Name: 用水凝胶微室阵列 (HMCA) 板进行肿瘤细胞侵袭和抗转移药物筛选的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 了解水凝胶微室阵列技术用于肿瘤细胞侵袭分析的方法。该系统可生成均一肿瘤球体并实现连续监测，支持高通量抗转移药物筛选，为癌症研究提供可靠工具。

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本工作由 Moshe Shimon 和 Judith Weisbrodt 的遗赠资助。

1. HMCA 平板压印
注意：本方案中所用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章和HMCA成像板的设计与制备全过程已在我们先前的文章中有详细描述15,16。PDMS印章（负型结构）用于压印HMCA（正型结构），每个孔中包含约450个微腔（MC）（图1A）。如图1B所示，每个微腔呈倒置的截角方形锥体结构（高度：190 µm，小底面积：90 µm × 90 µm，&#160;大底面积：&#160;370 µm × 370 µm）。HMCA板用于3D肿瘤类球体的制备与培养，随后用于侵袭实验。此外，也可使用商用印章进行HMCA的制备。
<ol>
	<li>配制6%低熔点琼脂糖（LMA）溶液。将LMA粉末和无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（每10 mL PBS中加入0.6 g LMA）加入带有磁力搅拌子的玻璃瓶中。将玻璃瓶置于加热板上，边加热至80 °C边搅拌数小时，直至形成均匀溶液。使用前将溶液保持在70 °C。</li>
	<li>将PDMS印章放入烘箱中预热至70 °C，保持温热状态直至使用。或者，使用商用印章并按照其说明操作。</li>
	<li>将商用6孔玻璃底培养板置于预热至75 °C的干浴仪上，静置数分钟，直至培养板完全升温。</li>
	<li>将预热的LMA溶液滴加400 µL至每个孔的玻璃底部。将预热的PDMS印章轻轻覆盖在琼脂糖液滴上。室温（RT）孵育5–10分钟进行预凝胶化和预冷却，随后在4 °C孵育20分钟以完成琼脂糖完全凝胶化。然后轻轻剥离PDMS印章，留下带有微腔结构（MCs）图案的琼脂糖凝胶。 
	注意：此步骤需同时在所有孔中进行。</li>
	<li>将压印后的培养板放入配备紫外（UV）灯的光固化系统中，孵育3分钟。 
	注意：此时HMCA培养板已完成紫外灭菌。</li>
	<li>用无菌PBS填充大孔，以确保环境湿润，然后盖上盖子，用封口膜包裹，并在4 °C保存至使用。</li>
	<li>使用前，清除HMCA培养板中的PBS残留液，将其置于生物安全柜中。</li>
</ol>
2. 加载细胞与类球体形成
<ol>
	<li>按如下步骤收集细胞：从一个10 cm培养皿的单层细胞中移除全部培养基，用10 mL PBS洗涤两次以去除血清残留物，加入5 mL已预热至37 °C的胰蛋白酶，于37 °C培养箱中孵育3分钟。随后轻轻摇动培养皿以确保单层细胞完全脱落，加入10 mL已预热至37 °C的完全培养基，并反复吹打至形成均匀的细胞悬液。将细胞悬液离心并用15 mL新鲜培养基洗涤一次，然后重悬于适量浓度的新鲜完全培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液（50 µL，150–360 × 103 个细胞/mL，约每微腔16–40个细胞）轻柔地加至HMCA顶部，静置15分钟，使细胞在重力作用下自然沉降。</li>
	<li>沿大孔塑料底部的环外缘，分6–8次每次加入500 µL新鲜培养基（总量3–4 mL）。</li>
	<li>将HeLa细胞在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育72小时，MCF7细胞孵育48小时，以促进球状体的形成。</li>
</ol>
3. 碘化丙啶（PI）染色法检测细胞活力
<ol>
	<li>配制PI储存液（每1 mL PBS中含500 µg PI），于4 °C保存约6个月。使用时取6 µL储存液加入12 mL不含酚红的完全培养基中，新鲜配制1:2,000的稀释液（0.25 µg/mL），用于6孔HMCA板（每孔2 mL）。</li>
	<li>将培养48–72小时的HMCA板从培养箱转移至生物安全柜中。移除HMCA中的全部培养基，操作时将移液枪头尖端靠在大孔塑料底部边缘（避开水凝胶阵列区域），使阵列槽内仍保留培养基。</li>
	<li>将3.1步骤中配制的PI稀释液轻轻加入每个孔中，每孔2 mL，移液时枪头靠在大孔塑料底部边缘。将HMCA板置于37 °C、5% CO2的湿化环境中孵育1小时。随后进行第7步。 
	注意：此处也可使用其他染料，例如Hoechst用于细胞核染色，四甲基罗丹明甲酯（TMRM）用于线粒体膜电位染色，荧光素二乙酸酯（FDA）用于活细胞检测，Annexin V用于凋亡检测等。</li>
</ol>
4. 胶原混合物的制备
<ol>
	<li>通过高压灭菌制备无菌双蒸水（DDW），并准备100 mL经滤膜除菌的1 M NaOH储备液。将材料置于室温保存，用于胶原混合液制备的枪头则需在-20 °C冷冻保存，直至使用。</li>
	<li>使用前10–20分钟，将以下试剂置于冰桶中冷却至完全降温，包括：无菌双蒸水、1 M NaOH无菌溶液、无菌10x PBS、大鼠尾I型胶原（4 °C保存3–个月）、以及无菌离心管。将冰桶放置于生物安全柜内。</li>
	<li>为6孔HMCA侵袭实验板（每孔300 µL）配制终浓度为3 mg/mL的胶原混合液，总体积为1,800 µL，步骤如下：按以下顺序将试剂加入已冷却的离心管中：515 µL双蒸水、24.8 µL 1 M NaOH和180 µL 10x PBS。充分涡旋混匀后放回冰上。最后加入1080 µL胶原溶液，再次涡旋混匀，并立即放回冰中。</li>
</ol>
5. HA与胶原蛋白混合物的制备
<ol>
	<li>将10 mg HA溶解于2 mL无菌去离子水（DDW）中。室温孵育数分钟，并轻轻涡旋至粉末完全溶解。将储备液于4 °C保存，可稳定长达两年。</li>
	<li>使用前，将HA储备液置于生物安全柜内的冰桶中预冷。</li>
	<li>按步骤4所述配制3 mg/mL胶原蛋白混合液。取36 µg（7.2 µL）HA加入1,800 μL即用型胶原蛋白混合液中，终浓度为20 µg/mL。再次短暂涡旋混匀后，放回冰上。</li>
</ol>
6. 细胞外基质混合物的添加
<ol>
	<li>将含有培养48–72小时类球体的HMCA板从培养箱转移至生物安全柜中，并置于冰上。孵育10分钟，直至板冷却。在水浴中预热1% LMA溶液至37 °C。</li>
	<li>通过将移液枪尖端靠在宏孔塑料底部靠近水凝胶阵列边缘的位置，吸除HMCA周围的全部培养基。然后，使用细尖/凝胶加样枪头，将枪尖靠在阵列边缘，极其轻柔且缓慢地吸出阵列槽内的所有培养基。 
	注意：在吸除水凝胶阵列周围所有培养基后，阵列槽内仍充满培养基。必须非常轻柔地去除这部分培养基，以避免破坏水凝胶微腔（MC）或导致类球体移位。</li>
	<li>使用预冷冻的细尖枪头吸取150 µL胶原蛋白混合物或透明质酸与胶原蛋白混合物（ECM混合物），并将枪头贴附于阵列边缘，将混合物加入阵列槽中。缓慢释放混合物，以避免类球体移位。重复此步骤，再加入另一份150 µL混合物，每孔总量为300 µL。对每个孔均按相同操作进行，直至所有孔均加样完成。随后将板放入培养箱中孵育1小时，以完成ECM的完全凝胶化。</li>
	<li>待ECM完全凝胶化后，用移液器将400 µL预温的1% LMA加至ECM凝胶上方。盖上板盖，先在室温下孵育5–7分钟，再于4 °C孵育2分钟，以促进琼脂糖凝胶化。最后，将移液枪尖端靠在宏孔塑料底部边缘，轻柔地加入2 mL完全培养基。 
	注意：琼脂糖层可防止胶原凝胶基质从HMCA上脱落。</li>
</ol>
7. 侵袭实验的获取与分析
<ol>
	<li>将HMCA板装载到配备有培养箱的电动倒置显微镜载物台上，预先调节至37 °C、5% CO2及湿润的大气环境。</li>
	<li>预先确定每个孔中图像采集的位置，以覆盖整个阵列区域，并使用10X或4X物镜（此步骤是此处所用图像采集软件的要求，详见下方材料表）。或者，可使用任意图像采集软件，通过选择&#160;&#34;Stich&#34; 选项，实现对所需全部区域的自动扫描。</li>
	<li>每隔2–4小时采集一次明场（BF）图像，总时长为24–72小时，以追踪细胞从类球体向周围ECM的侵袭过程。</li>
	<li>使用专用荧光滤光片组采集PI荧光图像（激发滤光片：530–550 nm，二向色镜：565 nm长通，发射滤光片：600–660 nm）。</li>
	<li>从图像采集软件中导出延时明场/荧光图像，并使用工具栏中的&#34;Database&#34; 标签页及随后的&#34;Export record files&#34;按钮，将其保存为TIFF格式至指定文件夹。 
	注：我们开发了一套专用的MATLAB软件内部分析代码，包含一个设计的图形用户界面（GUI），可更快速、更便捷地执行侵袭分析。在此分析代码中，类球体和侵袭区域的分割通过Sobel滤波器结合形态学算子“腐蚀”（Erosion）和“膨胀”（Dilation）进行半自动完成。在自动分割后，根据需要进行手动校正以提高准确性。分割完成后，软件自动计算一组参数并导出至Excel文件以供进一步处理。参数列表包括：初始时刻（t = 0）类球体的基本截面积、与类球体主体相连的细胞侵袭区域（即主要侵袭区域）、与主要侵袭区域分离的细胞区域、分离细胞的数量、从类球体质心到主要侵袭区域边缘及分离细胞的平均侵袭距离，以及集体侵袭距离参数d（d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2)，其中(X1, Y1)和(X2, Y2)分别为集体侵袭前后的类球体质心坐标）。或者，也可使用其他专业图像分析软件进行图像分析。</li>
	<li>打开GUI，点击&#34;Load BF&#34; 按钮。图像打开后，调整分割参数（最小尺寸：&#62;1，闭合半径：&#62;1），以实现对类球体及其侵袭区域的精确分割，然后点击&#34;Region of interest (ROI) segmentation&#34;按钮执行，每个类球体周围将出现边界。若自动分割不准确，点击&#34;Delete&#34;&#160;或&#160;&#34;Add&#34;按钮，手动进行所需校正。对后续图像重复相同步骤。</li>
	<li>点击&#160;&#34;Tracking&#34;按钮为类球体编号，软件将为每个时间点图像中的同一类球体分配相同编号。然后点击&#34;Measurement&#34; 按钮，生成包含所有参数的电子表格。将此电子表格保存为Excel文件，用于后续在Excel软件中进行结果处理和统计分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

已有充分文献记载，具有复杂三维多细胞结构的生物体与常用的二维单层培养细胞存在显著差异，这凸显了在药物筛选中使用更能模拟生物体功能和生理过程的细胞模型的重要性。近年来，多细胞球体、类器官培养、类器官以及器官芯片等三维多细胞模型已被引入标准化药物发现流程中8。然而，三维多细胞模型的高度复杂性在很大程度上影响了其稳定性、并行化操作以及数据分析能力，而这些因素对于检测效率至关重要。
对侵袭能力的定量评估通常通过测量细胞穿过水凝胶材料的运动来进行。为了利用传统的微孔板测量肿瘤侵袭，通常将大量癌细胞接种于圆底孔板中，并通过离心迫使细胞聚集21,22。这类孔板限制了相邻孔之间细胞/类球体的相互作用，而圆底结构则影响光学质量，使成像过程变得复杂。在其他方法中，单个细胞被随机包埋于水凝胶内，在三维环境中生长并发挥功能，但并不一定发育成成熟的类球体23,<sup cla...

癌症死亡主要归因于转移性细胞扩散至远端部位。目前许多癌症治疗研究致力于靶向抑制或预防转移性病灶的形成以及系统性转移疾病的进展1。癌细胞迁移是肿瘤转移过程中的关键步骤，因此，研究癌症侵袭级联过程极为重要，也是发现抗转移治疗药物的先决条件。
使用动物模型作为研究转移性疾病的研究工具，往往成本高昂，且并不总能代表人类肿瘤的真实情况。此外，细胞外微环境的拓扑结构、力学特性及化学组成会显著影响癌细胞的行为2。由于体内（in vivo）模型本质上无法分离并控制影响癌症侵袭和转移的特定参数，因此迫切需要可调控的仿生体外（in vitro）模型。
为了转移至远端器官，癌细胞必须表现出可迁移和侵袭的表型特征，这些特征可作为治疗的靶点。然而，由于大多数体外癌细胞模型无法模拟实体瘤的真实特征3，因此检测具有生理相关性的表型极为困难。此外，肿瘤内部存在的表型异质性决定了必须在单个组分分辨率水平上分析肿瘤迁移，以发现针对特定表型的治疗方法，例如靶向异质性肿瘤中具有启动转移能力的细胞亚群4。
细胞运动性和集体迁移的研究主要在上皮细胞的单层培养体系中进行，这些体系通常建立在均质的平面基底上。这种传统的癌细胞迁移模型依赖于对穿过膜和细胞外基质（ECM）组分的单个细胞进行群体分析5，但在这些系统中，无法研究单个细胞之间的内在差异。通过支架材料或无支架的微结构生成三维球状体被认为是研究肿瘤细胞生长和癌症侵袭的更优方法6,7,8。然而，大多数三维系统不适用于高通量实验模式，且通常难以实现球状体之间的相互作用，因为每个微孔中生成的是彼此隔离的独立球状体9。近年来关于癌症迁移的研究多基于微流控装置3,10,11,12，但这些复杂的微流控工具制备困难，难以用于抗侵袭药物的高通量筛选（HTS）。
已证实存在两种主要的表型，即集体性迁移和单个细胞迁移，它们在肿瘤细胞突破细胞外基质（ECM）屏障并侵入邻近组织的过程中发挥重要作用13,14，每种表型均表现出独特的形态学特征以及生化、分子和遗传机制。此外，在每种表型中均可观察到两种迁移性肿瘤细胞形态，即成纤维细胞样和变形虫样。由于侵袭表型和迁移模式主要由形态学特性定义，因此需要建立能够实现基于成像技术对所有肿瘤侵袭形式及迁移细胞进行检测和分析的细胞模型。
本方法的总体目标是提供一种简单且可重复的仿生三维 体外 基于细胞的系统用于分析大量肿瘤球体的侵袭能力。本文介绍了基于HMCA的6孔成像板，用于肿瘤侵袭及抗转移治疗研究。该技术可在水凝胶微腔（MC）结构中形成大量均一的三维肿瘤球体（每孔450个）。通过向球体阵列中添加多种细胞外基质（ECM）成分，可支持细胞向周围环境侵袭。通过短期和长期连续观察同一单个肿瘤球体或侵袭细胞，可对侵袭过程进行持续监测，并实现形态学表征、荧光染色以及在任意时间点回收特定球体。由于大量球体共享空间和培养基，因此可通过可溶性分子介导球体间的相互作用，并研究其相互影响。通过自主研发的MATLAB代码进行半自动图像分析，可更快速、高效地收集大量数据。该平台能够以高效的时间成本，对大量肿瘤球体或侵袭细胞进行精确且同步的测量，适用于中等通量的抗侵袭药物筛选。

<table><tbody><tr><td>6 个带 14 mm 微孔和 #1.5 盖玻片的微孔玻璃底培养板</td><td>Cellvis</td><td>P06-14-1.5-N</td><td>用于HMCA压印的商用玻璃底板</td></tr><tr><td>UltraPure 低熔点琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>6% 琼脂糖溶液加热至 80 &amp;deg;使用前，将1%琼脂糖溶液加热至37℃ &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA溶液B</td><td>生物工业公司</td><td>03-052-1A</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前需冷藏</td></tr><tr><td>DMEM培养基，高糖</td><td>生物工业公司</td><td>01-055-1A</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前置于 C</td></tr><tr><td>特殊新生小牛血清（NBCS）</td><td>生物工业公司</td><td>04-122-1A</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>DPBS（10倍浓度），无钙，无镁</td><td>生物工业公司</td><td>02-023-5A</td><td>使用前保持在冰上</td></tr><tr><td>NaOH，无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>用于配制 1 M NaOH 溶液</td></tr><tr><td>来自大鼠尾部的Cultrex I型胶原蛋白，5 mg/mL</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>使用前置于冰上保存</td></tr><tr><td>透明质酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>使用前保持在冰上</td></tr><tr><td>漆黄素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>添加至培养基中的侵袭抑制剂</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>添加至培养基中的NO供体</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>在极低浓度下使用，无需洗涤步骤</td></tr><tr><td>Dymax 5000-EC 紫外线泛光灯完整系统（含光屏蔽罩） &amp;和 Dymax 400 瓦特 EC 电源</td><td>Dymax 公司</td><td>PN 39823</td><td>用于HMCA平板的紫外线灭菌</td></tr><tr><td>倒置IX81显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>用于自动图像采集</td></tr><tr><td>显微镜用培养箱</td><td>生命成像服务</td><td></td><td>对需要图像采集的延时实验至关重要，已预调至37℃ &amp;deg;C，5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 并维持湿润的环境</td></tr><tr><td>亚微米电动载物台类型 SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>用于预设图像采集区域，实现自动图像采集</td></tr><tr><td>14位，ORCA II C4742-98 冷却相机</td><td>滨松光子学</td><td></td><td>高度敏感，适用于成像</td></tr><tr><td>用于PI检测的荧光滤光片组</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>滤光片组参数：激发滤光片 530-550 nm，二向色镜 565 nm 长通，发射滤光片 600-660 nm</td></tr><tr><td>奥林巴斯 Cell^P 操作软件</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>用于控制显微镜、电动载物台、相机及图像采集的软件</td></tr><tr><td>Matlab R2014B 分析软件</td><td>Mathworks</td><td></td><td>用于开发内部图像分析图形用户界面</td></tr><tr><td>Excel 软件</td><td>微软</td><td></td><td>用于数据管理、计算、绘图及统计分析</td></tr></tbody></table>

基于水凝胶微室阵列（hmca）培养板的癌细胞侵袭分析与抗转移药物筛选

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

癌症转移被认为是导致90%癌症死亡的原因。转移是一个多阶段过程，起始于肿瘤细胞侵入邻近组织。因此，侵袭是转移过程中的关键步骤，使得对侵袭过程的研究以及抗转移药物的开发具有重要意义。为满足这一需求，亟需开发三维 体外 最接近地模拟实体瘤及其微环境结构的模型 体内 一方面要能够模拟肿瘤侵袭的复杂状态，同时又要具备可重复性、稳健性，并适用于高产量和高通量检测。目前大多数侵袭实验依赖于复杂的微流控技术，这类技术适用于基础研究，但不适合大规模药物筛选。其他基于孔板装置的实验通常在每个孔中仅放置单个类球体，耗材量大，且每种条件下的样本量较低。本实验方案的目标是建立一种简单且可重复的仿生三维细胞体系，用于大规模肿瘤类球体侵袭能力的分析。我们开发了一种基于HMCA成像板的三维侵袭模型，用于肿瘤侵袭研究及抗转移药物的筛选。该装置可在每个孔内生成大量均一的类球体（每种条件下的样本量高），并将其置于细胞外基质（ECM）成分中，同时实现对类球体的连续、同步观察与单个类球体水平的定量分析，适用于中等通量的抗转移药物筛选。本文以HeLa和MCF7类球体的制备为例，展示单细胞侵袭与集体性侵袭模式。我们比较了细胞外基质成分透明质酸（HA）对围绕HeLa类球体的胶原中侵袭能力的影响。最后，我们将漆黄素（Fisetin，侵袭抑制剂）作用于HeLa类球体，将一氧化氮（NO，侵袭激活剂）作用于MCF7类球体。实验结果通过自主开发的软件进行分析，该软件支持半自动、简便且快速的数据处理，便于多参数评估。

独特的HMCA成像板用于3D肿瘤球体的侵袭实验。整个实验过程，从球体形成到侵袭过程及后续操作，均在同一块板内完成。在球体形成阶段，将HeLa细胞接种至阵列基底中，细胞依靠重力沉降进入水凝胶微孔（MCs）。具有非黏附性/低黏附特性的水凝胶微孔可促进细胞间的相互作用，从而形成3D肿瘤球体。 图2A 显示细胞在使用 150 × 10 后沉降于 MCs 中3 细胞/毫升上样溶液（即，每个微腔（MC）约含16个细胞的计算值）。显然，每个微腔中的细胞占据数在阵列中分布并不均匀，统计得到的平均分布为每个微腔14.78 ± 3.60个细胞。表格中 图2B 总结了整个HMCA板上每个微腔（MC）的细胞分布情况。微腔内细胞分布的平均变异系数（CV）为43.33%，微腔间为24.37%。细胞占据率的差异至关重要，直接决定了所形成类球体的大小及其在整块板上的均一性。为了降低或最小化因每个微腔中细胞数量不同而带来的变异性，结果分析以单个单元...

介绍了一种基于HMCA的成像板，用于进行侵袭实验。该成像板可促进三维（3D）肿瘤类球体的形成，并可检测癌细胞向细胞外基质（ECM）中的侵袭。侵袭实验的定量通过半自动分析实现。

基于水凝胶微室阵列（HMCA）培养板的癌细胞侵袭分析与抗转移药物筛选

癌症转移被认为是导致90%癌症死亡的原因。转移是一个多阶段过程，始于肿瘤的穿透/侵袭……

这种可重复的仿生3D细胞系统旨在促进对大量肿瘤类球体的侵袭能力分析，用于抗转移药物筛选。我们水凝胶微室阵列的主要优势在于，它能够在每个孔中生成大量均匀的类球体，并使其位于同一焦平面上。由于水凝胶微室阵列的结构，即使在添加细胞外基质后，类球体的位置仍得以保持，从而便于对类球体及其侵袭过程进行精确的连续监测。此外，可对大量球状体及侵袭性细胞进行原位形态学表征和荧光染色，并以单细胞分辨率高效地完成分析。本实验中用于演示水凝胶微室阵列六孔成像板制备流程的是本实验室的Maria Sobolev。制备水凝胶微室阵列板时，首先将六个聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具预热至70摄氏度，并将一个六孔玻璃底板置于预热至75摄氏度的干浴中数分钟。当培养板变暖后，将400 µL预热的低熔点琼脂糖液滴加到六孔板每个孔的底部，然后轻轻将一个印章覆盖在每滴液滴上。室温下静置冷却5至10分钟，随后在4°C下继续冷却20分钟，以确保琼脂糖完全凝固。琼脂糖凝固后，从每个孔中轻轻剥离PDMS，留下带有微腔结构的琼脂糖凝胶。待紫外灯达到最高强度后，将压印好的芯片放入光固化系统中照射三分钟，并用无菌 PBS 填充经紫外灭菌的大型孔。然后盖上盖板，并用封口膜包裹，于 4 摄氏度保存备用。接种细胞时，先移除各孔中的 PBS，然后在每个多孔水凝胶阵列上轻轻加入 50 µL 目标细胞悬液。静置细胞使其依靠重力沉降15分钟后，小心地将6至8份每份500微升的新鲜培养基添加到宏孔塑料底部的环和水凝胶阵列外侧边缘处。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳及适当湿度条件下孵育适当时间，以形成球状体。随后，将球状体转移至冰上放置于生物安全柜中，静置10分钟。待培养板冷却后，将移液枪头靠在水凝胶阵列旁的宏孔塑料底部边缘，吸除阵列周围的所有培养基。随后，吸除阵列槽内的培养基，非常小心地将加样移液枪头靠在阵列槽边缘，注意不要扰动微腔室和类球体。接下来，使用预先冷冻的细移液枪头，逐次在阵列边缘分别加入两份150 µL感兴趣的胶原蛋白混合物，缓慢释放混合物以避免类球体移位。在向每个孔中加入第二轮胶原蛋白后，将球状体放回培养箱中孵育一小时，以确保细胞外基质完全凝胶化。当基质完全固化后，在凝胶上方轻轻加入400微升预热的1%低熔点琼脂糖，将培养板在室温下覆盖孵育5至7分钟，随后在4摄氏度下冷却2分钟，使琼脂糖完全凝胶化。然后，将移液器靠在宏孔塑料底部边缘，向每个孔中轻柔地加入2毫升完全培养基。进行侵袭实验时，将水凝胶微室阵列板装载到配备有37摄氏度、5%二氧化碳及加湿环境培养箱的电动倒置显微镜载物台上，使用4倍或10倍物镜预先确定每个孔中图像采集的位置，以确保覆盖整个阵列区域。随后，每2至4小时采集一次明场图像，持续24至72小时，以追踪细胞从类球体向周围细胞外基质的侵袭过程。图像采集结束后，从图像采集软件中导出延时图像，以标记图像文件格式（TIFF）保存至指定文件夹。接下来，打开图形用户界面，点击“加载明场图像”。调整图像的分割参数，以精确分割类球体及其侵袭区域，然后点击“感兴趣区域分割”，在每个类球体周围创建边界。如果自动分割结果不正确，可按“删除”或“添加”，并手动进行相应修正。单击“追踪”以对每个延时图像中的球状体进行编号。然后，单击“测量”以生成包含所有参数的电子表格，并将该电子表格保存为适合数据处理和统计分析的格式。为了研究透明质酸对HeLa细胞球状体自发侵袭过程的影响，在本实验中，将培养两天成熟的球状体覆盖于胶原蛋白与透明质酸混合溶液中，并与仅覆盖胶原蛋白溶液的两天成熟球状体进行比较。经过50小时的孵育后，嵌入胶原蛋白和透明质酸中的类球体相较于仅嵌入胶原蛋白中的类球体，向周围细胞外基质的细胞扩散程度更低。事实上，对99个类球体在单个类球体分辨率下进行侵袭面积随时间变化的动力学分析明确表明，在胶原蛋白中添加透明质酸可抑制细胞从类球体向外扩散，导致侵袭面积更小。将具有细胞抑制和迁移抑制特性的生物活性黄酮类化合物处理HeLa类球体培养物24小时后，与未经处理的HeLa类球体相比，其周围细胞扩散受到抑制。事实上，在实验结束时对488个类球体的侵袭区域进行分析，发现仅用10微摩尔药物处理即可显著抑制其侵袭。由于水凝胶具有低黏附特性，这种基于微腔室的技术即使在细胞数量极少的情况下也能促进类球体的形成。这对于数量有限且珍贵的肿瘤干细胞样细胞或患者来源的原代细胞样本尤为有利。水凝胶微室成像板可在长期实验中分析类球体的精确空间位置，从而在单个单元水平上评估侵袭过程，并提供高度的统计稳健性和准确性。该方法未来的应用包括在大孔内的不同区域并排共培养肿瘤细胞和基质细胞，以及回收单个类球体用于后续分子分析。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

用水凝胶微室阵列 (HMCA) 板进行肿瘤细胞侵袭和抗转移药物筛选的分析

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利用小鼠乳腺肿瘤细胞进行体外侵袭实验以评估癌细胞行为

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水凝胶阵列可提高三维肿瘤模型中基质组分与治疗药物筛选的通量

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CAM-去层化检测法通过量化癌细胞的去层化和侵袭能力来评估其转移特性

侵袭是癌症发生与进展过程中的一个重要生物学现象。该过程受到肿瘤微环境中非肿瘤性细胞及各种组分的影响。本研究旨在描述一种用于分析肿瘤细胞侵袭的替代方法 体外...

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