Name: 不同二硫 Connectivities µ-芋螺毒素 PIIIA 异构体的合成与结构测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 了解选择性合成含二硫键多肽异构体的方法，通过固相合成、NMR和MS/MS技术进行结构表征。该方法有助于研究二硫键连接方式对多肽三维结构和功能的影响。

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我们感谢不来梅布鲁克公司（Bruker Daltonics GmbH Bremen）的 A. Resemann、F. J. Mayer 和 D. Suckau；达姆施塔特工业大学的 D. Tietze、A. A. Tietze、V. Schmidts 和 C. Thiele；耶拿弗里茨·利普曼研究所（FLI Jena）的 O. Ohlenschläger；波恩大学的 M. Engeser；科隆马克斯·普朗克植物育种研究所的 K. Kramer、A. Harzen 和 H. Nakagami；科隆动物学研究所的 Susanne Neupert；以及法兰克福大学生物分子磁共振波谱设施在技术支援、培训模块和仪器使用方面提供的帮助。同时感谢波恩大学为 D.I. 提供的经费支持。

注意：本文所用的所有氨基酸均为L-构型。氨基酸及氨基酸衍生物的缩写遵循国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会（IUB）及国际纯粹与应用化学联合会-国际生物化学联合会生化命名联合委员会（IUPAC-IUB）的推荐标准。
1. 固相多肽合成（SPPS）
注意：使用固相多肽合成仪进行合成。采用9-芴甲氧羰基（Fmoc）化学的标准方案，合成通序列为ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2的线性多肽前体。使用以下保护氨基酸：Pyr(Boc（叔丁氧羰基）)、Arg(Pbf（2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基）)、Asn(Trt)、Asp(tBu)、Hyp(tBu)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Gln(Trt)、Glu(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)、Thr(tBu)和His(Trt)。根据预期的二硫键连接方式，用Trt、Acm或tBu基团对半胱氨酸成对进行保护。
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>使用冻干机将Fmoc Rink-酰胺树脂（载量：0.28 mmol/g）干燥过夜。</li>
		<li>在合成仪程序中输入所需的肽序列（单字母编码）。程序将计算每种试剂所需的量，并提示溶剂的用量。</li>
		<li>根据方案称取各试剂（氨基酸、HBTU（2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐）），溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，配制成终浓度为 0.6 的溶液&#160;M（氨基酸）和 0.6 M（HBTU）， respectively。</li>
		<li>将不同的试剂（氨基酸、HBTU、N-甲基吗啉（NMM，50% DMF溶液）、哌啶（20% DMF溶液）、DMF、二氯甲烷（DCM））转移至相应的容器中，并放置于固相多肽合成仪的相应试剂架上。</li>
		<li>向反应柱中加入100 mg干燥树脂&#160;并将它们放入合成仪的反应架中。启动固相多肽合成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SPPS-实验方案（由合成仪提供） 
	注意：标准方案通常适用于将100 mg树脂（载量：0.53 mmol/g）加入一个反应柱中，进行53 μmol规模的反应，对应的试剂当量为：HBTU 5当量，NMM 10当量，氨基酸5当量。然而，对于PIIIA，采用载量为0.28 mmol/g（28 μmol规模），因此导致所指定的较高当量。
	<ol>
		<li>树脂的制备
		<ol>
			<li>用2500 µL DMF、1400 µL DCM和1400 µL DMF冲洗树脂。</li>
			<li>用空气冲洗树脂，直至去除溶剂，再用 2500 µL DMF 洗涤树脂。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Fmoc 保护基的裂解
		<ol>
			<li>向树脂中加入20%哌啶的DMF溶液（1000 µL），反应6分钟。去除树脂中的溶液。重复步骤1.2.2.1。</li>
			<li>用DMF冲洗两次（1st 4000 µL，2nd1400 µL），用空气冲洗树脂直至溶剂完全去除，再用2000 µL DMF冲洗两次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>偶联反应
		<ol>
			<li>在另一反应管中混合以下试剂：HBTU（415 µL；0.6 M DMF 溶液；249 µmol；9 当量）、NMM（112 µL；50% DMF 溶液；510 µmol；18 当量）、Fmoc-氨基酸（420 µL；0.6 M DMF 溶液；252 µmol；9 当量）。将混合液加入树脂中，静置 13 分钟。移除树脂中的溶液。重复步骤 1.2.3.1。</li>
			<li>用 3000 µL DMF 洗涤。用 1400 µL DMF 洗涤两次。用 2000 µL DMF 洗涤两次。</li>
			<li>根据肽序列中氨基酸的数量，重复步骤 1.2.2 和 1.2.3。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>最终Fmoc脱保护及树脂洗涤
		<ol>
			<li>向树脂中加入20%哌啶的DMF溶液（1000 µL），静置6分钟。移除树脂中的溶液。重复步骤1.2.4.1。</li>
			<li>用DMF冲洗两次（1st 4000 µL，2nd 1400 µL），并用空气冲洗树脂。用2000 µL DMF洗涤两次，用1400 µL DCM洗涤四次，每次均用空气冲洗两次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>后处理
	<ol>
		<li>合成完成后，将反应柱中的树脂在室温下真空干燥过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肽段从树脂上的裂解（图1A）
注意：在裂解过程中，除 Cys(Acm) 和 Cys(tBu) 外，所有氨基酸侧链将被脱保护。该方案适用于 100 mg 树脂。
<ol>
	<li>将冻干树脂放入12 ml离心管中，并置于冰上冷却至0 °C。</li>
	<li>将150 µL裂解液混合物（由0.75 g苯酚、0.5 mL硫代苯甲醚、0.25 mL乙二硫醇配制而成）和1 mL三氟乙酸（TFA，95%水溶液（H2O））加入树脂中，冰上操作。室温下轻轻振荡反应3小时。</li>
	<li>通过玻璃砂芯漏斗过滤混合物，并将滤液分别收集于预先加入冰冷乙醚（每8–10 mL乙醚对应1 mL裂解混合液）的离心管中。肽段以白色固体形式析出。</li>
	<li>用额外的TFA（H₂O中95%）冲洗滤饼2O，约1-3 mL。</li>
	<li>关闭含有沉淀物的离心管，将悬浮液在3400 × g条件下离心1分钟，倾去上清液，用8–10 mL冰冻的乙醚洗涤沉淀物。重复此步骤3次。</li>
	<li>将沉淀物敞口静置5分钟，以除去残留的乙醚痕迹。将粗产物沉淀溶解于1 mL 叔正丁醇（H₂O 中 80%）2O). 冻干多肽（-80 °C）。</li>
</ol>
3. 使用半制备型高效液相色谱法（HPLC）纯化线性前体
注意：使用配备C18色谱柱（5 µm粒径，100 Å孔径，250 x 32 mm）和3.6 mL进样环的半制备型反相（RP）高效液相色谱系统纯化粗肽。采用含0.1%三氟乙酸（TFA）的H2O（流动相A）和含0.1% TFA的乙腈（MeCN）/H2O（9:1，流动相B）进行梯度洗脱。在220 nm处检测洗脱峰。
<ol>
	<li>将约 70 mg 粗肽加入 15 mL 离心管中，并用 HPLC 进样环体积的溶剂溶解固体肽例如，3.6 mL）。使用含 0.1% TFA 的乙腈/水混合液（MeCN/H₂O）2O (1:1)。涡旋至完全溶解，然后以3400 × g离心1分钟。</li>
	<li>用5 mL注射器吸取样品（3.6 mL），将样品注入进样环中，确保无气泡。将样品注入高效液相色谱（HPLC）系统。采用流动相B在0–50%范围内的梯度洗脱程序，流速为10 mL/min，运行120 min，分离肽混合物。</li>
	<li>将依次流出的组分分别收集到不同的离心管中。运行结束后，选取特定组分进行质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）分析（步骤6.1–6.2）。将组分冷冻干燥后，于-20 °C保存。</li>
	<li>经质谱和高效液相色谱分析后，合并线性肽的纯化组分，并将样品制备用于第一次氧化反应。</li>
</ol>
4. 二硫键的选择性形成
<ol>
	<li>1 st 氧化（图1B) 
	注意：在多肽从树脂上裂解的过程中，Cys(Trt) 被脱保护，从而产生两个未保护的半胱氨酸残基，随后通过氧化形成第一个二硫键。以下方案适用于15 mg线性纯化多肽（2864.5 g/mol；5.2 µmol；1当量）。
	<ol>
		<li>将线性肽（15 mg）溶解于105 mL异丙醇/水2O-混合物（1:2；0.05 mM；用氢氧化钠（NaOH）调节pH至8.5），在碱性条件下于空气中轻轻振荡放置12–48小时。</li>
		<li>通过HPLC和MS监测氧化反应。通过碘乙酰胺（IAA）衍生化（步骤6）确认第一个桥键的形成。</li>
		<li>冻干肽，并在不进行进一步纯化的情况下用于后续实验nd 氧化</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2nd 氧化（图1C) 
	注意：在第二次氧化过程中，碘催化Acm保护的半胱氨酸脱保护，并促进第二对二硫键的形成。该方案适用于15 mg肽段（完成第一次氧化后）st 氧化（2862.5 g/mol；5.2 µmol；1 当量）
	<ol>
		<li>将多肽（15 mg；终浓度为 0.05 mM）溶解于 105 mL 异丙醇/H2O/1 M 盐酸（HCl）混合液（80:12.5:7.5）</li>
		<li>加入158 µL甲醇（MeOH）中的0.1 M碘溶液（15.7 µmol；3当量）至该溶液中。在室温下搅拌反应3–52小时。 即，直至氧化反应完成。</li>
		<li>通过HPLC和MS监测氧化反应。通过碘乙酰胺（IAA）衍生化（步骤6）确认第二个二硫键的形成。</li>
		<li>通过加入79 µL 1 M抗坏血酸水溶液终止反应2O（78.8 µmol；15 当量）。将反应混合物冷冻干燥，并将所得粉末用于后续3rd 氧化</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3rd 氧化（图1D) 
	注意：最后一次氧化会导致脱保护 tBu保护的半胱氨酸以及第三对二硫键的形成。该方案适用于15 mg肽段，此肽段来自第2步之后nd 氧化（2718.3 g/mol；5.5 µmol；1 当量）。
	<ol>
		<li>将多肽（15 mg，终浓度1 mM）溶于5.5 mL三氟乙酸（TFA）中。加入清除剂混合物，包含二苯基亚砜（11.2 mg，55 µmol；10当量）、茴香醚（60.2 µL，0.6 mmol；100当量）和三氯甲基硅烷（97.2 µL，0.8 mmol；150当量）。室温下搅拌反应混合物3–5小时。</li>
		<li>通过HPLC和MS监测氧化反应。通过碘乙酰胺（IAA）衍生化（步骤6）确认第三个二硫键的形成。</li>
		<li>在含有冷的乙醚（0 °C，每8–10 mL乙醚加入1 mL反应溶液）的离心管中沉淀肽。</li>
		<li>将悬浮液离心（3400 × g，1 分钟），倾去上清液，用 8–10 mL 冷的乙醚（0 °C）反复洗涤沉淀物 4 次。将沉淀物在空气中干燥（3 分钟）。</li>
		<li>将沉淀物溶解于1 mL 80% 叔丁基-丁醇（在 H2O），冻干多肽并将其在 -20 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 肽段纯化
注意：使用配备C18柱（10 µm粒径，300 Å孔径，250 x 22 mm）和3.6 mL进样环的半制备型反相高效液相色谱（RP HPLC）纯化氧化肽。采用含0.1%三氟乙酸（TFA）的H2O（流动相A）和含0.1% TFA的MeCN/H2O（9:1，流动相B）进行梯度洗脱。在220 nm处检测洗脱峰。
<ol>
	<li>将4.3.5步骤中得到的15 mg冻干粗产物加入至15 mL离心管中。用HPLC进样环体积的溶剂溶解粗产物例如，3.6 mL）。使用含 0.1% TFA 的乙腈/水混合液（MeCN/H₂O）2O (1:1)。涡旋至完全溶解，然后以3400 × g离心1分钟。</li>
	<li>用5 mL注射器吸取3.6 mL混合液，将样品注入进样环，确保无气泡。启动HPLC系统进样。以流速10 mL/min，采用0–50%洗脱液B的梯度，于120分钟内纯化肽混合物。</li>
	<li>将各组分依次收集到单独的离心管中。运行结束后，选取特定组分进行质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）分析（步骤6.1–6.2）。将所有组分冷冻干燥，并于-20 °C保存。</li>
	<li>运行结束后，准备选定的组分用于质谱（MS）和高效液相色谱（HPLC）分析（步骤6.1–6.2）。将所有组分冷冻干燥，并于-20 °C保存。</li>
</ol>
6. 肽段分析
<ol>
	<li>分析型高效液相色谱 
	注意：使用配备C18色谱柱（5 µm粒径，300 Å孔径，250 x 4.6 mm）和500 µL进样环的分析型反相高效液相色谱仪（RP HPLC）确认肽的纯度。采用含0.1%三氟乙酸（TFA）的水相与含0.1% TFA的乙腈流动相进行梯度洗脱2O（流动相A）和0.1%三氟乙酸乙腈溶液（流动相B）。在220 nm处检测峰。
	<ol>
		<li>转移样品&#160;将肽段组分或反应对照加入HPLC小瓶中，溶解于含0.1% TFA的MeCN/H2O（1:1，300–500 µL）混合溶液中。将HPLC小瓶置于分析型反相HPLC自动进样器中。</li>
		<li>注入每种样品 250 µL。使用含 0.1% TFA 的梯度洗脱体系2O（流动相A）和含0.1%三氟乙酸的乙腈（流动相B）。以1.0 mL/min的流速，用30分钟内10%-40%流动相B的梯度纯化该肽。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 
	注意：使用基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI TOF）质谱法确认肽段的身份 α以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质。
	<ol>
		<li>将可见量的多肽转移至1.5 mL离心管中，加入10 µL浓度为37 mM的溶液溶解 α-cyano-4-羟基肉桂酸溶液，溶于含0.1% TFA的H2O/MeCN（1:1）</li>
		<li>涡旋溶液10秒，取2 µL样品点于磨砂钢靶上，室温晾干。</li>
		<li>对于分子量低于6000 g/mol的肽段，测量时使用反射模式，并采用肽段校准标准品进行标定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碘乙酰胺衍生化 
	注意：由于碘乙酰胺可与巯基发生反应，因此肽段经碘乙酰胺衍生化后可通过质谱检测是否存在游离巯基。因此，在反应过程中，游离巯基的缺失可作为质谱检测的反应对照st 氧化
	<ol>
		<li>将肽溶解于1.5 mL离心管中的10 mM磷酸盐缓冲液（100 µL；0.05 mM；pH 7.8）中。向肽溶液中加入100 µL含4 mM碘乙酰胺的10 mM磷酸盐缓冲液，避光、室温下轻轻振荡反应2小时。将反应混合物冷冻干燥后，于-20 °C保存。</li>
		<li>使用C18浓缩柱过滤吸头，依次用80%（3次）、50%（3次）、30%（3次）和0%（3次）的乙腈水溶液（MeCN in H₂O）各10 µL对吸头进行预处理2O（+ 0.1% TFA）</li>
		<li>将第 6.3.1 步的样品溶解于 1 µL 含 0.1% TFA 的 H₂O 中2O，并将溶液加入滤芯吸头中。轻柔地上下吹打，使多肽与磁珠结合。移除H2将液体从移液器吸头中排出，并用10 µL含0.1%三氟乙酸（TFA）的H₂O冲洗过滤型移液器吸头2O.</li>
		<li>加入 2 µl 含 0.1% TFA 的 H2O/MeCN（1:1）混合液，使用另一支无滤芯的移液枪头加至含有肽段的磁珠上。将滤液转移至抛光钢质靶板，自然晾干样品。</li>
		<li>加入1 µL 37 mM α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液，该溶液溶于含0.1%三氟乙酸的H2将O/MeCN（1:1）加入到含有样品的研磨钢靶上，并在空气中干燥样品。</li>
		<li>对于分子量低于6000 g/mol的肽段，测量时使用反射模式，并采用肽段校准标准品进行标定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氨基酸分析 
	注意：使用氨基酸分析仪检测肽的确切浓度及其氨基酸组成。
	<ol>
		<li>将100 µg纯肽（2604 g/mol；0.04 µmol）转移至1.5 mL微量离心管中，加入200 µL 6 M HCl溶解粉末。</li>
		<li>将200 µL溶液转移至玻璃安瓿瓶中，用200 µL 6 M HCl冲洗1.5 mL微量离心管两次，将洗涤液一并转移至玻璃安瓿瓶中。</li>
		<li>用本生灯火焰加热安瓿瓶瓶颈处将其封口。将安瓿瓶放入玻璃管中，置于加热块中于110 °C下加热24小时以进行水解。</li>
		<li>打开安瓿瓶，将溶液转移至2 mL微量离心管中。用双蒸水洗涤安瓿瓶（3次，每次200 µL）和瓶盖（3次，每次100 µL），并将洗涤液合并入同一微量离心管中。2O 并转移至微量离心管中。</li>
		<li>在60 °C、210 × g条件下，使用旋转真空浓缩仪将溶液离心6小时。将水解产物溶解于192 µL样品稀释缓冲液（200 µM）中，并将溶液转移至微型离心滤膜管中。</li>
		<li>将样品在2300 × g离心1分钟，取100 µL滤液转移至氨基酸分析样品管中。将样品管放入氨基酸分析仪，启动分析程序。使用氨基酸标准品进行校准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 二硫键连接性的串联质谱分析
<ol>
	<li>部分还原与烷基化17
	<ol>
		<li>将600 µg纯肽（2604 g/mol；0.23 µmol）溶解于1.2 mL含7.5 mg三(2-羧乙基)膦（TCEP；0.02 M；0.03 mmol）的0.05 M柠檬酸盐缓冲液（pH 3.0；肽浓度0.14 mM）中。</li>
		<li>在室温下孵育混合物，并在0至30分钟内分次取若干反应对照样品（100 µL）。</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中，将样品与300 µL烷基化缓冲液（0.5 M Tris-乙酸盐；pH 8.0；2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）；1.1 M碘乙酰胺）混合，以终止反应并实现游离巯基的羧甲基化。</li>
		<li>反应5分钟后，加入100 µL 10% TFA（溶于H）终止反应2O）并将样品置于干冰中保存。按照步骤 6.1.2 所述制备 HPLC 样品，进样 400 µL。图2A)</li>
		<li>使用含有0.1% TFA的梯度洗脱体系2O（流动相A）和0.1% TFA的MeCN溶液（流动相B）。采用等度洗脱（10%流动相B，持续15分钟），随后进行梯度洗脱（流动相B从10%升至35%，25分钟内完成），流速为10 mL/min，对肽段进行分析。在220 nm处检测峰信号。</li>
		<li>将组分收集到1.5 mL微量离心管中，并对肽段进行冷冻干燥。图2B)</li>
		<li>将每种组分的少量样品转移至1.5 mL微量离心管中，用于氧化形式的MS/MS分析（继续执行步骤7.1.12）。</li>
		<li>将剩余的多肽（10–100 µg）溶解于含 0.1% TFA 的 H2O (10-50 µL)，并加入适量100 mM TCEP溶液（溶于H2O）以获得终浓度为 10 mM 的 TCEP。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育反应 1 小时（图2C). 冻干反应混合物，并于 -20 °C 保存。</li>
		<li>按照步骤6.3.2至6.3.5所述制备MS/MS样品。</li>
		<li>在MALDI TOF/TOF质谱仪上进行MS/MS检测。采用MS/MS LID（激光诱导解离）对肽段进行碎裂，并选择2次和4次羧氨甲基化物种的前体离子质量。处理并分析MALDI数据，以确认目标二硫键连接方式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 核磁共振实验与结构分析
<ol>
	<li>将约 0.3–2 mg 纯肽产物溶解于 500 µL 的 H2O/D2O（90:10）中，并将混合液转移至核磁共振微量管中。</li>
	<li>在核磁共振波谱仪上准备样品进行检测。</li>
	<li>采用水峰压制技术，记录二维 [1H,1H]-DQF-COSY（双量子滤波相关谱）、[1H,1H]-TOCSY（全相关谱）、[1H,1H]-NOESY（核Overhauser增强谱）以及 [1H,13C]-HSQC（异核单量子相干）谱图。</li>
	<li>对所记录谱图中的质子共振信号进行归属，并基于NOESY谱图建立原子归属。通过比较NOESY谱图中的信号强度，设定肽链中不同原子之间的上限距离约束；利用同碳质子的信号强度进行峰强度校准。</li>
	<li>使用分子可视化计算机程序进行结构计算与优化，并将第7步中确定的二硫键连接关系作为额外的约束条件（图3）。</li>
	<li>选取能量最低的结构用于分子动力学（MD）模拟。</li>
</ol>

<ol><li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+therapeutics%3A+Current+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的合成富含半胱氨酸肽（如 µ-PIIIA）的方法，提供了一种从相同氨基酸序列中选择性生成二硫键连接异构体的可能性。因此，基于Fmoc的固相肽合成等既定方法18 并采用了一种明确的保护基策略，用于区域选择性地形成二硫键16固相肽合成可通过自动化合成在聚合物载体（树脂）上生成氨基酸序列。在序列组装过程中，氨基酸的侧链通过特殊的保护基团加以保护，以防止发生不必要的副反应。这些保护基团根据所采用的实验方案不同，将在肽链从树脂上裂解时被脱除。该保护策略同样适用于肽链中的半胱氨酸侧链。 例如，三苯甲基保护。然而，对于单个半胱氨酸对，可采用不同的保护基团，例如乙酰氨基甲基和 叔丁基-丁基不会在此消除步骤中同时被裂解。这些保护基团可在脱保护后使巯基暴露，进而在允许后续氧化的条件下通过形成二硫键而被去除。通过这种方法，可选择性地生成含有六个半胱氨酸残基的肽的全部15种二硫键异构体7,16然而，限制因素...

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Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
to:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
Step 1.2 in the Protocol section was updated from:
NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 &#956;mol scale.
to:
NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 &#956;mol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 &#181;mol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.
Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:
HBTU (450 &#181;L; 0.6 M in DMF; 270 &#181;mol; 9.6 eq.), NMM (125 &#181;L; 50% in DMF; 568 &#181;mol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).
to:
HBTU (415 &#181;L; 0.6 M in DMF; 249 &#181;mol; 9 eq.), NMM (112 &#181;L; 50% in DMF; 510 &#181;mol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 0.6 M in DMF; 252 &#181;mol; 9 eq.).
The first item in the Materials table was updated from:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc Rink amide resin</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>855001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin</td>
			<td>Varian, Inc.</td>
			<td>PL3867-3764</td>
			<td>AmphiSpheres 40 RAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

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Erratum: Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

生物活性肽在药物研究与开发中的应用备受认可，因为它们是针对特定生物靶点的高效且高选择性化合物1。然而，由于其生物活性依赖于三维结构，因此在进行构效关系研究时，三维结构具有重要意义2,3,4。除了影响整体构象的一级氨基酸序列外，二硫键对富含半胱氨酸肽的结构具有显著的稳定作用5。多种含二硫桥的肽包括来自Conus purpurascens的μ-PIIIA等芋螺毒素，其序列中含有六个半胱氨酸。如此高的半胱氨酸含量理论上可形成15种二硫键异构体。正确的二硫键连接方式对生物活性至关重要6,7。然而，随之而来的问题是：天然存在的肽是否具有不止一种生物活性构象？如果存在，哪一种异构体具有最高的生物活性？对于μ-芋螺毒素而言，其生物靶点是电压门控钠离子通道，其中μ-PIIIA对NaV1.2、NaV1.4和NaV1.7亚型的作用最强3。
二硫键桥接肽的合成可通过多种方法实现。其中，形成肽内二硫键最便捷的方法是所谓的氧化自折叠法。该方法首先通过固相肽合成技术制备目标环肽的线性前体，随后将其从聚合物载体上裂解，并在缓冲体系中进行氧化反应。通常加入氧化还原活性试剂，如还原型与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG），以促进二硫键的形成。缓冲液支持的自折叠法主要缺点在于，二硫键的形成并非以逐步选择性的方式进行。与天然肽通常仅存在一种特定二硫键异构体的情况相比，该方法可能产生多种其他异构体。8μ-PIIIA 在先前的研究中已被证明可在自折叠过程中至少形成三种不同构象的异构体3由于异构体混合物的保留时间相近，若采用色谱纯化方法，其分离相当困难。9因此，特定异构体的靶向合成具有优势。为了特异性地制备具有确定二硫键连接方式的异构体，需要采用一种特殊策略，即依次闭环形成二硫键。因此，首先在聚合物载体上合成线性前体，该前体在不同的半胱氨酸对上带有 distinct 保护基团。经过消除后，各半胱氨酸对被逐一选择性地脱保护，并通过氧化反应依次连接，从而形成目标二硫键10,11,12,13,14,15,16在反应产物合成与纯化后，需通过适当的分析方法确认其身份及二硫键连接方式。目前已有多种分析方法可用于确定蛋白质的一级氨基酸序列， 例如，MS/MS，而二硫键连接方式的确定仍研究较少。除了多二硫键连接肽本身的复杂性外，与产品相关的杂质（例如由于样品制备和处理过程可能导致二硫键重排（如二硫键错配），进一步增加了分析的复杂性。本文表明，必须结合多种分析技术才能明确鉴定µ-PIIIA异构体中二硫键的连接方式。我们联合使用了色谱方法与质谱分析，并将相同的样品用于核磁共振（NMR）波谱分析。在基质辅助激光解吸/电离（MALDI）串联质谱（MS/MS）分析中，由于该肽无法进行自上而下的分析，我们采用部分还原结合碘乙酰胺衍生化的方法来鉴定二硫键。此外，通过二维NMR实验，获得了各个异构体的三维结构。因此，通过整合多种精密的分析方法，能够准确阐明具有多个二硫键的复杂肽段的二硫键连接方式及其三维结构。7.

<table><tbody><tr><td>PS PEG2000 Fmoc Rink-酰胺树脂</td><td>Varian, Inc.</td><td>PL3867-3764</td><td>AmphiSpheres 40 RAM</td></tr><tr><td>Pyr(Boc)</td><td>Bachem</td><td>A-3850</td><td></td></tr><tr><td>Arg(Pbf)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1010</td><td></td></tr><tr><td>Asn(Trt)</td><td>Bachem</td><td>B-1785</td><td></td></tr><tr><td>Asp(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSP1020</td><td></td></tr><tr><td>Hyp(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FAA1627</td><td></td></tr><tr><td>Lys(Boc)</td><td>Bachem</td><td>B-1080</td><td></td></tr><tr><td>Ser(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1190</td><td></td></tr><tr><td>Gln(Trt)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1043</td><td></td></tr><tr><td>Glu(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSP1045</td><td></td></tr><tr><td>Trp(Boc)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1225</td><td></td></tr><tr><td>Tyr(tBu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47623</td><td></td></tr><tr><td>Thr(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSP1210</td><td></td></tr><tr><td>His(Trt)</td><td>Iris Biotech</td><td>FDP1200</td><td></td></tr><tr><td>2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8510060</td><td>易燃</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td>易燃，有毒</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37</td><td>致癌</td></tr><tr><td>哌啶</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12442</td><td>易燃，有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>N-甲基吗啉</td><td>Sigma Aldrich</td><td>224286</td><td></td></tr><tr><td>Cys(Acm)</td><td>Iris Biotech</td><td>FAA1506</td><td></td></tr><tr><td>Cys(Trt)</td><td>Bachem</td><td>E-2495</td><td></td></tr><tr><td>Cys(tBu)</td><td>Bachem</td><td>B-1220</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74564</td><td>有毒，腐蚀性</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Merck</td><td>1002060</td><td>有毒</td></tr><tr><td>硫代苯醚</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>乙二硫醇</td><td>Fluka Analytical</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>VWR</td><td>100,921</td><td>易燃</td></tr><tr><td>叔丁醇</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12338</td><td>易燃</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>易燃</td></tr><tr><td>水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>VWR</td><td>ACRO42383</td><td>易燃</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>AppliChem</td><td>A6579,1000</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>碘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0385</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck</td><td>110165</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>二苯基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P35405</td><td></td></tr><tr><td>苯甲醚</td><td>Sigma Aldrich</td><td>96109</td><td>易燃</td></tr><tr><td>三氯甲基硅烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M85301</td><td>易燃</td></tr><tr><td>样品稀释缓冲液</td><td>Laborservice Onken</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>106370</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795410</td><td></td></tr><tr><td>(2-羧乙基)磷酸盐盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>三乙酸盐</td><td>Carl Roth,&amp;nbsp;</td><td>7125</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E26282&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>肽校准标准品 II</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>8222570</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>设备名称</td><td>公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固相多肽合成仪</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td><td>EPS 221</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机&amp;nbsp;</td><td>Martin Christ GmbH</td><td>&amp;nbsp;Alpha 1-2 Ld&lt;sub&gt;plus&lt;/sub&gt;</td><td></td></tr><tr><td>半制备型高效液相色谱仪</td><td>Jasco</td><td>系统 PV-987</td><td></td></tr><tr><td>Eurospher 100 C18 色谱柱（反相，5 &amp;micro;m 粒径，100 &amp;Aring; 孔径，250 x 32 mm）</td><td>Knauer</td><td>25QE181E2J</td><td>线性多肽纯化</td></tr><tr><td>Vydac 218TP1022 色谱柱（反相 C18，10 &amp;micro;m 粒径，300 &amp;Aring; 孔径，250 x 22 mm）</td><td>Hichrom-VWR</td><td>HICH218TP1022</td><td>氧化多肽纯化</td></tr><tr><td>分析型高效液相色谱仪&amp;nbsp;</td><td>Shimadzu</td><td>系统 LC-20AD</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP54 色谱柱（C18 反相，5 &amp;micro;m 粒径，300 &amp;Aring; 孔径，250 x 4.6 mm）&amp;nbsp;</td><td>Hichrom-VWR</td><td>HICH218TP54</td><td>分析柱</td></tr><tr><td>钢制靶板（MTP 384）</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>NC0910436</td><td>MALDI 样品制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>C18 浓缩滤柱（ZipTip）</td><td>Merck KGaA</td><td>ZTC18S096</td><td>MALDI 样品制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI 质谱仪</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>ultraflex III TOF/TOF</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸分析仪</td><td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td><td>LC 3000 系统</td><td></td></tr><tr><td>NMR 谱仪 Bruker Avance III</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>Bruker Avance III 600 MHz</td><td></td></tr><tr><td>分子可视化计算机程序</td><td>YASARA Biosciences GmbH</td><td>Yasara structures</td><td>NMR 结构计算</td></tr><tr><td>MALDI 数据分析计算机程序&amp;nbsp;</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>flexAnalysis, BioTools</td><td>MS/MS 碎裂分析</td></tr><tr><td>模拟旋涡混合器</td><td>VWR</td><td>VM 3000</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Hettich</td><td>EBA 20</td><td></td></tr><tr><td>旋转真空浓缩仪</td><td>Christ</td><td>2-18 Cdplus</td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>A&amp;D Instruments</td><td>GR-202-EC</td><td></td></tr></tbody></table>

μ-芋螺毒素piiia异构体的合成及不同二硫键连接方式的结构测定

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

富含半胱氨酸的多肽，其三维结构通常受二硫键连接方式的影响。因此，在多肽合成过程中避免非预期的二硫键形成至关重要，因为这可能导致完全不同的多肽结构，进而改变其生物活性。然而，使用常规缓冲液氧化等标准自折叠方法难以实现多肽中多个二硫键的正确形成，原因在于可能产生多种不同的二硫键连接方式。本方案提供了一种先进策略，适用于那些无法通过缓冲液氧化法以高纯度和高产率合成的多连接二硫桥多肽的定向制备。本研究展示了采用特定保护基策略，定向合成μ-芋螺毒素PIIIA所有可能的三种二硫键连接多肽异构体的方法。这些多肽通过Fmoc固相多肽合成法进行制备，并利用保护基策略实现特定二硫键的形成。各对半胱氨酸分别采用三苯甲基（Trt）、乙酰氨基甲基（Acm）和 叔丁基-丁基 (t使用保护基（如Bu）确保在每一步氧化反应中仅目标半胱氨酸被脱保护并形成二硫键。除定向合成外，还结合多种分析方法以明确肽链的正确折叠及目标肽结构的生成。对不同三对二硫键连接异构体的比较表明，准确测定和掌握二硫键连接方式对于计算肽异构体的三维结构及其生物活性的解释具有重要意义。分析表征包括通过串联质谱（MS/MS）精确解析二硫键连接模式，该分析采用经改良方案制备的完整肽异构体的部分还原与烷基化衍生物进行。此外，结合MS/MS分析所得信息，利用二维核磁共振（NMR）实验确定肽的结构。

合成了15种不同的二硫键桥接的µ-芋螺毒素PIIIA异构体，并对其进行了详细表征（图1）。通过部分还原及随后的MS/MS分析来确定二硫键的连接方式（图2）。对不同异构体进行核磁共振（NMR）分析（图3），以揭示各自的肽链结构。值得注意的是，必须结合反相高效液相色谱（RP HPLC）、MS/MS碎片分析和NMR分析，才能明确鉴定二硫键的连接模式。
<img alt="多肽合成示意图、二硫键形成、去保护步骤、化学反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58368/58368fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
<strong class="xf...

富含半胱氨酸的多肽根据其二硫键连接方式折叠成不同的三维结构。当缓冲氧化无法产生所需的二硫键连接时，需要对单个二硫键异构体进行定向合成。本实验方案涉及含三个二硫键的多肽的选择性合成，并利用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS/MS）对其进行结构分析。

μ-芋螺毒素PIIIA异构体的合成及不同二硫键连接方式的结构测定

含有大量半胱氨酸的多肽，其三维结构通常会受到二硫键连接方式的影响。因此……

该方法有助于解答多肽合成领域中的关键问题，例如合成富含二硫键的多肽并确定其相应的二硫键连接模式。该技术的主要优势在于能够选择性地合成不同的二硫键连接多肽异构体，并对其进行后续的化学与结构表征。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为每种富含二硫键的多肽表现出的行为各不相同。合成与分析可能需要针对特定的肽或蛋白质进行部分优化。将文本方案中列出的试剂转移至相应的容器中，并将其放入固相肽合成仪的相应反应架上。然后，向反应柱中加入100毫克干燥树脂，并将其放入合成仪的反应架中。按照文本方案中详述的步骤开始固相多肽合成。合成完成后，将树脂冷冻干燥过夜。随后从树脂上裂解多肽，并对侧链进行完全保护。将干燥的树脂放入一个12毫升的试管中，并在冰上冷却至0摄氏度。首先加入150微升的捕获剂混合物，然后每100毫克树脂加入1毫升95%三氟乙酸。将混合物在室温下轻轻振荡反应三小时。现在，将混合物通过玻璃砂芯漏斗过滤。用预装有冰冻乙醚的离心管收集滤液，每8至10毫升乙醚中加入1毫升裂解混合液。肽段会以白色固体形式沉淀析出。按照文本方案中所述清洗并离心试管后，将肽进行冷冻干燥。为通过半制备色谱纯化线性前体，取约70毫克粗肽加入15毫升离心管中。然后将粗肽溶解于含0.1%三氟乙酸（TFA）以及等体积乙腈与水的混合液中。使用流动相B浓度从0%到50%的梯度，以每分钟10毫升的流速，于120分钟内分离肽段混合物。在各组分出现时，分别收集至独立的试管中，并按照文本方案所述，对选定组分进行质谱和高效液相色谱分析前处理。将收集的组分冷冻干燥后，合并相似组分。通过进行第一次氧化反应，启动二硫键的选择性形成。具体操作为：将15毫克冻干的线性肽溶解于105毫升异丙醇-水混合液中，在碱性条件下敞口搅拌反应12至48小时。逐步氧化过程非常关键。在全部三个氧化步骤中均需进行反应控制，以确保各个二硫键的充分形成。第三次氧化最为关键，因为当反应时间超过最佳时长时，可能发生二硫键错配。 现在进行第二次氧化反应。将15毫克冻干肽溶解于105毫升异丙醇-水-1摩尔盐酸的混合溶液中，然后向该溶液中加入158微升甲醇中的0.1摩尔碘溶液。在室温下搅拌反应，直至氧化完成。然后加入79 µL的1 M抗坏血酸水溶液以终止反应。最后进行第三次氧化。将15毫克冻干肽溶解于5.5毫升含有捕获剂混合物的三氟乙酸（TFA）中。将反应溶液按每1毫升反应液加入8至10毫升冷乙醚的比例，沉淀至含有冷乙醚的离心管中。将15毫克冻干粗产物转移至15毫升离心管中，进行肽的纯化。将粗产物溶解于HPLC进样环体积的0.1%三氟乙酸与乙腈-水（1:1）混合溶液中。涡旋至完全溶解后，在3400 × g条件下离心1分钟。用5毫升注射器吸取3.6毫升混合液，将样品注入进样环，避免产生气泡。启动HPLC系统的进样程序。使用流动相B从0到50%的梯度，以每分钟10毫升的流速，对肽混合物进行纯化，历时120分钟。在组分出现时，将其分别收集至独立的试管中。运行结束后，按照文中所述方法，对选定的组分进行质谱和高效液相色谱分析前处理。将所有组分冷冻干燥，并在-20摄氏度下保存。进行分析型高效液相色谱（HPLC）时，取肽段组分或反应对照样品置于HPLC小瓶中，溶解于含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈-水（1:1）混合溶液中。将HPLC小瓶放入分析型反相HPLC自动进样器中，设定每份样品进样250 µL。使用含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液作为流动相A，含0.1%三氟乙酸的乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱。以1.0毫升/分钟的流速，采用流动相B从10%到40%的梯度程序在30分钟内对肽段进行分析。为进行氨基酸分析，将100微克纯化肽段转移至1.5毫升微量离心管中，加入200微升6摩尔/升盐酸溶解粉末。将溶液转移至玻璃安瓿瓶后，用本生灯火焰加热瓶口封口。然后将装有安瓿的玻璃管置于加热块中，在110摄氏度下加热24小时以进行水解。24小时后，打开安瓿，将溶液转移至一个2毫升的微量离心管中。在旋转真空浓缩仪中，以210 × g离心6小时，温度保持在60摄氏度。然后将水解产物溶解于192微升的稀释缓冲液中，并将溶液转移至微型离心过滤器中。在2300 × g 条件下离心样品1分钟后，取100微升滤液转移至氨基酸分析样品管中。将样品管放入氨基酸分析仪中，开始分析。在进行此还原反应过程中，必须设置多个反应对照，以获得两倍或四倍κ-中位甲基化产物，这些产物对于后续通过质谱法进行二硫键分析至关重要。首先将600微克纯化肽溶解于1.2毫升含有TCEP的0.05摩尔柠檬酸缓冲液中。在室温下孵育混合物，并在0至30分钟内每隔一段时间取100微升反应对照样品。在1.5毫升微量离心管中，将样品与300微升烷基化缓冲液混合，以终止反应并实现游离巯基的羰基甲基化。加入100微升10%三氟乙酸（TFA）水溶液，五分钟后终止反应，并将样品置于干冰中保存。随后按照文本方案中详述的步骤对样品进行高效液相色谱（HPLC）分析。取少量每种收集到的组分转移至1.5毫升微量离心管中，用于氧化形式的MS/MS分析。将剩余的肽溶解于含0.1% TFA的水中，并加入适量体积的100毫摩尔TCEP溶液，使最终TCEP浓度达到10毫摩尔。此时，可通过肽测序检测半胱氨酸的选择性烷基化情况。通过中间的两个肽段，可以确定二硫键的连接模式。对不同异构体进行核磁共振（NMR）分析，以揭示各自的肽段结构。图中展示了能量最低的20个结构以及不同异构体的二硫键连接方式。值得注意的是，必须结合反相高效液相色谱串联质谱（HPLC MS/MS）碎片分析与核磁共振（NMR）分析，才能明确鉴定二硫键的连接方式。通过比较均方根偏差值可知，刚性较强的肽通常能够获得分辨率更高的NMR结构。本视频将为您示例如何选择性地合成具有特定二硫键连接模式的肽。它还展示了通过软电离质谱技术验证二硫键正确连接方式的可能性，并可通过核磁共振波谱法获得其三维结构。该技术建立后，为肽合成领域的研究人员探索二硫键排列模式对肽异构体三维结构及其生物学活性影响的重要性开辟了道路。在此基础上，可进一步采用诸如活性ASAS等方法，以深入了解不同肽异构体在特定生物靶标上的构效关系。尽管该方法可为芋螺毒素的合成与分析提供见解，但也可应用于其他含二硫键的肽和蛋白质，例如芬岑类、富含二硫键的动物毒素以及其他含多个半胱氨酸的分子。

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不同二硫 Connectivities µ-芋螺毒素 PIIIA 异构体的合成与结构测定

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