Name: Tigriopus桡足的个体培养及其交配行为的定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 学习Tigriopus桡足类个体培养与交配守护行为定量分析方法。该技术通过视频追踪记录雌雄配对与雄雄配对的守护时长和运动速度差异，为海洋行为生态学与进化遗传学研究提供可重复的实验框架。

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本研究得到了日本住友财团基础科学研究项目（资助编号：150932）和日本无脊椎动物海洋研究所（2018年度个人研究资助）对STI和RSB的资助，以及美国国家科学基金会（DEB-1556466）对RSB的资助。我们感谢Kiana Michelle Woodward女士对培养与分期方法提供的反馈意见。

1. 行为观察用未交配动物的准备
<ol>
	<li>获取受精卵并使其孵化。
	<ol>
		<li>收集携带透明橙色卵的雌性成虫即， 已受精且处于较晚发育阶段的卵（图3C用巴斯德移液管从原代培养物中吸取雌体。用干净的培养液轻轻吹打雌体进行清洗，以避免其他生物（包括已在培养物中孵化的无节幼体）的转移。 
		注意：本实验方案中使用盐度为35%的人工海水作为培养基。使用不同的培养基（例如 根据实验目的，可使用盐度更高的人工海水或添加其他溶质的人工海水。 
		注：参见 Barreto 等 201512 用于实验室培养物保种及Pereira方法 等 201613 自然种群采集地点的示例 T. californicus. Peterson 等 也报告了他们的采集地点 T. californicus, T. fulvus，以及 T. japonicus 带有纬度和经度信息9使用容量约为30-50 mL的塑料移液管进行收集 Tigriopus 岩池中的桡足类动物</li>
		<li>将每只雌性个体单独放入6孔细胞培养板的孔中，并加入无菌培养基图4，左侧）。确保孔中无其他动物（包括无节幼体）污染。</li>
		<li>将培养板置于设定为20℃的培养箱中培养&#160;&#176;C 采用12小时光照-12小时黑暗循环培养雌性个体，直至其释放卵囊。此步骤通常需要1至10天，具体时间取决于物种及胚胎的发育阶段。同时，每周喂食两次怀卵雌性个体，每次喂食两粒精细研磨的（约 &#60; 0.5 毫米直径）鱼食（参见 材料表 详情请参见）。 
		注意：根据实验目的使用不同的温度和光照周期。较高的温度可促进胚胎更快发育。 
		注意：避免食物残渣在孔中过度残留并发生腐败。若食物残渣开始腐败，需使用巴斯德吸管将其从孔中吸出。</li>
		<li>卵囊释放后，用巴斯德吸管将雌虫从培养孔中移除。 
		注意：已交配的雌性能产下多批后代2,3如有需要，可将雌性个体转移至其他孔中以收集更多的卵块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集桡足幼体用于单个培养。
	<ol>
		<li>将孵化出无节幼体的培养板保留在培养箱中，继续培养无节幼体直至其发育至第一桡足幼体（CI）阶段（图4，中）。此步骤通常需要一到两周时间。每隔两天在每孔中加入几粒精细研磨的鱼食进行喂养，并检查是否存在CI个体。用蒸馏水补充蒸发损失的培养水。 
		注意：若漂浮的碎屑阻碍视野，可用一小块纸巾轻轻 skim 掉。</li>
		<li>一旦CI动物开始出现，立即使用移液量程约为10 μL的P-10微量移液器从孔中收集 8 &#181;L，在体视显微镜下以10倍至40倍放大倍数（图4，右侧）。用洁净的人工海水轻轻吹打每个CI个体进行清洗，并将其转移至24孔细胞培养板的孔中，每孔加入2-3 mm深度（约400-600 &#181;L人工海水的体积。 
		注意：进行个体培养时，避免将无节幼体的蜕皮物或其他生物带入孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过计数蜕下的外骨骼来追踪个体的发育过程。
	<ol>
		<li>每两到三天（根据需要调整频率）在体视显微镜下使用暗场照明、10倍至40倍放大观察各孔内是否存在桡足类幼体蜕下的外骨骼。桡足幼体的蜕皮残留物呈透明状，具刚毛状附肢和一对尾叉，易于识别。即， 尾端细长的突起结构）和/或头胸部与腹部的分节现象（图5）。改变焦点和照明，以检测孔板中不同深度的蜕皮残留物（图6A). 
		注意：蜕下的外骨骼比蜕皮动物本身更小。对于动物及其相对较新的蜕皮，应从较低倍率开始观察，然后对较老的蜕皮（即， 较小的蜕皮残留物。 
		注意：若某孔中的蜕皮残留物受损，应将该孔排除在后续发育阶段追踪之外，以避免对发育阶段的误判。 
		注意：如果漂浮的碎屑阻碍视野（图6B），用一小块纸巾轻轻吸去表面液体。</li>
		<li>用记号在培养板盖上记录每个孔中桡足类幼体蜕皮的总数（图7）。每在孔中发现一条新蜕皮，就在标记处添加一条线。 
		注意：如果孔中有无节幼体蜕皮污染，请将其从计数中剔除。</li>
		<li>每次喂食时，为每条个体提供两粒精细研磨的鱼食。用蒸馏水补充蒸发的培养水，以维持盐度。 
		注意：每两到三天投喂一次桡足幼体，以防止其摄食和破坏蜕下的外骨骼，否则可能影响发育阶段的判定（步骤 1.3.4）。</li>
		<li>根据蜕皮次数估计动物的发育阶段。若无蜕皮，个体估计处于CI期；若有1至4次蜕皮，个体估计处于CII至CV期；若有5次蜕皮，个体估计为成虫。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据形态特征鉴定成虫的性别。
	<ol>
		<li>通过观察形态特征对动物进行性别鉴定。成年 Tigriopus 雄性具有膝状的第一触角，其远端带有钩状和球状结构（图3A）。成年雌性的第一触角较为光滑且相对较薄（图3B) 而雄性个体则无此特征。部分雌性个体体内还因性腺脂质呈现深绿色图3B, 3D).</li>
		<li>在孔板盖上标记性别（图7B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 交配守护行为的行为学测试与视频记录
<ol>
	<li>在测试当天，选择所需发育阶段和性别的动物进行行为学实验。
	<ol>
		<li>在培养孔中用精细研磨的鱼食喂养所选个体，并让其进食30分钟。在此期间，同时进行步骤2.1.2以准备测试用培养板。</li>
		<li>准备两个48孔平底细胞培养板作为测试腔室；其中一个板（以下简称“板A”）用于放置雄性个体，另一个板（“板B”）用于放置目标个体（例如 桡足幼体、成年雌性、成年雄性）。在各孔中加入400 µL盐度为35%的洁净人工海水。将培养板置于覆盖有半透明亚克力板的LED光源板上，以起到光线扩散作用（图8）。 
		注意：根据实验目的使用不同的培养基。 
		注意：为避免产生过多热量，不要使用白炽灯或荧光灯作为背光源。</li>
		<li>在完成2.1.1中所述30分钟的喂食后，用移液器将每只动物轻轻转移至装有洁净人工海水的24孔板中的连续四个孔中进行冲洗（图9），以防止培养孔中的碎屑和蜕皮残留物被带入测试环境。</li>
		<li>将冲洗后的个体分别放入置于LED光源板上的板A和板B的孔中。让动物在孔中适应30分钟。</li>
		<li>在适应期间，将视频摄像机置于板A上方（图8），使用三脚架或支架固定摄像机。</li>
		<li>调整摄像机对准板A内的雄性个体，以便观察其触角。 
		注意：为减少视频中背光源的闪烁现象，应将帧率设置为等于或等于电网频率的一半，并使用较长的曝光时间。同时，保持如步骤2.1.2所述，将LED光源板覆盖半透明亚克力板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在完成步骤2.1.4所述的适应期后，开始视频录制及行为学测试。
	<ol>
		<li>使用巴斯德移液器将目标个体从板B转移至板A。若实验对培养基中的化学成分敏感，则每次测试配对应更换新的移液器。 
		注意：从板B中吸取动物时，不要用巴斯德移液器在水中追逐动物，因为水流扰动可能刺激动物并引发过度运动。应将移液器尖端略高于水面位置保持静止，等待个体游至尖端下方后，用少量人工海水轻轻吸入，再将其排入板A的孔中。</li>
		<li>根据实验设计，在转移后让每个孔中的雄性个体与目标个体相互作用一段预定的观察时间（例如 10分钟）。</li>
		<li>观察时间结束后停止视频录制。如有需要，将摄像机中录制的视频下载至计算机。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 行为特性的手动分析
<ol>
	<li>观察视频，确定每个目标个体被转移到A板孔中的时间点。</li>
	<li>观察并分析感兴趣事件的起始与终止时间，计算事件的持续时间、潜伏期和发生频率。
	<ol>
		<li>将雄性个体护守行为的起始定义为雄性触角与目标个体身体任何部位发生接触的时刻（图10，左上）。触角接触前通常伴随一次迅速的追逐或扑击（&#60;0.5 s）。</li>
		<li>将护守行为的终止定义为雄性双侧触角均脱离目标个体身体的时刻（图10，右上）。护守行为频率按以下公式计算： 
		<img alt="公式" src="/files/ftp_upload/58378/58378eq1.jpg" /></li>
		<li>将交配行为的起始定义为雄性背部弯曲，并随后反复将其尾节与雌性尾节相互挤压的动作（图10，右下）。挤压动作频率为每秒数次。 
		注：交配前，护守中的雄性会爬行至雌性身体的尾端（图10，左下）。</li>
		<li>将交配行为的终止定义为在3.2.4所述事件发生后，尾节之间的分离。 
		注：对于T. californicus和T. japonicus，交配通常持续数分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 个体与配对的二维追踪
<ol>
	<li>使用视频编辑软件剪辑第 2 步中录制的视频，生成包含感兴趣片段的视频剪辑（例如 防御行为的前 3 秒）。</li>
	<li>从以下网址安装 ImageJ14：https://imagej.nih.gov/ij/download.html。然后按照以下网址的说明下载适用于 ImageJ 的运动追踪插件 MTrackJ15：https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/。</li>
	<li>打开 ImageJ 并导入感兴趣的视频（例如， 文件 &#62; 导入 &#62; 使用 QuickTime；选择“转换为 8 位灰度图”以减少图像处理所需的内存）。</li>
	<li>进行空间和时间校准。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 窗口中选择“直线选择”工具以进行空间校准。</li>
		<li>在视频窗口中，沿一个已知长度的物体（例如 孔板的直径）绘制一条直线。</li>
		<li>打开“设置标尺”菜单（分析 &#62; 设置标尺）。在“已知距离”框中输入已知长度，在“长度单位”框中输入其单位（例如 mm）。勾选“全局”复选框，以便在其他视频剪辑中使用该标尺。</li>
		<li>打开“属性”菜单（图像 &#62; 属性）以进行时间校准。在“帧间隔”框中输入帧间隔时间（帧率的倒数）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 MTrackJ 配置追踪参数。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中通过 插件 &#62; MTrackJ 打开 MTrackJ 插件。在 MTrackJ 对话窗口中点击“追踪”按钮，打开追踪配置菜单。</li>
		<li>通过勾选“添加点后跳转到下一个时间索引”并在“时间步长”框中输入数值来设置追踪间隔。若要逐帧追踪，请在“时间步长”框中输入“1”。</li>
		<li>勾选“追踪期间应用局部光标吸附”并选择“暗中心点”作为吸附特征。此选项可在光标周围的检测方框（“吸附范围”）内自动检测暗色物体（即 个体或配对个体）的质心。选择方框大小以完全覆盖视频中的配对个体或动物（例如 31 × 31 像素）。</li>
		<li>点击“确定”以应用所选选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行二维追踪。
	<ol>
		<li>在 MTrackJ 对话窗口中点击“添加”按钮以开始追踪。</li>
		<li>将光标（检测方框）放置在待追踪的个体或配对个体上，使其被方框覆盖，然后点击以检测方框内物体的暗色质心。</li>
		<li>对所需数量的帧重复步骤 4.6.2。</li>
		<li>要生成数据表，请在 MTrackJ 对话窗口中点击“测量”按钮。数据将显示在两个窗口中：“MTrackJ: Tracks”窗口显示被追踪二维轨迹的摘要，“MTrackJ: Points”窗口显示每个时间点的详细数据。要保存每个表格，请在 ImageJ 中选择 文件 &#62; 另存为… 菜单。 
		注意：有关各数据列的说明，请参考开发者提供的在线手册（https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/）。</li>
		<li>要生成包含以彩色线条绘制的追踪轨迹的视频，请在 MTrackJ 对话窗口中点击“视频”按钮。要保存生成的视频，请在 ImageJ 中选择 文件 &#62; 另存为… 菜单。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存全部结果。在 MTrackJ 对话窗口中点击“保存”按钮，以保存包括数据（步骤 4.6.4）和被追踪的二维轨迹（步骤 4.6.2 和 4.6.3）在内的所有结果。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

个体培养及发育阶段与性别的鉴定
本文描述了我们在先前研究5中所采用的方法，用于制备初孵的Tigriopus动物，并在追踪其发育过程的同时控制其配对经历（图4 和 图7）。由于Tigriopus物种已被广泛用作多种生物学领域的模式动物，例如毒理学16,18、生态生理学19,20,21以及进化遗传学13,22,23,24，该方法有望为评估环境和遗传因素对这些桡足类动物生活周期的影响提供有价值的手段。
为实现准确的分期，定期从大规模培养物中搜索并收集CI无节幼体（步骤1.2）至关重要，因为在较晚阶段进行收集可能导致动物分期错误。此外，彻底搜寻蜕皮壳（步骤1.3）对于准确分期也十分关键。如有必要，应增加收集和分期的频率，因为不同物种和培养条件下，蜕皮间隔可能从一天到数天不等2,25,26。在某些Tigriopus物种和种群中，无节幼体与成年雌性之间的触角形态差异并不明显16,25。因此，在性别鉴定之前完成分期有助于区分成年雌性与任一性别的晚期无节幼体。
行为学测试及行为特征的手动分析
通常，行为学研究最关键的环节之一是对所关注事件的定义与描述。本文介绍的方法最初为我们的近期研究5所开发，并补充了交配行为的描述及图示辅助材料（图10）。此外，动物操作的一致性在行为实验中也起着重要作用。例如，桡足类的冲洗过程可能会影响其某些行为表现（补充图1），因此在不同样本间应以一致的方式进行，如步骤2.1.3中所标准化的操作。我们期望本文提供的材料能够促进对潮间带高盐水坑中广泛分布的剑水蚤属Tigriopus的护配行为进行可控且可重复的研究，推动对该物种繁殖与生态学的深入探索。
该方法的一个可能局限性是所获图像的放大倍数较低。尽管我们系统记录的视频能够识别出明显的身体结构，包括尾节和雄性第一触角，但由于本方法在视频录制时未采用显微放大，因此可能无法观察到腿部和生殖器等更细微的结构。Kelly 等人曾报道，在100倍显微观察下能够看到雄性日本哲水蚤（T. japonicus）向雌性传递精荚的过程（未记录视频）7，但我们尚未能在视频中观察到精荚，这可能是由于图像分辨率的限制所致。
成对目标的二维追踪
尽管该方法无法实现对动物的三维追踪，但通过使用免费提供的程序，可对浮游动物进行二维轨迹分析，且无需对动物进行化学标记（参见 Lard 等，201027）。如果视频文件过大而无法在 ImageJ 中处理，可降低其分辨率并将其转换为灰度视频。虽然所述方法最初是为 T. californicus 成体配对设计的（图12 和 图13），但原则上也可用于成体-幼体配对、单个个体（补充图1）以及其他 Tigriopus 物种。我们进一步预期，经过适当调整，该方法还可适用于其他分类群浮游动物的短期（从毫秒到秒量级）轨迹分析。

剑水蚤属（Tigriopus）的潮间带剑水蚤广泛分布于多个大陆的岩石质高潮带水坑中1。这些剑水蚤在繁殖过程中表现出护偶行为，即成年雄性在交配前利用其钩状的第一触角捕捉潜在的配偶（幼体或成体）（图1 和 图2）2,3,4,5。尽管这一现象数十年来一直是行为学和生物化学研究的主题2,3,6,7，但关于该行为研究的详细操作流程，包括 virgin 个体的单独培养以及护偶行为尝试中行为事件的判定标准，迄今尚未得到充分描述。因此，本文建立了在受控实验条件下开展此类行为研究的方法体系。
个体培养与动物分期
以往对Tigriopus繁殖的研究通常采用成对分离法，以获取幼体（桡足幼虫）和成年雌性个体，用于行为测试和繁殖实验3,8,9,10。然而，该方法允许动物在测试前形成配对并可能发生交配（见Ito 1988年讨论11），这可能改变动物的行为特征5。此外，传统方法在判断桡足类发育阶段时也存在误判的可能，因其依赖于个体的外观体型进行分期。本文中，我们描述了一种在近期Tigriopus californicus研究中使用的个体培养方法5，该方法通过控制动物的配对经历，并追踪其从桡足幼虫到成体阶段的发育过程，以克服上述局限性。
交配守护行为的定量分析
Tigriopus 物种的护配行为不仅在动物行为学领域2,6，也在生态毒理学和进化遗传学等其他领域3,4,7,8,9,10得到了研究。然而，以往的研究主要以文字形式描述该行为的过程，缺乏足够的视觉图示来阐明行为本身以及研究该行为的方法，这为研究的重复和进一步发展带来了技术障碍。本文通过可视化材料，详细描述了Tigriopus桡足类护配行为中的一些关键事件，并展示了用于该行为定量分析的设备与方法。这些方法可在精确重复的实验条件下评估动物在护配尝试过程中的行为特征。
通过这些方法，我们旨在为Tigriopus属的配偶守护行为提供一个受控且可重复的研究方法学基础。

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Spectrum Brands. Inc.</td><td>SS1-160P</td><td>用于培养基的配制</td></tr><tr><td>PRO PlecoWafers</td><td>Tetra</td><td>16447</td><td>桡足类食物（使用前需在研钵中研磨）</td></tr><tr><td>平底 6 孔细胞培养板（带盖）</td><td>Corning Co., Ltd.</td><td>353224</td><td>用于怀卵雌体及孵化无节幼体的培养容器</td></tr><tr><td>平底 24 孔细胞培养板（带盖）</td><td>Corning Co., Ltd.</td><td>353226</td><td>用于个体化培养的容器</td></tr><tr><td>平底 48 孔细胞培养板（带盖）</td><td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td><td>748001</td><td>行为学观察室</td></tr><tr><td>LED 背光板</td><td>Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.</td><td>Litup LP4</td><td>行为学观察的背光源</td></tr><tr><td>相机</td><td>Canon</td><td>0591C003 (型号: Rebel T6i)</td><td>用于行为记录</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>用于转移桡足类</td></tr><tr><td>P10 微量移液器吸头</td><td>VWR</td><td>613-0735</td><td>用于转移 C1 期桡足幼体</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>版本 1.49t</td><td>用于视频的半自动分析</td></tr><tr><td>MTrackJ</td><td></td><td>版本 1.5.1</td><td>由 Dr. Erik Meijering（荷兰伊拉斯谟大学医学中心，鹿特丹生物医学成像组）开发的 ImageJ 跟踪插件</td></tr></tbody></table>

tigriopus 桡足类个体培养及其护配行为的定量分析

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

属于 Tigriopus 属的桡足类动物是岩石潮池中常见的浮游动物，表现出交配前护配行为，即雄性抱住潜在配偶形成配对。尽管这一现象已引起研究人员的关注，但其分析方法尚未得到充分描述。本文介绍了以下两个方面的实验流程：1）Tigriopus 幼体和成体的个体化培养与发育阶段鉴定；2）基于视频的护配行为分析方法。该培养方法可实现对实验动物配对经历的可控管理，并能在行为测试前追踪其发育过程。该分析方法可对护配行为的多个方面进行定量评估，包括雄性个体的抱对尝试以及护配配对的游动轨迹。尽管这些方法最初是为 Tigriopus 的行为学研究建立的，但经过适当修改后，也可应用于其他研究领域（如生理学、毒理学和生态遗传学）中其他浮游动物的研究。

步骤1中所述的单独培养方法可用于制备和筛选未曾经历配对的处女个体。
步骤2中描述的行为学实验可用于对剑水蚤属（Tigriopus）桡足类动物的护配行为进行视频记录和观察。利用步骤3和4所述方法对录制的视频进行后续分析，可对图1所示行为的多个方面进行定量分析。
图11 显示了 T. californicus 雄性-雌性配对与雄性-雄性配对在护卵行为平均持续时间上的差异。人工分析表明，雄性-雄性配对的配对持续时间相对较短。
使用该分析方法追踪的轨迹示例如图12所示，速度分析的代表性结果见图13。对新形成的T. californicus守卫配对进行二维空间追踪发现，在守卫尝试的前3秒内，雄性-雄性配对的速度往往高于雄性-雌性配对。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig1.jpg" /> 
图1：Tigriopus 中的护配行为。 (A) 一只成年雄性用第一触角（由蓝色箭头指示）抱住一只幼体（桡足幼虫）。比例尺 = 1 mm。(B) 护配行为的示意图。一只雄性试图捕捉目标个体（左侧），并与之配对（中间）。在雄性-雄性配对以及部分雄性-雌性配对中，护配尝试最终未发生交配而终止。本图经 Tsuboko-Ishii 和 Burton 20175 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig2.jpg" /> 
图2：Tigriopus 的发育阶段。 Tigriopus 属物种通常经历六个无节幼体阶段（从NI到NVI）、五个桡足幼体阶段（从CI到CV）以及一个成体阶段（CVI）16。雄性个体在桡足幼体早期阶段即开始对幼体进行护持行为（在T. japonicus 和 T. fulvus 中为CI阶段6,17，而在T. californicus 中为CII阶段3），并对两性成体均表现出护持行为5。本图改编自Tsuboko-Ishii和Burton 20175。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig3.jpg" /> 
图3：T. californicus 成虫的形态学特征。（A） 成年雄性。（B） 成年雌性。（C） 携带卵囊的怀卵成年雌性，卵囊中含有已受精并发育完全的卵（亮橙色）。（D） 携带卵囊的怀卵成年雌性，卵囊中含有未受精或未发育的卵（深绿色）。箭头指示卵囊位置。标尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig4.jpg" /> 
图4：单细胞培养制备流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig5.jpg" /> 
图5：蜕下的外骨骼。（A）T. californicus 单个个体从CI到CV期的蜕皮残留物。标尺 = 1 mm。（B） 单个培养孔中从CI到CV期的蜕皮残留物。白色碎片为该培养孔中个体排泄的粪便（图中未显示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig6.jpg" /> 
图6：在体视显微镜下搜寻蜕皮残留物。 标尺 = 1 mm。(A) 通过调节体视显微镜的焦平面，检测不同深度的蜕皮残留物。品红色箭头指示清晰对焦的蜕皮残留物，灰色箭头指示未对焦的蜕皮残留物。上方图像聚焦于左侧的蜕皮残留物，该残留物沉于孔底。下方图像聚焦于右侧的蜕皮残留物，该残留物漂浮于培养基表面下方。(B) 上方图像显示培养基表面漂浮的碎屑阻碍观察的一个示例。绿色箭头指示隐藏在碎屑下方的蜕皮残留物。下方图像显示使用一小片纸巾清洁表面后的结果。清洁后，蜕皮残留物（由绿色箭头指示）清晰可见。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig7.jpg" /> 
图7：动物的分期与性别鉴定 在培养皿盖上标记蜕皮次数和动物性别的示例。 （A） 一个含有五次蜕皮残留物和一只成体动物的孔示例。盖子上计数标记的线条数量代表该孔中发现的蜕皮残留物数量。当蜕皮残留物数量达到五次时，可根据触角形态确定动物的性别（另见 图3). （B） 培养皿盖上标记的示例。上排孔位放置较年长的动物（CIV至成虫期），下排孔位放置较年轻的动物（即， 新采集的动物（CI至CIII期）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig8.jpg" /> 
图8：行为学测试方案。 交配守护行为视频记录的实验装置（左）及行为学测试流程示意图（右）。该图改编自 Tsuboko-Ishii 和 Burton 20175。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig9.jpg" /> 
图9：行为学测试前对动物的冲洗。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig10.jpg" /> 
图10：手动分析中考察事件的定义。 与护配行为尝试相关的观察事件示意图。步骤3中定义并分析的事件名称已突出显示。用虚线框出的事件可能在某些护配行为尝试中未被观察到。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig11.jpg" /> 
图11：T. californicus 雄性-雌性配对与雄性-雄性配对之间护卵持续时间的差异。 每个三角形符号代表一组测试配对的数据。条形和须线分别表示中位数和四分位距。雄性-雌性配对的护卵平均持续时间更长（雄性-雌性（n=22），雄性-雄性（n=29）；**p &#60; 0.01，Mann-Whitney U 检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig12.jpg" /> 
图12：守卫尝试最初三秒内配对个体的运动轨迹。 T. californicus 雌雄配对（左）和雄性-雄性配对（右）的二维追踪轨迹示例。轨迹上的点代表时间点（每秒30帧）。标尺 = 10 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig13.jpg" /> 
图13：T. californicus 雄性-雌性配对与雄性-雄性配对在开始护卵行为后的平均速度差异。 每个三角形符号代表一组测试配对的数据。条形和须线分别表示中位数和四分位距。在护卵行为开始的前3秒内，雄性-雄性配对的平均速度更高（雄性-雌性（n=13），雄性-雄性（n=35））。***p &#60; 0.001，经Mann-Whitney U检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="补充图1" src="/files/ftp_upload/58378/58378sfig1.jpg" /> 
补充图1：冲洗处理对Tigriopus行为的影响。 每个圆圈或三角形符号代表一个被测试个体或一对个体的数据。条形和须线分别表示中位数和四分位距。 “冲洗”组和“未冲洗”组的个体处理方式相同，唯一区别是“未冲洗”组在30分钟适应期（步骤2.1.4）前未接受冲洗处理（步骤2.1.3）。（A） 冲洗雄性的平均速度倾向于高于未冲洗雄性（冲洗组（n=6），未冲洗组（n=6），n.s.：Mann-Whitney U检验未检测到显著差异）。速度测量持续30秒，依据适应期后录制的视频数据。（B） 冲洗雌性的平均速度倾向于高于未冲洗雌性（冲洗组（n=6），未冲洗组（n=6），n.s.：Mann-Whitney U检验未检测到显著差异）。速度测量持续30秒，依据适应期后录制的视频数据（步骤4，追踪时间间隔 = 0.5 s）。（C） 冲洗个体配对的护守尝试频率更高（冲洗组（n=6），未冲洗组（n=6），**p &lt; 0.01，Mann-Whitney U检验）。（D） 冲洗个体配对的护守尝试持续时间倾向于更长（冲洗组（n=6），未冲洗组（n=6），n.s.：Mann-Whitney U检验未检测到显著差异）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378sfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

交配守护行为在潮间带桡足类Tigriopus属物种的繁殖过程中起着重要作用。然而，针对该行为的研究方法尚未得到充分描述。本文中，我们介绍了两种方法：1）Tigriopus virgin个体的单独培养方法；2）其交配守护行为的定量分析方法。

Tigriopus 桡足类个体培养及其护配行为的定量分析

剑水蚤属（Tigriopus）是岩石潮池中常见的浮游动物，表现出交配前护偶行为，即雄性会抓住一只……

该培养技术的主要优势在于，可以在控制桡足类动物配对经历并追踪其发育过程的同时，获得处女态的桡足类个体。以下的行为分析方法有助于对常见于岩石潮池中的剑水蚤属（Tigriopus）桡足类的护配行为开展可控且可重复的实验研究。尽管这些方法能够揭示剑水蚤属的繁殖行为特征，也可用于探究遗传和环境因素如何影响这些桡足类的生理与行为。首先，使用巴斯德吸管从原代培养物中收集携带透明橙色卵的怀卵雌虫。用洁净的培养基通过轻柔吹打清洗雌虫。接着，将每只雌虫放入六孔细胞培养板的单独孔中，并加入洁净的培养基。然后将培养板放入培养箱中，继续培养雌性个体，直至其释放卵囊。卵囊释放后，使用巴斯德吸管将雌性个体从培养板的孔中移除。一旦第一期桡足幼体（CI期）开始孵化并出现，立即使用P-10微量移液器收集这些幼体。每隔两到三天，观察培养孔中是否有蜕下的外骨骼。随后通过检查动物触角的形态来鉴定其性别。为了准确识别成年雌性，需确保它们在培养孔中已完成五次蜕皮，因为在某些种群中，成年雌性与幼体的触角形态差异并不明显。选择合适发育阶段和性别的动物后，用精细研磨的鱼食喂养所选个体。在动物进食的同时，准备两个48孔平底细胞培养板作为测试室。30分钟后，用移液器将每只动物依次转移至装有洁净人工海水的24孔板中的四个孔中进行清洗。然后将清洗后的个体放入置于LED灯垫上的A板和B板的孔中。让动物适应环境30分钟，随后使用巴斯德吸管将目标个体从B板转移至A板。在每个孔中，让一只雄性个体与一个目标个体相互作用指定的观察时间，然后停止视频录制。首先，检查视频中每个目标被转移至A板孔中的时间点。接着，将雄性个体发起护守行为的起始定义为雄性触角与目标个体任何身体部位发生接触的时刻。将雄性终止守卫行为的定义为雄性的两根触角均脱离目标个体身体的时刻。随后，将雄性交配行为的开始定义为雄性背部弯曲，继而反复将其尾节与雌性的尾节相互挤压。首先，使用视频编辑软件对原始视频进行剪辑，截取包含目标行为片段的视频片段。然后，打开 ImageJ 并导入视频片段。选择转换为 8 位灰度图像的选项，以减少图像处理所需的内存。接下来，选择直线选择工具进行空间校准，并沿孔板的直径绘制一条选择线。打开设置比例菜单，在“已知距离”框中输入已知长度，并在“长度单位”框中输入单位。然后，打开属性菜单，在“帧间隔”框中输入帧间隔时间。通过选择“插件”和“MTrackJ”来启动 MTrackJ 插件。然后，单击对话窗口中的跟踪按钮以打开跟踪配置菜单。勾选“在跟踪期间应用局部光标吸附”选项，并选择“暗中心点”作为吸附特征。接下来，单击 MTrackJ 对话窗口中的添加按钮以开始跟踪。将光标定位以覆盖需追踪视频片段中的个体，然后单击以检测方框内物体的暗色质心。为生成数据表，请在 MTrackJ 对话窗口中单击测量表，然后单击电影按钮，生成带有以彩色线条绘制的追踪轨迹的视频。最后，单击 MTrackJ 对话窗口中的保存按钮，以保存结果，包括追踪得到的二维轨迹数据。在本实验中，记录并观察了剑水蚤属（Tigriopus）桡足类的护配行为。分析结果显示，在加利福尼亚剑水蚤（Tigriopus californicus）中，雄性-雌性配对与雄性-雄性配对在护配尝试的平均持续时间上存在差异，雄性-雄性配对中的个体表现出相对较短的护配持续时间，而雄性-雌性配对中的个体护配持续时间较长。对新形成的加州猛水蚤（Tigriopus californicus）护配对进行的二维空间追踪显示，在护配尝试的前3秒内，雄性-雄性配对的移动速度往往高于雄性-雌性配对。该技术发展成熟后，为动物行为学、生物化学和进化遗传学领域的研究人员探索这类桡足类独特的交配系统提供了途径。

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Tigriopus 桡足类个体培养及其护配行为的定量分析

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