μ-芋螺毒素PIIIA异构体的合成及不同二硫键连接方式的结构测定

该方法有助于解答多肽合成领域中的关键问题，例如合成富含二硫键的多肽并确定其相应的二硫键连接模式。该技术的主要优势在于能够选择性地合成不同的二硫键连接多肽异构体，并对其进行后续的化学与结构表征。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为每种富含二硫键的多肽表现出的行为各不相同。

合成与分析可能需要针对特定的肽或蛋白质进行部分优化。将文本方案中列出的试剂转移至相应的容器中，并将其放入固相肽合成仪的相应反应架上。然后，向反应柱中加入100毫克干燥树脂，并将其放入合成仪的反应架中。

按照文本方案中详述的步骤开始固相多肽合成。合成完成后，将树脂冷冻干燥过夜。随后从树脂上裂解多肽，并对侧链进行完全保护。

将干燥的树脂放入一个12毫升的试管中，并在冰上冷却至0摄氏度。首先加入150微升的捕获剂混合物，然后每100毫克树脂加入1毫升95%三氟乙酸。将混合物在室温下轻轻振荡反应三小时。

现在，将混合物通过玻璃砂芯漏斗过滤。用预装有冰冻乙醚的离心管收集滤液，每8至10毫升乙醚中加入1毫升裂解混合液。肽段会以白色固体形式沉淀析出。

按照文本方案中所述清洗并离心试管后，将肽进行冷冻干燥。为通过半制备色谱纯化线性前体，取约70毫克粗肽加入15毫升离心管中。然后将粗肽溶解于含0.1%三氟乙酸（TFA）以及等体积乙腈与水的混合液中。

使用流动相B浓度从0%到50%的梯度，以每分钟10毫升的流速，于120分钟内分离肽段混合物。在各组分出现时，分别收集至独立的试管中，并按照文本方案所述，对选定组分进行质谱和高效液相色谱分析前处理。将收集的组分冷冻干燥后，合并相似组分。

通过进行第一次氧化反应，启动二硫键的选择性形成。具体操作为：将15毫克冻干的线性肽溶解于105毫升异丙醇-水混合液中，在碱性条件下敞口搅拌反应12至48小时。

逐步氧化过程非常关键。在全部三个氧化步骤中均需进行反应控制，以确保各个二硫键的充分形成。第三次氧化最为关键，因为当反应时间超过最佳时长时，可能发生二硫键错配。

现在进行第二次氧化反应。将15毫克冻干肽溶解于105毫升异丙醇-水-1摩尔盐酸的混合溶液中，然后向该溶液中加入158微升甲醇中的0.1摩尔碘溶液。

在室温下搅拌反应，直至氧化完成。然后加入79 µL的1 M抗坏血酸水溶液以终止反应。最后进行第三次氧化。

将15毫克冻干肽溶解于5.5毫升含有捕获剂混合物的三氟乙酸（TFA）中。将反应溶液按每1毫升反应液加入8至10毫升冷乙醚的比例，沉淀至含有冷乙醚的离心管中。将15毫克冻干粗产物转移至15毫升离心管中，进行肽的纯化。

将粗产物溶解于HPLC进样环体积的0.1%三氟乙酸与乙腈-水（1:1）混合溶液中。涡旋至完全溶解后，在3400 × g条件下离心1分钟。用5毫升注射器吸取3.6毫升混合液，将样品注入进样环，避免产生气泡。启动HPLC系统的进样程序。

使用流动相B从0到50%的梯度，以每分钟10毫升的流速，对肽混合物进行纯化，历时120分钟。在组分出现时，将其分别收集至独立的试管中。运行结束后，按照文中所述方法，对选定的组分进行质谱和高效液相色谱分析前处理。

将所有组分冷冻干燥，并在-20摄氏度下保存。进行分析型高效液相色谱（HPLC）时，取肽段组分或反应对照样品置于HPLC小瓶中，溶解于含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈-水（1:1）混合溶液中。将HPLC小瓶放入分析型反相HPLC自动进样器中，设定每份样品进样250 µL。

使用含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液作为流动相A，含0.1%三氟乙酸的乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱。以1.0毫升/分钟的流速，采用流动相B从10%到40%的梯度程序在30分钟内对肽段进行分析。为进行氨基酸分析，将100微克纯化肽段转移至1.5毫升微量离心管中，加入200微升6摩尔/升盐酸溶解粉末。将溶液转移至玻璃安瓿瓶后，用本生灯火焰加热瓶口封口。

然后将装有安瓿的玻璃管置于加热块中，在110摄氏度下加热24小时以进行水解。24小时后，打开安瓿，将溶液转移至一个2毫升的微量离心管中。在旋转真空浓缩仪中，以210 × g离心6小时，温度保持在60摄氏度。

然后将水解产物溶解于192微升的稀释缓冲液中，并将溶液转移至微型离心过滤器中。在2300 × g 条件下离心样品1分钟后，取100微升滤液转移至氨基酸分析样品管中。将样品管放入氨基酸分析仪中，开始分析。

在进行此还原反应过程中，必须设置多个反应对照，以获得两倍或四倍κ-中位甲基化产物，这些产物对于后续通过质谱法进行二硫键分析至关重要。首先将600微克纯化肽溶解于1.2毫升含有TCEP的0.05摩尔柠檬酸缓冲液中。在室温下孵育混合物，并在0至30分钟内每隔一段时间取100微升反应对照样品。

在1.5毫升微量离心管中，将样品与300微升烷基化缓冲液混合，以终止反应并实现游离巯基的羰基甲基化。加入100微升10%三氟乙酸（TFA）水溶液，五分钟后终止反应，并将样品置于干冰中保存。随后按照文本方案中详述的步骤对样品进行高效液相色谱（HPLC）分析。

取少量每种收集到的组分转移至1.5毫升微量离心管中，用于氧化形式的MS/MS分析。将剩余的肽溶解于含0.1% TFA的水中，并加入适量体积的100毫摩尔TCEP溶液，使最终TCEP浓度达到10毫摩尔。此时，可通过肽测序检测半胱氨酸的选择性烷基化情况。

通过中间的两个肽段，可以确定二硫键的连接模式。对不同异构体进行核磁共振（NMR）分析，以揭示各自的肽段结构。图中展示了能量最低的20个结构以及不同异构体的二硫键连接方式。

值得注意的是，必须结合反相高效液相色谱串联质谱（HPLC MS/MS）碎片分析与核磁共振（NMR）分析，才能明确鉴定二硫键的连接方式。通过比较均方根偏差值可知，刚性较强的肽通常能够获得分辨率更高的NMR结构。本视频将为您示例如何选择性地合成具有特定二硫键连接模式的肽。

它还展示了通过软电离质谱技术验证二硫键正确连接方式的可能性，并可通过核磁共振波谱法获得其三维结构。该技术建立后，为肽合成领域的研究人员探索二硫键排列模式对肽异构体三维结构及其生物学活性影响的重要性开辟了道路。在此基础上，可进一步采用诸如活性ASAS等方法，以深入了解不同肽异构体在特定生物靶标上的构效关系。

尽管该方法可为芋螺毒素的合成与分析提供见解，但也可应用于其他含二硫键的肽和蛋白质，例如芬岑类、富含二硫键的动物毒素以及其他含多个半胱氨酸的分子。