Name: 子宫内膜异位症异种小鼠病变大小的无创监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解利用腺病毒标记和活体成像技术在小鼠模型中实时监测子宫内膜异位症病灶大小变化的方法。该技术可动态评估药物治疗效果，为抗雄激素化合物等疗法研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由西班牙经济与竞争力部通过米格尔·塞尔韦特计划 [CP13/00077] 提供资助，该计划由欧洲区域发展基金（FEDER）联合资助，并授予 R. Gómez 博士；同时由卡洛斯三世健康研究所向 R. Gómez 博士 [PI14/00547 和 PI17/02329] 以及 A. Cano 教授 [PI12/02582] 提供的基金资助。

本研究使用的人体组织样本已获得拉菲大学医院机构审查委员会和伦理委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书。涉及动物的研究已获得瓦伦西亚王子费利佩研究中心机构动物护理委员会的批准，所有操作均遵循美国国立卫生研究院关于哺乳动物护理和使用的指南。
1. 子宫内膜组织采集与预处理
<ol>
	<li>使用连接负压装置的导管获取高质量的人类子宫内膜吸取活检样本。将活检组织倒入含有10 mL无菌生理盐水的烧瓶中，并通过轻柔的手动振荡进行清洗。 
	注意： 获取高质量活检样本的操作步骤此前已有描述17。</li>
	<li>清洗活检组织中残留的血液或黏液。根据需要，将组织反复倒入含有新鲜生理盐水的烧瓶中，重复此过程，直至观察到组织洁净为止。</li>
	<li>将外观健康的活检组织碎片转移至含有10 mL完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）的溶液中，该溶液包含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液。</li>
	<li>将内容物倒入10 cm的培养皿中，使用一对手术刀将组织切成5–10 mm3大小的组织块。</li>
</ol>
2. 子宫内膜组织片段的腺病毒转染
注意： 实验过程中使用的所有材料均应提前放入生物安全柜中。移出所有本次操作不需要的物品，并放置一个装有漂白剂的烧瓶。所有接触过腺病毒载体的材料，必须先用漂白剂消毒，然后才能丢弃至生物危害容器中。
<ol>
	<li>将活检组织切碎后，取一个新的培养皿。用移液器将多个30–50 µL的DMEM液滴滴布于整个培养皿中，各液滴之间留出足够空间，避免相互接触。</li>
	<li>借助连接在注射器上的针头，将单个组织碎片放入每个培养基液滴中。 
	注意：每个液滴应仅含一块子宫内膜组织。</li>
	<li>通过将mCherry腺病毒储备液 [1 x 1010 pfu/mL] 按1:20比例稀释于不含抗生素的DMEM培养基（DMEM + 10%过滤胎牛血清）中，配制Ad-mCherry工作液。</li>
	<li>在96孔板中，每孔加入100–200 μL Ad-mCherry溶液，所加孔数应与培养皿液滴中的组织碎片数量（步骤2.2）相匹配。此外，至少设置3个孔加入不含腺病毒的DMEM培养基作为阴性对照。</li>
	<li>借助连接在注射器上的针头，将培养皿中的各个组织碎片（步骤2.2）转移至96孔板中含Ad-mCherry溶液的各孔中。</li>
	<li>将含有子宫内膜碎片和Ad-mCherry溶液的96孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育16小时。</li>
	<li>将组织转移至另一新96孔板中，该板预先加入含抗生素-抗真菌剂的完全DMEM培养基（不含腺病毒），以洗去残留的腺病毒，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育24–48小时。 
	注意：所有接触过腺病毒的孔板和枪头在丢弃至生物危害容器前，必须用漂白剂彻底覆盖处理。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，置于荧光显微镜下，使用568 nm（红色通道）检测标记效果是否最佳。</li>
	<li>挑选荧光最强的组织碎片，转移至另一新的96孔板中，加入新鲜的完全DMEM培养基（含抗生素-抗真菌剂，不含腺病毒）。</li>
	<li>用塑料封口膜密封96孔板，运送至特定病原体阴性动物实验区域，用于将子宫内膜碎片植入受体动物体内。</li>
</ol>
3. 子宫内膜异位症小鼠模型的建立
注意：使用6–8周龄的裸鼠（或类似的免疫缺陷品系）雌性小鼠作为受体动物，饲养于特定病原体阴性环境中。为避免激素周期相关的变异，并同时通过雌二醇促进病灶生长，需对动物进行卵巢切除术，并植入含有18 mg 17β-雌二醇（17β-E2）的60天缓释胶囊。卵巢切除及胶囊植入操作必须在将子宫内膜组织片段移植到受体动物之前至少一周完成。
<ol>
	<li>卵巢切除术 
	注意：在生物安全柜中准备已灭菌的手术器械。在同一房间内准备好麻醉设备和术后恢复区域。
	<ol>
		<li>以每只小鼠5 mg/kg的剂量皮下注射吗啡类药物。注射后让小鼠静置30分钟，以便药物的镇痛效果得以发挥。</li>
		<li>连接吸入式麻醉设备，使氧气和异氟烷（2% mg/kg）流入密闭麻醉舱数分钟。</li>
		<li>将动物放入异氟烷麻醉舱中，等待3–5分钟，并通过按压其一只脚掌检查动物是否完全麻醉。将动物转移至手术区域，并通过面罩持续输送异氟烷气体以维持麻醉状态，面罩需覆盖呼吸道。</li>
		<li>使用氯己定对术区进行消毒后，用锐利剪刀在髋部水平处做一条约0.5 cm的横向肋缘切口。</li>
		<li>分离皮肤与肌肉以进入腹腔，识别包裹卵巢的白色脂肪垫，并用解剖镊子牵出卵巢。</li>
		<li>使用可吸收缝线在输卵管周围打结并收紧，确保充分止血后再切除卵巢。</li>
		<li>用6-0可吸收缝线缝合肌肉层，再用6-0不可吸收缝线缝合皮肤。再次使用抗菌溶液清洁术区。</li>
		<li>重复上述操作以切除对侧卵巢。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>雌二醇缓释颗粒植入 
	注意：在进行卵巢切除术时需确保动物处于麻醉状态，以便在此时植入缓释颗粒。
	<ol>
		<li>卵巢切除术完成后立即用抗菌溶液清洁颈部周围皮肤，并用锐利剪刀在颈背部做一条横向的皮下小切口（0.5 cm）。</li>
		<li>使用剪刀分离皮肤与肌肉，制造一个足够大的皮下囊袋以容纳缓释颗粒。</li>
		<li>植入含有18 mg 17β-E2的缓释颗粒，并用6-0不可吸收缝线缝合皮肤。再次使用抗菌溶液清洁术区。</li>
		<li>将动物置于恢复区域，并给予适当剂量的长效镇痛药以缓解术后恢复期的不适。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>子宫内膜移植手术 
	注意：卵巢切除术后应至少给予动物七天的隔离期，以确保其完全恢复，再开始子宫内膜碎片移植手术。为与组织标记最佳同步，建议在移植手术前2–3天采集活检样本，以避免外植体长期培养。
	<ol>
		<li>提前准备好位于特定病原体-free区域内的手术室。在生物安全柜中备齐所有必需的手术器械、麻醉设备以及术后恢复区域。</li>
		<li>将动物带入手术室，对每只小鼠皮下注射吗啡类药物，剂量为5 mg/kg。注射后让小鼠静置30分钟，以便药物的镇痛效果得以发挥。</li>
		<li>连接吸入式麻醉设备，使氧气和异氟烷（2% mg/kg）流入密闭麻醉舱数分钟。</li>
		<li>手术开始前，将含有荧光标记碎片的培养板（来自步骤2.10）移入生物安全柜中，打开密封并倒入培养皿中以便于操作。</li>
		<li>将动物放入异氟烷麻醉舱中，等待3–5分钟，并通过按压其一只脚掌检查动物是否完全麻醉。将动物转移至手术区域，并通过面罩持续输送异氟烷气体以维持麻醉状态，面罩需覆盖呼吸道。</li>
		<li>将麻醉后的动物仰卧放置。对腹部腹侧区域进行消毒。用锐利剪刀做一条1.5 cm的纵向腹部切口，分离皮肤与肌肉。随后，在肌肉层做一条1.5 cm的纵向切口以进入腹膜腔。</li>
		<li>用微型镊子夹住腹壁肌肉的左侧边缘并翻折，尽量将腹膜内面外翻暴露出来。</li>
		<li>用微型镊子夹取一个子宫内膜移植体，短暂浸入n-丁基氰基丙烯酸酯粘合剂中，然后将其贴附于腹膜上使其固定。静置数秒使其干燥。重复步骤3.3.6和3.3.7，在腹膜对侧植入另一个移植体。</li>
		<li>用可吸收6-0缝线缝合肌肉层，再用不可吸收6-0缝线缝合皮肤。再次使用抗菌溶液清洁术区。</li>
		<li>将动物置于恢复区域，并给予适当剂量的长效镇痛药。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用活体成像系统进行活体荧光成像
<ol>
	<li>打开活体成像系统设备，启动程序，并让CCD相机冷却数分钟。</li>
	<li>准备吸入麻醉设备。以2%的流速开启异氟烷数分钟，以充满麻醉室。同时准备好麻醉后恢复区域。</li>
	<li>当程序启动且CCD相机完成冷却后，点击成像向导工具：系统将启动一个教程，连续显示一系列窗口，每个窗口对应一个可选参数，用户可通过点击相应选项框进行选择。在每个窗口中选择适当的选项，并点击确定按钮，按以下顺序进入下一组参数设置。
	<ol>
		<li>在荧光参数中选择透射光照明框，在滤光片组合参数中选择mCherry框。勾选拍照模式和确认焦距选项框，并在曝光参数中选择“自动”选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仪器设置完成后，将一只动物放入麻醉室。待其完全麻醉后，将其转移至活体成像系统的小动物成像舱内，使其仰卧，头部置于连接麻醉机的导管中。关闭舱盖，点击采集按钮开始监测。</li>
	<li>采集显示的图像（共五幅图像，每对选定的滤光片对应一幅图像），并通过点击另存为按钮保存数据。将小鼠转移至麻醉后恢复区域。对剩余动物重复上述过程。</li>
	<li>为准确追踪信号随时间的变化，每周进行两到三次重复监测。</li>
	<li>在实验周期结束时，采用CO2窒息法对动物实施安乐死。</li>
</ol>
5. 定量分析 在体 内 荧光图像
<ol>
	<li>通过图像解混分离真实荧光信号：
	<ol>
		<li>打开 在体 内 成像分析耦合软件程序.</li>
		<li>选择“Sequenceinfo”文件以开始分析。此时将出现两个窗口：“Sequence view”和“Tool Palette”。选择 工具面板 菜单显示后，依次选择以下选项。</li>
		<li>选择 校正 并单击该方框 自适应荧光背景扣除 去除发光图像数据中的非特异性荧光信号。选择最感兴趣的阈值并点击 设置.</li>
		<li>点击 光谱 解混，选择感兴趣的波长、解混方法（光谱库法、引导法、自动法或手动法），然后单击 开始 解混.</li>
		<li>选择 未混合 与 mCherry 信号对应的图像并双击。一个新窗口将显示目标信号的最终图像。</li>
		<li>重复步骤 5.1.3。</li>
		<li>可选：如果需要未混合结果的代表性图像（JPEG），请选择所需的设置 工具面板 | 图像调整 （颜色表、像素合并、对比度， 等等。），然后点击 导出图形 在“解混”窗口中，将当前图像视图导出为图像。</li>
		<li>保存未混合的文件： 文件 | 另存为 | 选择文件夹 和 好的.</li>
		<li>对所有动物的其余监测日重复该过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ROI的设置与信号定量
	<ol>
		<li>点击 浏览 并选择 未混合文件 （参见步骤 5.1.8）以供分析的目标。此时将出现一个新窗口。</li>
		<li>点击 添加到列表 包含来自每只动物在不同时间点的所有解混文件，然后单击 以组为单位加载所有图像必须以单一序列呈现。</li>
		<li>前往 工具面板 窗口：取消勾选复选框 I个体 按相同比例尺获取所有图像。</li>
		<li>双击序列中的一幅图像，并在感兴趣区域使用以下步骤创建一个感兴趣区域（ROI）。前往 ROI 工具 并选择 轮廓 和 自动 1 选项，单击出现的圆形，将其放置在荧光信号的中心，然后单击 创建 在显示的窗口中。 
		注意：此操作会自动高亮显示荧光强度高于背景值的像素即，病灶）并生成一个覆盖所勾画像素区域的形状。</li>
		<li>复制创建的感兴趣区域（ROI）形状，并粘贴到无信号的背景区域。</li>
		<li>点击 测量感兴趣区域 | 全选 用于显示荧光强度值。使用鼠标选择数据值，点击右键，复制并粘贴到电子表格中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据（荧光信号）标准化
<ol>
	<li>选择信号强度最大的初始时间点。通过以下公式对每个时间点的信号强度进行归一化处理： 
	（每个时间点的信号强度 / 整个时间过程中观察到的最大信号强度）× 100。</li>
</ol>

<ol><li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li>
<li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/clinicalobgyn/Abstract/2010/06000/Endometriosis_and_Infertility.19.aspx">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li>
<li>Eskenazi, B., Warner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+and+Gynecology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of endometriosis.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).</li>
<li>Giudice, L. C., Kao, L. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15541453">Endometriosis.</a> Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).</li>
<li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+medical+and+surgical+treatment+of+endometriosis-associated+infertility+and+pelvic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+and+Obstetric+Investigation%22%5BJournal%5D)">The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain.</a> Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).</li>
<li>D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+laparoscopic+appearance+of+spontaneous+endometriosis+in+the+baboon+%28Papio+anubis%2C+Papio+cynocephalus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus).</a> Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).</li>
<li>Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Record+review+of+baboons+with+histologically+confirmed+endometriosis+in+a+large+established+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Primatology%22%5BJournal%5D)">Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony.</a> Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).</li>
<li>Donnez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+endometriotic+nodules+in+an+experimental+baboon+modelmimicking+human+deep+nodular+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+%26+Sterility%22%5BJournal%5D)">Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions.</a> Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).</li>
<li>Grummer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+endometriosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Animal models in endometriosis research.</a> Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+endometriosis+in+a+mouse+model+through+analysis+of+implantation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).</li>
<li>Grummer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+endometriosis%3A+validation+of+an+in-vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model.</a> Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).</li>
<li>Becker, C. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002944010622249">A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy.</a> The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).</li>
<li>Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+contribute+to+the+vascularization+of+endometriotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).</li>
<li>Nap, A. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15001592">Antiangiogenesis therapy for endometriosis.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+%28Pro-EGCG%29+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li>
<li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li>
<li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578(2007).</li>
<li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Obstetrics+and+Gynaecology+Research%22%5BJournal%5D)">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis%3A+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Obstetric+Gynecologic+and+Reproductive+Biology%22%5BJournal%5D)">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案详细描述了一种子宫内膜异位症动物模型的建立方法，该模型在保留移植病灶结构的同时，能够实时检测由mCherry标记的子宫内膜组织发出的荧光。在本方案中，我们介绍了使用特定的活体成像系统及相关软件，对标记病灶发出的荧光进行无创性评估的方法。每位使用者应根据所在机构所配备的具体成像设备及配套软件对本方案进行相应调整。监测过程在麻醉动物上进行，通过与活体成像系统连接的异氟烷气体麻醉机实施麻醉。为避免伤口自身荧光的干扰，建议在移植手术后至少三天再开始对病灶荧光进行监测。
类似于本文所示的异源小鼠子宫内膜异位症模型此前已有描述，其方法包括将标记了绿色荧光蛋白（GFP）的子宫内膜片段进行移植18,19。然而，使用mCherry作为人组织标记的报告基因相较于GFP具有优势，因其组织穿透性更强。由于mCherry具有更宽的发射光谱和更高的光稳定性，可产生更明亮的信号，更适合用于观察腹腔内组织片段。
由于腺病毒体积较小，可作...

子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病，由功能性子宫内膜组织在子宫腔外种植引发。异位病灶生长并诱发炎症反应，导致慢性盆腔疼痛和不孕。1据估计，育龄女性中有10%至15%受子宫内膜异位症影响2，而在不孕女性中，该病的患病率约为40%至50%3目前用于子宫内膜异位症的药物治疗无法完全根除病灶，且存在副作用4,5更高效疗法的研究需要对现有的子宫内膜异位症动物模型进行优化，以便准确模拟人类病灶，并能够密切评估化合物等对病灶大小的影响。
灵长类动物模型已被用于模拟子宫内膜异位症，通过在组织学上与人类相似的部位植入异位病灶来实现6,7,8；然而，由于涉及灵长类动物实验的伦理问题以及高昂的经济成本，其应用受到限制9。因此，使用小型动物尤其是啮齿类动物建立子宫内膜异位症体内模型仍被广泛采用，因其可支持更大样本量的研究10,11。在这些动物中，可通过移植啮齿类子宫角组织片段（&#34;同源模型&#34;）12,13，或移植人类子宫内膜/子宫内膜异位组织至异位部位（异源模型）来诱导子宫内膜异位症14。与人类不同，啮齿类动物不会发生子宫内膜脱落，因此该类物种无法自发形成子宫内膜异位症。因此，同源小鼠模型受到质疑，原因是所植入的异位小鼠子宫组织并不能反映人类子宫内膜异位病灶的特征15。
通过将新鲜的人子宫内膜组织片段移植到免疫缺陷动物体内，可在子宫内膜异位症的异种模型中模拟出适当的生理状况。在传统的异种模型中，通常在实验终点使用游标卡尺测量病灶大小，以评估目标化合物的治疗效果16。一个明显的局限性在于，此类终点动物模型无法实现对移植动态过程或子宫内膜异位病灶随时间发展的连续观察。另一个局限性是，使用游标卡尺无法精确测量病灶大小。事实上，游标卡尺提供的标准误差范围与小鼠体内植入病灶的尺寸处于同一数量级（即毫米级），因而限制了这些工具检测病灶真实尺寸变化的能力。
为了克服上述局限性，本文描述了一种异源性子宫内膜异位症小鼠模型的建立方法，该模型通过植入经基因工程改造、可表达报告荧光蛋白m-Cherry的人体组织。利用适当的成像系统检测荧光信号，可实现对病灶状态的无创监测，并同时实时定量病灶大小。因此，与传统的终点模型相比，本模型具有明显优势，能够实现无创的实时监测，并可更客观、准确地评估病灶大小的变化。

<table><tbody><tr><td>Endosampler&amp;trade;</td><td>Medgyn</td><td>22720</td><td>用于采集子宫内膜的套管</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>VWR</td><td>HYCLSH30285.FS</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>Vector Biolabs</td><td>1767</td><td>表达 mCherry 的腺病毒载体</td></tr><tr><td>PBS，1× 溶液，无菌，pH 7.4</td><td>VWR</td><td>E504-500ML</td><td>洗涤用缓冲液</td></tr><tr><td>17-β-雌二醇缓释颗粒，18 mg/60 天</td><td>Innovative Research of America</td><td>SE-121</td><td>啮齿类动物用激素缓释颗粒</td></tr><tr><td>Vetbond&amp;trade; 组织粘合剂</td><td>3M</td><td>780-680</td><td>组织粘合剂</td></tr><tr><td>聚苯乙烯水晶培养皿</td><td>Levantina</td><td>367-P101VR20</td><td>培养皿</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>医用注射器，10 mL，0.5 mL 刻度</td><td>VWR</td><td>CODA626616</td><td>注射器</td></tr><tr><td>丁腈手套，无粉</td><td>VWR</td><td>112-2754</td><td>手套</td></tr><tr><td>裸鼠（Soft Swiss nude mice）</td><td>Charles River</td><td>SNUSSFE05S</td><td>动物实验用小鼠</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum 活体成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>活体监测设备</td></tr><tr><td>Living Image&amp;reg;（Ivis 软件）</td><td>Perkin Elmer</td><td>---</td><td>活体监测软件</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>富集血清</td></tr><tr><td>96 孔细胞培养处理板</td><td>Life technologies</td><td>167008</td><td>培养板</td></tr><tr><td>尿液收集瓶</td><td>Summedical</td><td>4004-248-001</td><td>用于洗涤的烧瓶</td></tr><tr><td>无菌手术刀片</td><td>(Aesculap Division) Sanycare</td><td>1609022-0008</td><td>手术刀片</td></tr><tr><td>Isovet 1,000 mg/g</td><td>B-BRAUN</td><td>---</td><td>异氟烷（麻醉剂）</td></tr><tr><td>Buprex&amp;reg; 0.3 mg</td><td>Schering Plough S.A.</td><td>---</td><td>丁丙诺啡（镇痛溶液）</td></tr><tr><td>注射用吗啡溶液 10 mg/mL</td><td>B BRAUN</td><td>---</td><td>吗啡（镇痛溶液）</td></tr><tr><td>Monofyl&amp;reg; 可吸收缝线</td><td>COVIDIEN</td><td>---</td><td>缝线</td></tr><tr><td>脱氯氯己定</td><td>Promedic SA</td><td>---</td><td>消毒溶液</td></tr><tr><td>显微镜 DMi8</td><td>Leica Mycrosystems</td><td>---</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>Hera Cell 150 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026282</td><td>培养箱</td></tr></tbody></table>

异源小鼠子宫内膜异位症模型中病灶大小的无创监测

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

在此，我们描述了一种异源性小鼠模型的建立方案，该模型可通过非侵入性监测植入的异位人子宫内膜组织发出的荧光，实时评估子宫内膜异位症的进展。为此，获取接受卵子捐赠的供体女性的子宫内膜活检样本。将人子宫内膜组织碎片在表达报告荧光蛋白mCherry的cDNA的腺病毒存在下进行体外培养。感染后经观察，选择荧光标记效率理想的组织用于移植至受体小鼠。移植手术前一周，对受体小鼠实施卵巢切除术，并皮下植入雌二醇缓释丸，以维持病灶的存活与生长。手术当天，对小鼠实施麻醉，经腹白线处做一小切口（1.5 cm），进入腹腔. 荧光标记的移植灶用镊子夹取，短暂浸泡于胶水中后贴附于腹膜层。切口缝合后，动物恢复数天。通常使用活体成像系统每3天无创监测一次异位子宫内膜移植灶的荧光信号，持续4周。通过定量mCherry信号并相对于显示最大荧光强度的初始时间点进行归一化，可实时估算异位子宫内膜移植灶的大小变化。
传统的子宫内膜异位症临床前啮齿类动物模型无法实现对病灶的实时无创监测，而仅能在实验终点评估所检测药物的作用效果。本方案可实现对病灶的实时追踪，更有利于探索药物在子宫内膜异位症临床前模型中的治疗潜力。该模型的主要局限性在于，由于腺病毒的附加体表达，无法实现长期的无创监测。

本文描述了一种构建异源性子宫内膜异位症模型的方法，通过将荧光标记的人子宫内膜组织片段植入免疫缺陷小鼠体内，保留病灶的结构特征，从而实现对病灶进展的无创监测。子宫内膜片段的标记通过感染经基因工程改造、可表达mCherry蛋白（一种在近红外区域发射荧光的蛋白）的腺病毒来实现。在图1中，我们展示了在荧光显微镜下观察到的Ad-mCherry感染后的人子宫内膜片段的代表性图像。为了便于说明，图像中同时包含了标记和未标记的片段，以便观察感染组织与未感染组织之间荧光的差异（自发荧光）。在监测过程中，除了使用mCherry的参考波长外，还采用不同激发/发射波长滤光片组合拍摄荧光图像（图2），以确定组织特有的荧光发射谱型。该操作的目的是将病灶实际发出的荧光信号与宿主组织的背景荧光及手术后形成的瘢痕组织的自发荧光分离开来。分离过程的示例见图3。病灶大小变化的估算通过量化并归一化病灶在不同时间点发出的荧光信号来完成。...

本文介绍了一种对移植于小鼠体内的荧光标记人子宫内膜组织片段进行活体成像的实验方案。该方法可通过实时监测和定量荧光报告分子所发出的荧光信号，研究选定药物对子宫内膜异位病灶大小的影响。

在此，我们描述了一种异源性小鼠模型的建立方案，该模型可用于实时评估子宫内膜异位症的进展过程……

该方法有助于解答子宫内膜异位症领域中评估治疗药物效果的关键问题，例如抗雄激素化合物对子宫内膜异位病灶大小的影响。该技术的主要优势在于，能够在子宫内膜异位症的动物模型中实时评估特定药物的作用，而非仅在实验终点进行评估。本次演示由本实验室的技术员 Jessica Martinez，以及来自费利佩亲王研究中心的兽医 Viviana Bisbal 和 Nerea Marin 共同完成，她们与我们的团队保持着密切的合作关系。在植入手术前两到三天，将冲洗过的健康子宫内膜组织活检碎片转移至含有完全培养基的10厘米培养皿中，并使用手术刀将组织切成5至10立方毫米大小的块状。使用微量移液器，在新的10厘米培养皿底部加入30至50微升的DMEM液滴，各液滴之间需留出足够间距，确保彼此不接触。待所有液滴放置完毕后，用注射器针头将每一块活检组织碎片分别放入每个液滴中。接下来，向每块组织碎片对应的 96 孔板的一个孔中加入 100 至 200 µL 新鲜配制的 adeno-mCherry，另设三个不含腺病毒的 DMEM 孔作为阴性对照。然后用针头将每份组织样本转移至含有 adeno-mCherry 溶液的孔中，在 37°C 和 5% CO₂ 条件下过夜孵育。次日清晨，将培养板置于荧光显微镜载物台上，使用 568 纳米激光检查组织碎片的标记效果是否最佳。使用适当稀释度的感染性mCherry腺病毒是实现组织高效标记的关键。因此，为了确定合适的浓度，每次实验均需评估多个mCherry稀释梯度。随后，将荧光最强的组织片段转移至新的96孔板的各个孔中，每个孔内含有新鲜的完全培养基。至少在卵巢切除术后七天，将子宫内膜组织碎片倒入培养皿中，并通过夹捏足趾无反应来确认已麻醉的卵巢切除动物无痛觉反应。将小鼠仰卧位固定，消毒腹部腹侧区域，在腹部做一条1.5厘米长的纵向切口。分离皮肤与肌肉组织，再在肌肉层做第二个1.5厘米长的切口，以进入腹腔。用微型镊子夹住腹壁肌肉的左侧边缘，将肌肉折叠以使腹膜的内面暴露在动物体外。用微型镊子将一个子宫内膜异位组织短暂浸入正丁基氰基丙烯酸酯粘合剂中，然后将其片段粘附到腹膜上。待粘合剂干燥后，按照上述方法在腹膜对侧放置第二个异位组织。使用可吸收的6-0缝线缝合肌肉层，使用不可吸收的6-0缝线缝合皮肤。随后用消毒液清洁皮肤切口，并将动物置于恢复区进行监测，直至完全恢复卧姿。对于植入组织碎片的活体荧光成像，在植入手术后24至48小时，打开活体成像系统，启动软件，并让CCD相机冷却数分钟。仪器准备就绪后，将第一只麻醉小鼠以仰卧位放入活体成像系统的笼盒中，使小鼠头部进入与麻醉机相连的套管内，然后关闭盖子。接着点击“acquire”以获取并保存生成的五幅图像。为定量分析活体荧光信号，在相应的图像分析软件中点击“browse”，选择待分析的目标未混合文件进行分析。此时将出现一个新窗口。

noninvasive-monitoring-lesion-size-heterologous-mouse-model

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

子宫内膜异位症异种小鼠病变大小的无创监测

通过将子宫组织自体移植至肠系膜动脉级联，对小鼠和大鼠进行子宫内膜异位症手术诱导的描述。...

通过子宫组织自体移植建立手术诱导型子宫内膜异位症小鼠模型

我们描述了一种非侵入性动物成像平台，可用于检测、定量和监测卵巢癌的生长及复发。这种腹腔内异种移植模型模拟了卵巢癌患者的临床特征。...

用于非侵入性成像检测与监测卵巢癌复发的小鼠模型

我们介绍了利用刚性内窥镜对小鼠结肠疾病治疗疗效进行纵向监测的方法。该方案可直接用于活体小鼠中单个肿瘤治疗反应的表征，也可用于监测潜在的疾病复发。...

利用活体小鼠连续内窥镜成像无创评估新型肠道疾病治疗药物的疗效

卵巢癌转移的特点是存在大量弥散性腹膜内病灶，因此准确目视量化肿瘤负荷具有挑战性。本文描述了一种方法 原位 和 离体...

腹腔内卵巢癌转移的定量分析

许多子宫内膜异位症的啮齿类动物模型受限于技术复杂性、可重复性差，和/或需要使用免疫缺陷动物或特殊报告基因小鼠。我们提出了一种简化的病灶诱导系统，该系统可应用于任何实验小鼠，具有独立可验证的客观评分系统，且无需进行卵巢切除术或存活手术。...

使用自然动情周期小鼠建立同系小鼠子宫内膜异位症模型

本方案描述了一种利用超声成像技术，在可诱导的小鼠子宫内膜癌模型中，通过与大体及组织学变化进行对照，随时间监测子宫形态学改变进展的方法。...

小鼠中通过Pax8导向删除肿瘤抑制因子Arid1a和Pten实现子宫内膜癌进展的无创超声评估

本研究介绍了一种专门设计用于模拟子宫内膜异位囊肿（一种具有重要临床意义的子宫内膜异位症亚型）的新型小鼠模型。该模型采用C57BL/6J小鼠，旨在阐明与子宫内膜异位囊肿相关不孕的病理生理机制，为填补生殖医学领域当前的知识空白提供一种优化的研究工具。...

建立子宫内膜异位囊肿小鼠实验模型以研究其相关不孕症

卵巢癌的原位动物模型能更好地模拟人类疾病，因此有助于加深对癌症进展及肿瘤治疗反应的理解。小鼠模型通过包膜内注射表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞建立。治疗通过口服灌胃给药。肿瘤生长通过生物发光成像进行监测。 体内...

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

本研究涉及一种有价值的方法学方案的开发与标准化，用于测定化学物质、工业废水或污水以及液态环境样品对盐水枝角类动物Artemia...

长期致死毒性试验与甲壳类动物 Artemia franciscana

红霉素A的异源生物合成途径 大肠杆菌 包括以下实验步骤：1）基因转移；2）异源重构；以及3）产物分析。每个步骤将结合利用异源宿主生产治疗性天然产物的动机、潜力与挑战进行阐述 E. coli...

异源天然产物生物合成的原理、实验步骤及其潜力：以大肠杆菌（E. coli）合成复杂抗生素红霉素A为例

了解利用腺病毒标记和活体成像技术在小鼠模型中实时监测子宫内膜异位症病灶大小变化的方法。该技术可动态评估药物治疗效果，为抗雄激素化合物等疗法研究提供重要工具。

异源小鼠子宫内膜异位症模型中病灶大小的无创监测

探索更多视频