Name: 一种精确、自主的昆虫产生模式检测系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 了解一种用于昆虫行为学研究的自动化羽化检测系统。该系统利用Arduino微控制器和红外传感器，实现对大量昆虫羽化时间的精确测量，为生物钟学和应激生理学领域提供可靠的数据采集方法。

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我们感谢北达科他州法戈市的昆虫低温生物学与生态生理学研究组，他们对使用所述系统进行的实验提供了有益的反馈意见。

1. 系统构建
<ol>
	<li>使用 PLA 耗材打印每个待构建通道所需的以下数量的部件：1 个收集总管（collector_manifold.stl）、1 个端盖（end_cap.stl）、6 个平台支撑件（platform_support.stl）、4 个试管架底板（base_plate.stl）和 4 个试管架面板（face_plate.stl）。打印前请确保打印机平台足够大以容纳待打印物品。所有 *.stl 文件均可在补充数据中获取。</li>
	<li>取 3 个平台支撑件和一块 33 × 30 cm 的波纹塑料板，使用热熔胶按 图 2 所示为每个待构建通道组装 2 个试管架平台。可在波纹塑料板每个角落的一侧划痕，以便于弯折。</li>
	<li>将电子元件安装至收集总管中。
	<ol>
		<li>将一个 120 Ω 电阻焊接到红外发射器和红外探测器的阳极（较长引脚），并将约 5 cm 长的 22 号导线焊接到两个阴极上。使用不同颜色的导线以避免后续步骤中混淆。</li>
		<li>小心地将探测器插入收集总管的一个插槽中（图 3 中蓝色高亮部分），将发射器插入第二个插槽中（红色高亮部分）。两个组件应紧密贴合。</li>
		<li>将探测器的导线穿过布线通道（图 3 中黄色高亮部分），并将四根导线全部从接入孔中拉出（绿色高亮部分）。确保无裸露导线相互接触，并使用热熔胶将其固定。</li>
		<li>将四根导线焊接到 RJ45（以太网）插座的后排引脚上。两个阳极应焊接到最左侧引脚，发射器的阴极焊接到最右侧引脚，探测器的阴极焊接到中间两个引脚之一（图 4）。</li>
		<li>用热熔胶将 RJ45 插座固定在收集总管的接入孔上（图 3 中绿色高亮部分），确保总管内部无裸露导线相互接触。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按 图 5 所示构建落球收集器（每个待构建通道 1 个）
	<ol>
		<li>使用一个已接线的收集总管、一个端盖和一块 24 × 30 cm 的波纹塑料板，用热熔胶连接装置的底座部分（图 5 中红色、绿色和浅灰色部件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一块 8 × 27 cm 的波纹塑料板为收集器添加落球滑道（图 5 中深灰色部件）。端盖和收集总管的设计包含凸缘，以确保正确安装。检查滑道与收集器之间的过渡是否平滑，以避免使用过程中发生卡滞。</li>
	<li>构建系统的中央处理器（详见 图 6）。
	<ol>
		<li>为系统构建打印定制的印刷电路板。印刷电路板所需的所有文件均可在补充数据中获取。</li>
		<li>在标有以下安装位置的通孔上焊接母头排针：Arduino Nano、温度、时钟、SD 模块和液晶显示器（LCD）屏幕（PCB 板左上角未标注的 2 × 5 通孔区域）。</li>
		<li>沿 PCB 板下边缘卡入并焊接六个 RJ45 插座。</li>
		<li>将六个 470 kΩ 下拉电阻焊接到 RJ45 插座正上方的通孔位置。</li>
		<li>将 Arduino Nano、DHT 温湿度传感器、时钟和 SD 模块安装到 PCB 板上。DHT 温湿度传感器在实验使用前应进行测试，以确保其准确性。</li>
		<li>将一根 10 针带状电缆连接到 PCB 板上的 LCD 屏幕接口。将带状电缆的另一端焊接到 LCD 屏幕上，使屏幕引脚与 Arduino 引脚相对应，如 图 4 所示。有关 LCD 接线的更多详细信息，请访问 https://Learn.adafruit.com/character-lcds/wiring-a-character-lcd。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>系统编程
	<ol>
		<li>从 www.arduino.cc 下载并安装适用于正确操作系统的最新版本 Arduino IDE。</li>
		<li>首次使用时，安装实时时钟库（github.com/adafruit/RTClib）和温湿度传感器库（github.com/adafruit/DHT-sensor-library）。使用库中附带的 ds1307 脚本将时钟设置为当前本地时间。</li>
		<li>上传可在补充数据中获取的系统 Arduino 脚本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 系统使用
<ol>
	<li>按照图7所示组装系统。对于每个正在使用的通道，应在两侧各放置一个支架平台（在步骤5.1中组装）。使用包装胶带将部件固定在一起，并在支架平台上形成平滑的圆角边缘。</li>
	<li>配置未使用的通道以避免假阳性信号。由于该系统依赖低信号来检测事件（红外探测器未接收到红外发射器的信号），必须适当配置未使用的通道以防止出现假阳性信号。可通过以下两种方式之一实现：
	<ol>
		<li>在软件中通过注释掉对应于未使用通道的循环来停用这些通道。在Arduino IDE中，可通过在不需要的循环前添加“/*”并在其末尾添加“*/”来实现。</li>
		<li>通过简单的硬件调整来停用未使用的通道。只需将6号和8号导线（通常为市售cat 6网线中的纯棕色和纯绿色导线）焊接在一起，并插入中央处理器上的空RJ45插孔即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在开始实验前立即装载并放置试管架。
	<ol>
		<li>确保所有孔位均插入一个已去盖的0.5 mL微量离心管，且试管安装紧密。</li>
		<li>在每个试管中依次放入一个昆虫幼虫巢室、蛹壳或茧、一个软气枪弹丸，最后放入一个金属BB弹。确保巢室的平面边缘侧（盖端）朝向软气枪弹丸和金属BB弹。使用¼英寸尼龙螺钉将试管架面板固定，面板的圆角边缘朝向支架底部。</li>
		<li>将试管架放置在支架平台上，开口朝向落球收集器。试管架应置于平台最边缘处，以便金属BB弹可自由落入收集器中，而不会撞击结构的其他部分（图7）。放置试管架时，先使其开口朝上，然后轻轻旋转到位，以确保金属BB弹不会意外释放。试管架设计为在正确放置时试管略微向后倾斜，从而降低金属BB弹意外释放的可能性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将SD卡插入适配器，然后通过将micro-USB连接线一端插入Arduino，另一端插入任意合适的USB电源适配器来启动中央处理器。当系统就绪时，LCD屏幕将显示数字1至6。将单个金属BB弹投入每个通道的球收集器中，观察屏幕上是否出现相应的计数以及屏幕底部是否显示正确的时间。
	<ol>
		<li>如果未显示正确时间，请重复步骤1.6.3和1.6.4以重置时钟。</li>
		<li>如果测试用金属BB弹未被记录，则说明收集器被堵塞。请目视检查是否存在堵塞并重新启动系统。</li>
		<li>如果某个通道每秒自动“计数”一次，则表明该通道连接不正确。请检查所有连接并重新启动系统。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 实验结束与数据分析
<ol>
	<li>当羽化结束时（参见结果部分以及图8和图9中的时间尺度示例），通过拔掉Arduino电源关闭设备。支架可拆卸并清洗后重复使用。</li>
	<li>实验期间，数据以逗号分隔文件（CSV）格式存储在SD卡中，可通过R编程语言读取。使用SD卡将数据传输至计算机，并利用RStudio自动生成数据的气泡图。
	<ol>
		<li>为保证数据完整性，事件数据和温度数据保存在同一文件中。因此，在分析前需进行一定的数据处理。将逗号分隔文件导入电子表格程序。其中I列和J列记录了蜜蜂羽化的日期和时间；通过将A至E列剪切并粘贴到另一个电子表格中，使其成为新的A列和B列，并另存为独立文件，该文件即为温度数据文件。</li>
		<li>将A列标题设为“日期”，B列标题设为“时间”，然后按A列、再按B列对数据进行排序。保存为CSV文件。</li>
		<li>从https://www.r-project.org/下载并安装最新版本的RStudio。有关使用RStudio上传和分析数据的帮助，请访问https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.html。</li>
		<li>使用补充数据中提供的R脚本，将数据导入RStudio。修改R脚本中的工作路径，使其与Excel生成的*.CSV文件所在位置一致。运行脚本并选择待分析的数据文件。在R控制台中输入“plot”。高分辨率图像将保存在工作路径下的“High-res”文件夹中；请重命名该文件，以保存为高分辨率TIFF（300 dpi）格式文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lankinen, P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00612503">Geographical variation in circadian eclosion rhythm and photoperiodic adult diapause in Drosophila littoralis.</a> Journal of Comparative Physiology A. 159, 123-142 (1986).</li>
<li>Watari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+circadian+eclosion+rhythm+between+non-diapause+and+diapause+pupae+in+the+onion+fly%2C+Delia+antiqua%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the circadian eclosion rhythm between non-diapause and diapause pupae in the onion fly, Delia antiqua.</a> Journal of Insect Physiology. 48, 83-89 (2002).</li>
<li>Zimmerman, W. F., Pittendrigh, C. S., Pavlidis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+compensation+of+the+circadian+oscillation+in+Drosophila+pseudoobscura+and+its+entrainment+by+temperature+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temperature compensation of the circadian oscillation in Drosophila pseudoobscura and its entrainment by temperature cycles.</a> Journal of Insect Physiology. 14, 669-684 (1968).</li>
<li>Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Yocum, I. S., Kemp, W. P., Greenlee, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoperiodism+synchronizes+emergence+in+the+alfalfa+leafcutting+bee+%28Hymenoptera%3A+Megachilidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Thermoperiodism synchronizes emergence in the alfalfa leafcutting bee (Hymenoptera: Megachilidae).</a> Environmental Entomology. 45, 245-251 (2016).</li>
<li>Bennett, M. M., Rinehart, J. P., Yocum, G. D., Doetkott, C., Greenlee, K. J. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/early/2018/04/09/jeb.175406.abstract">Cues for cavity nesters: Investigating relevant Zeitgebers for emerging leafcutting bees, Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae).</a> Journal of Experimental Biology. 221, jeb175406(2018).</li>
<li>Miyazaki, Y., Goto, S. G., Tanaka, K., Saito, O., Watari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoperiodic+regulation+of+the+circadian+eclosion+rhythm+in+the+flesh+fly%2C+Sarcophaga+crassipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thermoperiodic regulation of the circadian eclosion rhythm in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis.</a> Journal of Insect Physiology. 57, 1249-1258 (2011).</li>
<li>Watari, Y., Tanaka, K. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/ens.12034">Effects of background light conditions on thermoperiodic eclosion rhythm of onion fly Delia antiqua.</a> Entomological Science. 17, 191-197 (2014).</li>
<li>Greenberg, S. M., Armstrong, J. S., Setamou, M., Coleman, R. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7917.2006.00116.x">Circadian rhythms of feeding, oviposition, and emergence of the boll weevil (Coleoptera: Curculionidae).</a> Insect Science. 13, 461-467 (2006).</li>
<li>Yocum, G. D., Zdarek, J., Joplin, K. H., Lee, R. E., Smith, D. C., Manter, K. D., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022191094901074">Alteration of the eclosion rhythm and eclosion behavior in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis, by low and high temperature stress.</a> Journal of Insect Physiology. 40, 13-21 (1994).</li>
<li>Winfree, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+view+of+resetting+a+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated view of resetting a circadian clock.</a> Journal of Theoretical Biology. 28, 327-374 (1970).</li>
<li>Watari, Y., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+effect+of+thermoperiod+and+photoperiod+on+the+eclosion+rhythm+in+the+onion+fly%2C+Delia+antiqua+supports+the+two-oscillator+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interacting effect of thermoperiod and photoperiod on the eclosion rhythm in the onion fly, Delia antiqua supports the two-oscillator model.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1192-1197 (2010).</li>
<li>Short, C. A., Meuti, M. E., Zhang, Q., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+eclosion+and+preliminary+ontogeny+of+circadian+clock+gene+expression+in+the+flesh+fly%2C+Sarcophaga+crassipalpis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Entrainment of eclosion and preliminary ontogeny of circadian clock gene expression in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis.</a> Journal of Insect Physiology. 93, 28-35 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种用于组装和使用昆虫羽化时间精确测量系统的方案。该系统解决了以往设计中存在的两个问题：部分自动化程度不足以及样本量受限。我们通过采用微控制器实现数据采集的自动化，解决了上述问题，同时也能够利用多通道设计增加样本量。当前的设计包含六个通道，总共可容纳1200只蜜蜂。根据需要，可增减通道数量，这不仅有助于进一步扩大样本量，还可同时研究多种处理因素的影响。下文将讨论该系统的关键步骤、改进措施、局限性以及未来应用前景。
该系统中唯一未实现自动化的部分是在实验开始时将育虫巢房、金属弹珠和软气枪弹丸装入支架。尽管支架设计为略微向后倾斜，以防止支架直立时金属弹珠掉落，但在放置支架时仍需小心，避免金属弹珠意外脱落。此外，应确保支架与架子边缘对齐，使金属弹珠下落轨迹与滑道保持一致。最后，需清除滑道上的落叶碎屑，并清理之前实验遗留的、用于承载金属弹珠的底座部分，以防传感器被堵塞。数据会以CSV文件格式自动记录到SD卡中，且Arduino程序编写为仅在检测到SD卡时才会运行。数据文件需手动导入RStudio，并使用前述R脚本进行可视化处理。该脚本将自动以气泡图形式绘制数据，并识别出羽化时间的中位数及对应的日期。Arduino程序被编写为将事件数据追加至文件末尾，从而在断电情况下防止数据丢失。然而，这也意味着一旦从SD卡中导出数据，在开始下一次实验前必须清除所有文件。
可以对 SketchUp 文件进行修改，以调整适用于不同体型昆虫的架子尺寸，并在修改后的架子中使用不同尺寸的试管。此外，软气枪弹丸的尺寸也很重要，因为它能防止昆虫离开试管，因此可能还需要不同尺寸的弹丸。还可以对 R 脚本进行多种修改，以改变气泡图的外观及其他图形参数。
我们通过编写去抖动代码来降低假阳性风险，该代码在检测到金属弹丸后会将相应通道禁用一秒，从而防止单个金属弹丸被计为多个数据点。尽管如此，若大量蜜蜂同时出巢，仍有可能遗漏部分数据点，但由于各通道相互独立，这一风险得以降低。当前系统的另一局限性在于无法区分单个数据点。 即， 一颗下落的金属BB弹无法追溯到特定个体。此外，当前系统可测量羽化出现情况，但无法测量羽化节律 M. rotundata但可用于羽化与出茧同义的物种来测量其羽化节律。最后，当前设计不具备防水防天气功能，限制了其在受控环境之外的使用。
未来的研究应用包括探究其他非生物和生物环境信号对M. rotundata成虫羽化时机的调控作用。此外，由于昆虫栖息于多种多样的环境，不同物种所依赖的关键环境信号也各不相同。因此，纳入更多昆虫物种对于研究昼夜节律系统在不同分类群中的演化过程具有重要意义。目前关于发育条件如何影响成虫羽化时间的知识仍十分有限，因此本系统可用于解析各种处理对羽化过程的影响。此外，多种环境信号的组合可能共同影响昆虫的生理响应，因此未来的实验应整合多种环境信号，以明确它们对羽化节律的相对作用。最后，将该系统应用于野外环境，观察自然条件下羽化节律的调控机制，也具有重要的研究价值。该系统操作简便，且独特地结合了增材制造、开源编程与可观察的生物学性状，具备在教育环境中推广应用的潜力。

在实验条件下精确测量陆生昆虫羽化时间具有较高难度，需要一定程度的自动化。过去已设计出多种装置，其中一些采用&#34;落球&#34;原理，利用下落小球与传感器进行检测，另一些则采用&#34;撞击盒&#34;结构，使用漏斗型系统1,2,3。现有设计存在两个局限性：1）数据采集仅部分实现自动化；2）可检测的样本量或羽化昆虫数量受限。这些问题降低了数据采集的精确性，而精确性对于研究羽化和/或出蛰节律至关重要。为解决上述问题，我们设计了一套自动化且不受样本量限制的系统，使研究者能够更清晰地观察昆虫羽化节律对环境信号的响应。
我们的系统对落球原理进行了改进，此前最新版本采用红外传感器以六分钟为间隔检测昆虫羽化2。我们的系统仍然使用红外传感器，但 additionally 引入了 Arduino 微控制器，可将每次羽化事件的日期和时间精确记录到秒。数据会自动存储至安全数字（SD）卡中，可导出为逗号分隔文件用于分析。通过使用定制的 R 脚本实现分析自动化，该脚本可将数据绘制成气泡图，并确定羽化的中位时间与中位日期。
多个通道使用户在数据采集方面具有更高的灵活性。例如，我们的多通道设计不仅能够最大限度地减少&#34;堵塞&#34;传感器带来的影响，还可用于增加样本量。此外，多个通道允许用户将不同处理指定到特定通道，从而在实验中同时运行。使用全部六个通道，单次实验可记录约1200只羽化的蜜蜂。据我们所知，这是目前测量昆虫羽化系统中最大的样本量，使我们能够观察到蜜蜂羽化对环境线索响应的精细模式。最后，本系统的大部分部件采用3D打印制造，这一特点带来了显著优势。3D打印可制造出尺寸精确的组件，从而降低运行过程中发生错误（如探测器堵塞）的可能性，同时也便于针对其他研究系统进行定制化改造。
本实验方案的目的是定制构建一个精确且自动化的系统，用于测量昆虫羽化，以研究昼夜节律生物学和应激生理学中的相关问题。该系统在探究昆虫羽化模式对环境信号响应所涉及的未解问题方面，过去至关重要，未来也将持续发挥关键作用。本文详细描述了该系统在实验室实验条件下用于苜蓿切叶蜂（Megachile rotundata）羽化检测的组装与使用方法。该系统采用可编程微控制器实现自动化，并通过3D打印部件实现可定制化。打印的支架用于固定装有蜜蜂巢室的试管，管内放置金属弹丸。当昆虫羽化时，金属弹丸从支架中释放，穿过红外传感器，传感器将羽化的日期和时间记录到SD卡中。当前设计主要针对M. rotundata优化，但经过少量调整后，也可适用于其他昆虫物种。

<table><tbody><tr><td>PLA 打印机线材</td><td>www.lulzbot.com</td><td>多种</td><td>目录编号因颜色而异</td></tr><tr><td>0.5 mL 微型离心管</td><td>www.daigger.com</td><td>EF4254C</td><td></td></tr><tr><td>4.5 mm 规格 &quot;bb&quot; 金属弹丸</td><td>www.amazon.com</td><td>B00419C1IA</td><td>Daisy 4.5 mm 金属 bb 弹丸</td></tr><tr><td>6.0 mm 塑料 &quot;软气枪&quot; 弹丸</td><td>www.amazon.com</td><td>B003QNELYE</td><td>Crosman 6 mm 软气枪弹丸</td></tr><tr><td>塑料波纹板</td><td>www.lowes.com</td><td>345710</td><td>波纹塑料板</td></tr><tr><td>红外发射/检测对管</td><td>www.amazon.com</td><td>B00XPSIT3O</td><td>直径 5 mm，波长 940 nm</td></tr><tr><td>120 欧姆电阻</td><td>www.amazon.com</td><td>B01MSZK8DV</td><td>120 欧姆，1/4 瓦</td></tr><tr><td>22 号连接导线</td><td>www.adafruit.com</td><td>1311</td><td></td></tr><tr><td>RJ45 插口</td><td>www.sparkfun.com</td><td>PRT-00643</td><td></td></tr><tr><td>定制 PCB 板</td><td>www.pcbexpress.com</td><td>n/a</td><td>可使用补充数据中包含的文件进行打印</td></tr><tr><td>Arduino Nano v 3.0</td><td>www.roboshop.com</td><td>RB-Gra-01</td><td></td></tr><tr><td>SD 卡模块</td><td>www.amazon.com</td><td>DFR0071</td><td>DFRobot SD 卡模块</td></tr><tr><td>实时时钟模块</td><td>www.adafruit.com</td><td>264</td><td>DS1307 实时时钟分线板</td></tr><tr><td>温湿度传感器</td><td>www.tinyosshop.com</td><td>G4F4494F29ED05</td><td>安装在分线板上的 DHT11 温湿度传感器</td></tr><tr><td>470k 欧姆电阻</td><td>www.amazon.com</td><td>B00EV2R39Y</td><td></td></tr><tr><td>母头排针</td><td>www.adafruit.com</td><td>598</td><td>按所需长度截断</td></tr><tr><td>公头排针</td><td>www.adafruit.com</td><td>392</td><td>按所需长度截断</td></tr><tr><td>带状电缆</td><td>www.amazon.com</td><td>B00X77964O</td><td>带连接器的 10 芯带状电缆</td></tr><tr><td>LCD 屏幕</td><td>www.adafruit.com</td><td>198</td><td></td></tr><tr><td>Cat6 网线</td><td>www.amazon.com</td><td>B00N2VISLW</td><td></td></tr><tr><td>SD 卡</td><td>www.amazon.com</td><td>B00E9W1URM</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于检测昆虫羽化模式的精确自主系统

A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

现有的昆虫羽化模式监测系统存在局限性：它们仅部分实现了自动化，且能够检测的羽化昆虫数量有限。为了精确测量昆虫羽化情况，相关系统需要实现半自动化，并具备测量大量羽化昆虫的能力。我们通过设计并构建一种可自动化运行、最多可监测1200只昆虫羽化的系统，解决了上述问题。我们利用Arduino微控制器对现有的&#34;落球&#34;系统进行了改进，实现了数据采集的自动化，并通过多个数据通道扩大了样本量。多个数据通道不仅使用户能够增加样本量，还可在单次实验中同时进行多种处理组的测试。此外，我们编写了R语言脚本，可自动将数据以气泡图形式可视化，并计算羽化的中位日期和时间。当前系统采用3D打印技术制造，用户可根据不同昆虫物种的需求对系统进行调整和修改。本实验方案的目标是利用这一精确且自动化的系统，研究时间生物学和应激生理学领域中的重要科学问题。

出现 M. rotundata 在没有环境信号刺激的情况下是异步的，羽化在整个白天均匀发生4。然而，当暴露于方波温度周期（square-wave thermoperiod）时4° C 热周期），出苗与热相保持同步4,5该结果与其他研究相似，这些研究发现昆虫会利用温度周期线索来调节羽化，包括蝇科昆虫 Sarcophaga crassipalpis6，葱蝇 Delia atiqua7 以及棉铃象鼻虫 Anthonomus grandis grandis8一项研究显示，发育期间的胁迫会影响成虫羽化的同步性 S. crassipaplpis9. 这里，我们展示来自 M. rotundata 在发育期间暴露于胁迫环境下的个体，用于检验该处理会导致成虫羽化不同步的假设。
运行成功
在打开培养箱之前，用户应观察LCD屏幕，以确认昆虫已不再羽化。实验完成后，取出SD卡，并将数据以逗号分隔文件的形式导出至RStudio，按前述方法以气泡图形式进行可视化。图8展示了蜜蜂在发育期间经历低温胁迫后，在4°C热周期下的羽化情况。红色十字线表示羽化时间与日期的中位数，文件名即为图表标题。应使用该R脚本对数据进行可视化，但不应将其作为唯一的分析方法。如需分析羽化对环境信号的响应，可对数据进行节律性分析（参见分析部分）。
并发症
当传感器被金属弹丸堵塞时，由于信号缺失会被反复记录，从而产生多个错误数据点。 图9 展示了同一数据集的呈现 图8，但由于其中一个六通道被钢珠堵塞，因此在图中形成了较大的气泡。若传感器发生堵塞，可轻松将该通道的数据从分析中移除。在实验中整合多个通道有助于最小化堵塞传感器带来的影响。
分析
通过计算标量统计量“参数 R”来分析数据中是否存在同步性，可判断羽化现象是节律性还是非节律性的10,11,12。具体方法是：先计算在8小时时间窗内羽化的成虫最大数量，再除以该时间窗外羽化的成虫数量，然后乘以100。应汇总所有羽化的个体，以统计每日每小时的羽化数量。参数 R 的理论取值范围为0（所有羽化均发生在时间窗内）到200（羽化在整个一天中均匀分布）10。R 值 < 60 被认为是节律性羽化，60 < R < 90 为弱节律性，R > 90 为非节律性。R 值 > 150 表示羽化呈均匀分布10。图8 显示羽化具有节律性，参数 R = 20.21 < 60。由于此类数据围绕一个重复的24小时周期分布，因此必须采用圆形统计方法进行更稳健的分析（详见 Bennett et al., 20185）。该方法可通过 RStudio 中可用的圆形统计软件包实现（Package 'circular' - CRAN.R-project.org）。
<img alt="实验室支架组件示意图：歧管、端盖、平台支撑、支架板。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：增材制造组件。 使用PLA线材，通过3D打印制备系统所需的各个部件。每构建一个通道，所需部件包括1个收集歧管（绿色）、1个端盖（红色）、6个平台支撑（橙色）、4个试管架底板（紫色）和4个试管架面板（黄色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="展示静力平衡和载荷分布原理的桁架桥设计示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：试管架平台组装示意图。 每构建一个通道，需使用热熔胶组装两个试管架平台。每个平台使用三个支撑件（图中橙色部分）和一段波纹塑料板（图中灰色部分）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于光激发研究的激光束路径光学腔装置示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：集流管X射线图。 将一个红外探测器插入集流管的一个插孔中（图中蓝色所示），将发射器插入第二个插孔中（图中红色所示）。将探测器导线穿过布线通道（图中黄色所示），并将四根导线全部从通孔中拉出（图中绿色高亮所示）。确保无裸露导线相互接触，并使用热熔胶将其固定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Arduino电路连接图及引脚连接表；用于数字显示的电子装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：连接器接线。 在将RJ45插座安装到集流管之前，从插座底部观察的接线图，以及将LCD屏幕连接至中央处理器的接线表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于光谱分析和光激发实验的激光光学实验室装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：小球收集器组件。 使用一个端盖（图中红色部分）、一个收集器歧管（图中绿色部分）以及一块 24 × 30 cm 的波纹塑料板（图中浅灰色部分），组装成小球收集器组件的外壳。使用一块 8 × 27 cm 的波纹塑料板（图中深灰色部分）制作一个斜坡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="用于集成SD模块和时钟的温度监测Arduino Nano电路图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：中央处理器PCB板。 中央处理器的PCB板包含底层（以绿色表示）、顶层（以红色表示）和丝印层（以蓝色表示）。除RJ45接口（位于底部）和下拉电阻（位于RJ45焊盘正上方）的通孔外，其余所有通孔均需焊接母头排针。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="离心管架装置、用于样品管理的实验设备、3D打印结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：最终组装示意图。 使用时，应在每个弹珠收集器两侧安装管架平台。带有固定面板的管架应放置在管架平台的最边缘处，以减少弹珠弹跳脱离装置的可能性。组装后装置的占地面积约为 25 cm × 35 cm，高度为 20 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="每日活动计数随时间变化的气泡图；数据可视化，时间序列分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：在R中处理后的典型实验运行结果图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示时间数据分布的气泡图；气泡大小表示8天内的计数频率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：一项实验的结果图，第4天出现较大气泡，表明检测器发生堵塞。 堵塞的通道可从分析中剔除，从而保留其余数据点。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

测量昆虫羽化模式需要精确性。现有的系统仅能实现半自动化，且样本量受限。我们通过设计一种使用微控制器的系统，精确测量大量羽化昆虫的羽化时间，解决了这些问题。

现有的昆虫羽化模式测量系统存在局限性：它们仅实现部分自动化，且在最大数量的……方面受到限制

该方法有助于解答生物钟学和应激生理学领域的关键问题，例如哪些信号会影响昆虫羽化的时机。该技术的主要优势在于其自动化特性，可用于测量大量昆虫的羽化情况。构建每个通道时都需要以下部件。一个收集管总成、一个端盖、六个平台支架、四个试管架底板和四个试管架面板。每构建一个通道，使用三个平台支架和一块33厘米×30厘米的波纹塑料板，用热熔胶组装两个试管架平台。安装电子元件到收集管总成时，首先将一个120欧姆的电阻焊接到红外发射器和红外探测器的阳极，并将一段5厘米长的22号电线焊接到两者的阴极。将检测器小心插入收集歧管的一个接口，将发射器插入第二个接口。两个组件均应紧密贴合。将检测器的导线穿过布线通道，并从接入孔中拉出两根导线。使用后排引脚将四根导线全部焊接到RJ45以太网接口上。两个阳极应焊接到最左侧的引脚，发射极的阴极焊接到最右侧的引脚，探测器的阴极焊接到中间两个引脚中的任意一个。使用热熔胶将RJ45接口固定在集流管的访问孔上，确保集流管内部没有裸露的导线相互接触。接下来，通过在标有 Arduino nano、温度、时钟和 SD 模块的通孔上焊接母头排针，开始构建系统的中央处理器。同时，在 PCB 板左上角未标记的 2×5 通孔上焊接一个母头排针，用于连接液晶显示屏。沿 PCB 板的下边缘插入并焊接六个 RJ45 接口插座。将六个 470 千欧的下拉电阻焊接到位于 RJ45 接口正上方的通孔位置。将 Arduino Nano、DHT 温湿度传感器、时钟和 SD 模块安装到 PCB 板上。最后，将十针连接器排线连接到 PCB 板的 LCD 屏幕接口。检测系统组装完毕后，在开始实验前立即装载并放置两个支架。首先，确保支架上的每个孔中都装有一支0.5毫升的微型离心管，且管盖已取下，试管应紧密贴合。每支试管中放入一个昆虫幼虫巢室，注意使其平边一侧朝向开口方向。然后加入一颗软气枪弹丸，最后放入一颗金属BB弹。使用1/4英寸尼龙螺丝将试管架面板固定，确保圆边朝向试管架底部。将试管架放置在支架平台上，初始时使开口朝上，然后轻轻旋转到位，以确保金属BB弹不会脱落。应将支架放置在平台边缘，以便金属弹丸能够自由落入收集器中，而不会撞击到结构的其他部分。将SD卡插入适配器，然后通过将micro-USB连接器一端插入Arduino，另一端插入任意合适的USB适配器，启动中央处理器。就绪后，LCD屏幕将显示数字1至6。将一颗金属小球放入每个通道的球收集器中，观察屏幕上出现的相应计数以及屏幕底部显示的正确时间。待所有昆虫羽化后，通过拔下 Arduino 电源来关闭设备。支架可拆卸并清洗，以便重复使用。在萌发实验过程中，数据以逗号分隔的文件格式存储在SD卡中。使用SD卡将数据传输至计算机，并利用RStudio自动生数据的气泡图。事件数据和温度数据均保存在同一文件中，以确保数据完整性。分析前，将逗号分隔的文件导入电子表格程序。I 列和 J 列为蜜蜂羽化的日期和时间。通过将 A 至 E 列剪切并粘贴到另一个电子表格中，使其成为 A 列和 B 列，并另存为一个独立的温度数据文件以供进一步分析。该图显示了蜜蜂在发育期间经历低温胁迫后，在4°C热周期条件下的羽化情况。此图展示的数据集与刚才看到的相同，但六条通道中有一条被BB弹堵塞，导致图中出现一个较大的气泡，这是因为信号缺失被反复计数所致。该通道的数据可合理地从分析中剔除。在进行该操作时，重要的是要检查所有焊接部件，确保连接正常工作。该技术建立后，为研究独居蜂羽化时间调控因素的生物钟生物学和应激生理学领域的研究人员提供了新的探索途径。

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环境

一种精确、自主的昆虫产生模式检测系统

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来自蛾类嗅觉系统的电生理学测量

我们介绍一种在烟草天蛾（Manduca...

早期变态期植入技术用于昆虫飞行行为监测

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我们提出了一种系统，该系统利用廉价、非侵入性的伪声学光学传感器，根据飞行昆虫的飞行声音，自动且准确地检测、计数并分类飞行昆虫。...

利用低成本传感器进行飞行昆虫的检测与分类

定位气味源的能力对昆虫的生存至关重要，并有望应用于人工气味追踪。由真实蚕蛾控制的机器人能够通过机器人平台评估昆虫的气味追踪能力。...

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SwarmSight：利用常规制备方法和普通硬件实时追踪昆虫触角运动与喙伸反射

针对有害生物和病媒昆虫的公共卫生杀虫剂在不同生态区域中的效果并不一致。本文介绍了一套利用圈养病媒昆虫作为杀虫剂效果监测哨兵的技术体系，以生成电子地图，支持在多种环境中对杀虫剂进行标准化评估。...

在野外可视化评估杀虫剂对病媒蚊虫的防治效果

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基于丝蛾触角的电触角图谱生物混合型嗅探无人机用于气味源定位

为了研究夜间人工光照（ALAN）对夜行性飞行昆虫的影响，采样必须限定在夜间进行。本方案描述了一种低成本的自动化飞行拦截陷阱，可让研究人员在自定义的时间段内进行采样，并提高重复性。...

低成本自动化飞行昆虫拦截陷阱，用于夜间趋光性飞行昆虫的时间亚采样

该方案展示了一种简单易行的解剖方法，适用于利用探照灯诱捕器捕获的野生型迁徙雌性昆虫。通过比较野生型雌性昆虫的交配囊和卵巢发育情况，该技术可显著提高对同种昆虫的鉴别准确性。...

野生型雌性昆虫卵巢发育的解剖与分级

本方案介绍了用于昆虫的谐波雷达标签的制备、附着与追踪方法。...

用于昆虫追踪的谐波雷达标签：轻量化、低成本且易于获取

了解一种用于昆虫行为学研究的自动化羽化检测系统。该系统利用Arduino微控制器和红外传感器，实现对大量昆虫羽化时间的精确测量，为生物钟学和应激生理学领域提供可靠的数据采集方法。

一种用于检测昆虫羽化模式的精确自主系统

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