c-YFP 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008829</td><td>小鼠在本机构内部繁育</td></tr><tr><td>CK6-ECFP 小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>004218</td><td>小鼠在本机构内部繁育</td></tr><tr><td>1x 改良型杜尔贝科磷酸盐缓冲液（不含氯化钙和氯化镁）</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10x 改良型杜尔贝科磷酸盐缓冲液（不含氯化钙和氯化镁）</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L</td><td>4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>氯胺酮 Labatec</td><td>Labatec Pharma</td><td>7680632310024</td><td>室温保存；配制成氯/赛拉嗪混合溶液后需在 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>赛拉嗪 2%（赛拉嗪）</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>室温保存；配制成氯/赛拉嗪混合溶液后需在 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>26 G 1 mL 皮下注射 BD Plastipak</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 G，0.3 mL BD Micro-Fine 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x 18 G 针头</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G（导管）</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 + HEPES（1x）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>4&amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Liberase TL 研究级酶</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>-20 &amp;deg;C 保存 / 胶原酶（I 型和 II 型）混合物</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0649-50KU</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>CellTrace Violet 染料</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>PE-10 微型医用导管</td><td>2Biological Instruments SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>外科塑料胶带</td><td>M Plast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>维滋透滴眼液</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>室温保存</td></tr><tr><td>橡皮泥</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高耐受性玻璃盖玻片，直径 15 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 便携式动物麻醉系统</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag（气体麻醉与加热平台）</td><td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术板</td><td>伯尔尼大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrimScope II 双光子显微镜</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision 钛蓝宝石激光器</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 水浸物镜</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>The Cube&amp;amp;The Box 培养室及温度控制器</td><td>Life imaging Services</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>Bitplane</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>统计分析软件</td></tr></tbody></table>

利用双光子活体显微镜成像流感病毒感染期间气管黏膜中的细胞相互作用

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

细胞间或细胞与病原体相互作用的分析 体内 是理解免疫应答动态变化的重要工具。双光子活体显微成像技术（2P-IVM）能够在活体动物深层组织中观察细胞间的相互作用，同时最大限度减少图像采集过程中产生的光漂白效应。迄今为止，已有多种针对淋巴器官和非淋巴器官的2P-IVM模型被报道。然而，由于动物呼吸周期引起的运动干扰，呼吸器官的成像仍然面临挑战。
在此，我们介绍一种用于可视化的实验方案 体内 利用双光子活体显微镜（2P-IVM）研究流感病毒感染小鼠气管中的免疫细胞相互作用。为此，我们建立了一套定制的成像平台，包括气管的外科暴露与插管，随后对黏膜上皮中的中性粒细胞和树突状细胞（DC）进行动态成像。此外，我们详细描述了流感病毒鼻内感染的操作步骤以及气管免疫细胞的流式细胞术分析方法。最后，我们分析了在视频记录过程中中性粒细胞与DC的运动行为及其相互作用。本方案可获得稳定且高亮度的四维图像，适用于评估气管内细胞间的相互作用。

在本研究中，我们描述了一种用于研究的详细实验方案 体内 小鼠气管中流感感染期间中性粒细胞与树突状细胞的迁移能力及其相互作用图 3A）。为此，我们分离了 CFP+ 中性粒细胞（92% 纯度； 图3B) 来自CK6-ECFP小鼠，并将其过继转移至感染流感病毒的CD11c-YFP小鼠体内。随后，在感染后第3天进行气管的双光子活体显微成像（2P-IVM）。在此时间点，我们观察到中性粒细胞被显著招募至感染区域，流式细胞术分析结果如图所示（图3C）。双光子体内显微成像（2P-IVM）方案需要使用特定的手术板和为啮齿类动物提供的氧气供应装置（图1A）。通过插入气管的导管供氧有助于动物呼吸，便于暴露气管，并控制与呼吸相关的器官运动（图1B）。在此实验设置...

本研究中，我们介绍了一种在流感病毒感染后对小鼠气管黏膜进行双光子活体成像及细胞相互作用分析的实验方案。该方案对于研究呼吸道感染过程中免疫细胞动态变化的研究人员具有重要意义。

体内细胞间或细胞与病原体相互作用的分析是理解免疫应答感染动态的重要工具。

该方法有助于解答关于呼吸道感染过程中免疫细胞相互作用动态变化的空气传播病原体免疫应答研究中的关键问题。该技术的主要优势在于能够在整个简单手术过程中获得气管上皮明亮且稳定的四维图像。尽管该方法可为流感感染期间中性粒细胞与溶解性细胞的相互作用提供见解，也可应用于其他免疫细胞或空气传播病原体的研究。通常，初次接触该方法的研究人员在维持稳定且炎症反应最小的手术方面会遇到困难。此外，由于存在心脏缺陷，图像分析可能较为复杂。进行鼻内流感感染时，将一只经麻醉的6至8周龄CD11c-YFP小鼠置于仰卧位，并通过脚趾夹捏无反应来确认其处于深度镇静状态。将移液器靠近小鼠左侧鼻孔，每隔约20秒向鼻腔内滴加少量液滴，直至小鼠吸入全部15 µL PR8接种物。2至5分钟后，以相同方式向右侧鼻孔给予15 µL病毒。完成全部接种后，确认小鼠呼吸正常，并将其置于侧卧位的笼中，持续监测直至完全恢复。感染后第三天，从表达CFP的转基因小鼠中取出两侧股骨和胫骨，并用镊子轻轻清理骨骼。剪除骨骺端，使用配备26号针头的1毫升注射器，以预冷的无菌PBS将每根骨骼中的骨髓冲洗至置于冰上的50毫升离心管中。待所有骨髓均收集完毕后，用针头反复吹打骨髓数次，并将细胞悬液通过40微米细胞筛过滤，以获得单细胞悬液。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于2 mL冷PBS中。接下来，将三种Percoll梯度溶液分别取2 mL，按照从高到低的浓度顺序，小心地逐层加入15 mL离心管中。然后，小心地将2 mL骨髓细胞悬液加至最上层梯度液上方，进行离心密度梯度分离。离心结束后，小心地从64%和72%梯度界面处收集条带，并用冷的PBS洗涤中性粒细胞。然后将细胞沉淀重悬于100 µL预冷的PBS中，置于冰上进行细胞计数，并将细胞重悬至每100 µL PBS含5×10⁶个细胞的浓度，用于静脉注射至接种过的CD11c-YFP受体动物体内。在过继转移12小时后，将麻醉后的受体动物置于定制的手术板上，手术板下方为37°C加热表面，随后通过剃毛和脱毛膏去除小鼠颈部的毛发。将小鼠置于塑料固定装置上方，头部朝外并呈一定角度，以利于气管插管，用手术胶带固定前肢、足部和尾巴。在眼睛上涂抹眼膏，并对暴露的皮肤进行消毒。接着，沿颈部正中轴在胸部上缘与下颌最低点连线之间做一厘米长的切口，横向拉开皮肤和唾液腺，以暴露气管。使用镊子小心分离气管，用导管对小鼠进行气管插管，并立即开始人工通气。将手术钩连接到手术板上的杆上，以固定导管的高度和方向，暴露至下颌的气管。用凡士林环绕气管，并用几滴温热的PBS润湿气管。然后将盖玻片粘附到金属支架上，并将支架旋紧至XYZ位移器，以便将盖玻片置于手术准备区域的上方。正确暴露并拉伸气管，并用盖玻片轻轻按压，对于在成像期间长时间保持组织稳定至关重要。进行活体延时成像时，将手术板放入双光子显微镜的37摄氏度培养箱内，并在盖玻片上滴加一滴水。在完成装置居中并对气管组织进行聚焦后，将扫描频率设置为800赫兹，分辨率为520×520像素，视场为440×440微米，线平均次数为1。根据激发荧光染料的需要，将钛宝石激光器设置至适当的波长和功率百分比，并设置三维及延时成像模式，进行同步激发。然后在z轴方向定义50微米的扫描范围，步长为3微米，每30秒记录一次图像，持续30分钟。在完成此实验设置后，可在感染的气管内原位持续捕获长达30分钟的稳定4D图像。对4D图像的分析显示，树突状细胞与募集的中性粒细胞的运动存在显著差异，后者表现出明显更快的运动速度。树突状细胞复杂的形态导致细胞追踪过程中频繁出现误差，进而产生持续时间较短、测量的方向性行为变异较大的运动轨迹。因此，通过考虑轨迹持续时间，建立了一种用于测量方向性的稳健指标，揭示了中性粒细胞与树突状细胞在方向性上的显著差异。此外，通过计算中性粒细胞与树突状细胞之间的距离，可实现对它们随时间接触情况的检测与分析；在本项代表性实验中，部分中性粒细胞与树突状细胞形成了多次短暂接触，而另一些则在成像期间未与树突状细胞发生任何接触。同时，研究中性粒细胞与树突状细胞之间距离随时间变化的平均趋势，有助于分析细胞的整体定位情况，而对特定细胞变化趋势的分析则可用于表征各个单个细胞的行为特征。了解该操作步骤后，可进一步开展其他方法，例如气管的流式细胞术，以评估感染气管中不同免疫细胞募集的定量与特征分析。请务必注意，操作任何流感病毒毒株（即使为小鼠适应株）均可能存在危险，因此所有操作均须在生物安全二级条件下进行。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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