Tigriopus 桡足类个体培养及其护配行为的定量分析

该培养技术的主要优势在于，可以在控制桡足类动物配对经历并追踪其发育过程的同时，获得处女态的桡足类个体。以下的行为分析方法有助于对常见于岩石潮池中的剑水蚤属（Tigriopus）桡足类的护配行为开展可控且可重复的实验研究。尽管这些方法能够揭示剑水蚤属的繁殖行为特征，也可用于探究遗传和环境因素如何影响这些桡足类的生理与行为。

首先，使用巴斯德吸管从原代培养物中收集携带透明橙色卵的怀卵雌虫。用洁净的培养基通过轻柔吹打清洗雌虫。接着，将每只雌虫放入六孔细胞培养板的单独孔中，并加入洁净的培养基。

然后将培养板放入培养箱中，继续培养雌性个体，直至其释放卵囊。卵囊释放后，使用巴斯德吸管将雌性个体从培养板的孔中移除。一旦第一期桡足幼体（CI期）开始孵化并出现，立即使用P-10微量移液器收集这些幼体。

每隔两到三天，观察培养孔中是否有蜕下的外骨骼。随后通过检查动物触角的形态来鉴定其性别。为了准确识别成年雌性，需确保它们在培养孔中已完成五次蜕皮，因为在某些种群中，成年雌性与幼体的触角形态差异并不明显。

选择合适发育阶段和性别的动物后，用精细研磨的鱼食喂养所选个体。在动物进食的同时，准备两个48孔平底细胞培养板作为测试室。30分钟后，用移液器将每只动物依次转移至装有洁净人工海水的24孔板中的四个孔中进行清洗。

然后将清洗后的个体放入置于LED灯垫上的A板和B板的孔中。让动物适应环境30分钟，随后使用巴斯德吸管将目标个体从B板转移至A板。在每个孔中，让一只雄性个体与一个目标个体相互作用指定的观察时间，然后停止视频录制。首先，检查视频中每个目标被转移至A板孔中的时间点。接着，将雄性个体发起护守行为的起始定义为雄性触角与目标个体任何身体部位发生接触的时刻。

将雄性终止守卫行为的定义为雄性的两根触角均脱离目标个体身体的时刻。随后，将雄性交配行为的开始定义为雄性背部弯曲，继而反复将其尾节与雌性的尾节相互挤压。首先，使用视频编辑软件对原始视频进行剪辑，截取包含目标行为片段的视频片段。

然后，打开 ImageJ 并导入视频片段。选择转换为 8 位灰度图像的选项，以减少图像处理所需的内存。接下来，选择直线选择工具进行空间校准，并沿孔板的直径绘制一条选择线。

打开设置比例菜单，在“已知距离”框中输入已知长度，并在“长度单位”框中输入单位。然后，打开属性菜单，在“帧间隔”框中输入帧间隔时间。通过选择“插件”和“MTrackJ”来启动 MTrackJ 插件。

然后，单击对话窗口中的跟踪按钮以打开跟踪配置菜单。勾选“在跟踪期间应用局部光标吸附”选项，并选择“暗中心点”作为吸附特征。接下来，单击 MTrackJ 对话窗口中的添加按钮以开始跟踪。

将光标定位以覆盖需追踪视频片段中的个体，然后单击以检测方框内物体的暗色质心。为生成数据表，请在 MTrackJ 对话窗口中单击测量表，然后单击电影按钮，生成带有以彩色线条绘制的追踪轨迹的视频。

最后，单击 MTrackJ 对话窗口中的保存按钮，以保存结果，包括追踪得到的二维轨迹数据。在本实验中，记录并观察了剑水蚤属（Tigriopus）桡足类的护配行为。分析结果显示，在加利福尼亚剑水蚤（Tigriopus californicus）中，雄性-雌性配对与雄性-雄性配对在护配尝试的平均持续时间上存在差异，雄性-雄性配对中的个体表现出相对较短的护配持续时间，而雄性-雌性配对中的个体护配持续时间较长。

对新形成的加州猛水蚤（Tigriopus californicus）护配对进行的二维空间追踪显示，在护配尝试的前3秒内，雄性-雄性配对的移动速度往往高于雄性-雌性配对。该技术发展成熟后，为动物行为学、生物化学和进化遗传学领域的研究人员探索这类桡足类独特的交配系统提供了途径。