Name: 磷流式细胞仪与荧光细胞条形码用于单细胞信号分析和生物标志物发现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习磷流式细胞术与荧光细胞条形码技术，用于单细胞信号转导分析和高通量生物标志物发现。该方法可评估药物对细胞信号通路的影响，助力精准医学研究。

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本工作在 Kjetil Taskén 教授的实验室完成，由挪威癌症协会和Kristian Gerhard Jebsen基金会资助。感谢Johannes Landskron和Marianne Enger对稿件的审阅。

所有供体在签署知情同意书后提供血液样本。本研究已获挪威东南地区医学与健康研究伦理委员会批准，涉及人类血液的研究均按照《赫尔辛基宣言》进行8。
注意：步骤 1-3 应在组织培养罩内的无菌条件下进行。
1. 从慢性淋巴细胞白血病患者血液样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs）
注意：人类血液应按照生物安全二级标准的规定进行操作。
<ol>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS: 136.9 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10.1 mM Na2HPO4 x 2H2O, 1.8 mM KH2PO4，pH 7.4）转移至50 mL离心管（每管30 mL）。</li>
	<li>小心地将10 mL密度梯度介质铺层例如，使用10 mL移液管将Lymphoprep加入到试管底部。</li>
	<li>在 4℃ 下以 800 × g 离心 20 分钟 &#176;C. 此时，外周血单个核细胞可见于密度梯度介质层的上方。</li>
	<li>使用巴斯德吸管将细胞转移至两个新的50 mL离心管中。用PBS洗涤两次（加满试管）。</li>
	<li>350 × g 离心 15 分钟。弃去上清液，加入 3 mL PBS 重悬。</li>
	<li>使用首选方法对细胞进行计数。</li>
	<li>以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。&#160;注意：&#160;步骤 1.8 至 3.2 为可选步骤，可直接进行至步骤 3.3。</li>
	<li>用含10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）重悬细胞，并分装至冻存管中，进行冷冻保存。 
	注意： DMSO 对细胞具有毒性。细胞与 FBS/DMSO 混合后应尽快操作。细胞可在液氮中长期保存。</li>
</ol>
2. 细胞解冻
<ol>
	<li>在37 °C水浴中快速解冻细胞。 
	注意：DMSO对细胞有毒性。操作需迅速，以尽量减少细胞暴露于DMSO的时间。</li>
	<li>用10 mL冷的罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI 1640，含补充的GlutaMAX，参见材料表）洗涤细胞一次。</li>
	<li>以300 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于添加了丙酮酸钠、MEM必需氨基酸（按说明书以1×稀释度加入）和青霉素/链霉素以及10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中。将细胞转移至小型细胞培养瓶中，置于含5% CO2、37 °C的培养箱中孵育1小时，使细胞恢复状态。</li>
</ol>
3. 细胞的制备
<ol>
	<li>使用首选方法计数活细胞。</li>
	<li>将细胞转移至50 mL离心管中，在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用添加1% FBS的RPMI 1640培养基（步骤2.2）重悬细胞，细胞浓度不超过50 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>将所需体积的细胞悬液转移至96孔V型底板的孔中。 
	注意：孔数应与待检测的实验条件数量相对应。时间进程刺激实验的样本来自同一孔。每时间点预留50 µL样本，另加50 µL死体积。保留用于补偿对照的样本（一个未染色样本和每种条形码染料各一个样本）。</li>
	<li>将96孔板置于预热至37 °C的水浴中，静置细胞10分钟。</li>
</ol>
4. 细胞的刺激与固定
注意：步骤 4-8 请在实验台（i.e., 非无菌条件下）进行。
注意：固定缓冲液 I 的主要成分为多聚甲醛，具有毒性（可经吸入和皮肤接触），请小心操作。
<ol>
	<li>在37 °C水浴中，为每个样本的96孔V型底板每孔加入60 µL固定缓冲液I。 
	注意：细胞与固定缓冲液的比例应为1:1。为补偿37 °C下的蒸发损失，初始时固定缓冲液应过量加入。</li>
	<li>可选：在刺激前用药物处理细胞。</li>
	<li>将50 µL对照样本转移至固定板中，通过反复吹打混匀。</li>
	<li>可选：通过向细胞中加入10 µg/mL抗IgM抗体启动刺激时间进程，通过反复吹打混匀。</li>
	<li>在每个时间点将50 µL样本转移至固定板中，通过反复吹打混匀。 
	注意：抗IgM诱导的信号转导通常在早期（数分钟内）启动。</li>
	<li>在最后一个样本加入后，将固定板在37 °C下孵育10分钟。</li>
</ol>
5. 荧光细胞条形码（FCB）
注意： 条形码试剂列表见表1。
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤固定后的细胞 3 次（加满孔板孔）。</li>
	<li>500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>在96孔V型底板中加入条形码试剂。用移液器加入5 &#181;每种条形码试剂按染色矩阵中所需组合数量，每孔加入 L 例如， 在 图1B每个样本将具有不同条形码浓度的独特组合。</li>
	<li>将细胞重悬于190 &#181;加入1 mL PBS，转移至条形码板中，充分混匀。 
	注意： 使用每种条形码试剂的最高终浓度对一个补偿样本进行染色，并保留一个未染色的样本。</li>
	<li>室温避光孵育细胞20分钟。</li>
	<li>用流式洗涤液（PBS、1% FBS、0.09% 叠氮化钠）洗涤染色后的细胞 2 次（加满孔板各孔）。</li>
	<li>500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入 190 &#181;向细胞中加入流式洗涤液，并将条形码标记的样本合并至一个15 mL离心管中。将每份补偿对照分别转移至独立的1.7 mL离心管中。</li>
	<li>500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
</ol>
6. 细胞通透化以进行细胞内抗原染色
注意：固定缓冲液 III 的主要成分为甲醇，具有毒性（可通过吸入和皮肤接触），且易燃。请小心操作。
<ol>
	<li>将 2 mL Perm Buffer III 转移至 15 mL 离心管中，置于 -20 °C 预冷，确保使用时呈冰冻状态。 
	注意：Perm Buffer 可自实验开始起一直保存在 -20 °C 条件下。</li>
	<li>将 1.5 mL 冰冷的 Perm Buffer 逐滴加入含条形码标记细胞群的 15 mL 离心管中，同时涡旋混匀；每个 1.7 mL 离心管中的补偿对照组则加入 100 µL，滴加过程中持续涡旋，以避免细胞聚集。</li>
	<li>将细胞直接转移至 -80 °C 保存，至少放置 30 分钟。 
	注意：实验在此步骤暂停是合理的。细胞在 Perm Buffer 中可于 -80 °C 长期保存。</li>
</ol>
7. 抗体染色
注意：有关已报道的磷酸化特异性抗体列表，请参见材料表。
<ol>
	<li>将细胞从 -80 °C 转移至冰盒中。</li>
	<li>用流式洗涤液洗涤 3 次。 
	注意：加入过量的流式洗涤液以观察到细胞沉淀非常重要，例如，向条形码标记的细胞群体中加入 3 mL 流式洗涤液，每个补偿对照中加入 1 mL。</li>
	<li>在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将条形码标记的细胞群体重悬于一定体积的流式洗涤液中，使每种磷酸化抗体染色时含有 25 µL 细胞悬液；将补偿对照重悬于 200 µL 流式洗涤液中。</li>
	<li>在 96 孔 V 型底板中配制染色用抗体，每孔终体积为 50 µL。每孔加入用流式洗涤液稀释的磷酸化特异性抗体至终体积 10 µL，用流式洗涤液稀释的表面标志物抗体至终体积 15 µL，以及 25 µL 细胞悬液。 
	注意：抗体稀释度应在实验前进行滴定优化，并设置同型对照。</li>
	<li>将细胞在室温下避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>用流式洗涤液洗涤染色后的细胞 2 次（加满各孔）。</li>
	<li>以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 150 µL 流式洗涤液中。</li>
</ol>
8. 补偿对照的制备
<ol>
	<li>在进行抗体染色的同时，平行制备抗体偶联荧光染料的补偿对照。按照供应商的说明使用补偿微球。</li>
</ol>
9. 流式细胞术分析
注意：本实验可在配备高通量进样器（HTS）的流式细胞仪上进行。
<ol>
	<li>使用未染色对照优化光电倍增管（PMT）电压。</li>
	<li>运行补偿对照并计算补偿矩阵。</li>
	<li>运行样本。事件速率应符合仪器的技术规格。</li>
</ol>
10. 门控策略与数据分析
<ol>
	<li>将实验的 FCS 文件导入流式细胞术分析软件，如 FlowJo 或 Cytobank（https://cellmass.cytobank.org）。</li>
	<li>设门策略
	<ol>
		<li>通过绘制SSC-A选择淋巴细胞 与 密度点图中的FSC-A。</li>
		<li>显示淋巴细胞，并通过绘制SSC-A选择单细胞 与 FSC -W</li>
		<li>通过绘制SSC-A来显示单个细胞并圈定细胞类型 与 表面标志物</li>
		<li>用太平洋蓝显示细胞类型群 与 SSC-A 密度图，并根据其太平洋蓝染色强度选择不同的 FCB 群体（参见 图1A).</li>
		<li>将磷酸化抗体通道与FCB通道作图，或以热图形式呈现（参见 图1A) 以展示磷酸化事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光中位强度（MFI）的反双曲正弦（arcsinh）值计算磷酸化信号 对照 同型对照（基础磷酸化水平，参见 图 1D），或经刺激后 与 未刺激的细胞群（参见 图1E).</li>
</ol>

<ol><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+reverse-phase+protein+arrays+as+pharmacodynamic+assays+for+functional+proteomics%2C+biomarker+discovery%2C+and+drug+development+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer.</a> Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).</li>
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<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry-based+single-cell+analysis+of+intact+epithelial+signaling+reveals+MAPK+activation+divergent+from+TNF-alpha-induced+apoptosis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo.</a> Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).</li>
<li>Simmons, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+coordination+between+signaling+pathways+is+revealed+in+human+colorectal+cancer+using+single-cell+mass+cytometry+of+archival+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks.</a> Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).</li>
<li>Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+for+cancer+with+next-generation+functional+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

磷酸流式细胞术是一种用于检测单个细胞中蛋白质磷酸化水平的强大技术。由于该方法依赖于抗体染色，其应用受限于抗体的可获得性。此外，为了获得可靠的结果，所有抗体在使用前均需进行滴定和验证。有关磷酸化特异性抗体滴定的详细实验方案已在其他文献中描述。12在面板设计过程中，信噪比的考量至关重要。在本示例中，所有磷酸化抗体均偶联至 Alexa Fluor 647。该荧光染料通常可在低信号样本与高信号样本之间提供最佳分辨效果 与 高水平的磷酸化蛋白。此外，通过仅使用一种荧光颜色标记磷酸化蛋白，可留出其他通道用于荧光细胞条形码（FCB）和表面标志物染色。该面板设计可减少信号溢出至磷酸化蛋白检测通道。所有磷酸化抗体均偶联至同一荧光素，亦可简化数据分析。
在本方案中，所有抗体染色均在细胞固定和透化后进行。然而，需要注意的是，固定和透化步骤可能导致表面抗原变性或非特异性染色增加，从而对表面标志物的染色产生不利影响13。因此，使用者应针对具体情况逐一测试抗体的反应性。有关兼容克隆的信息资源也可能...

磷酸化流式细胞术用于在单细胞水平上分析蛋白质磷酸化水平。该方法的总体目标是在特定条件下绘制细胞信号传导模式。通过利用流式细胞术的多参数能力，可以在外周血等异质细胞群体的不同亚群中同时分析多条信号通路。这些特性使该方法相较于其他基于抗体的技术（如免疫组织化学、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质芯片和反相蛋白质芯片（RPPA））具有优势1。磷酸化流式细胞术可与荧光细胞条形码技术（FCB）结合使用，即用独特的荧光染料组合对单个细胞样本进行标记，使其能够混合后作为单一样本进行染色和分析2。这种方法可减少抗体消耗，通过将对照样本与处理样本合并提高数据的稳健性，并加快检测速度。合并后的FCB细胞群体可进一步分为多个小样本，并根据起始材料的量使用多达35种不同的磷酸化特异性抗体进行染色。因此，利用标准流式细胞仪硬件即可完成大规模的信号谱型分析实验。磷酸化流式细胞术已被应用于分析多种血液系统恶性肿瘤患者样本中的信号通路，包括慢性淋巴细胞白血病（CLL）3,4,5、急性髓系白血病（AML）6和非霍奇金淋巴瘤7。因此，磷酸化流式细胞术是一种强大的方法，可用于表征信号转导异常、识别和验证生物标志物以及评估药物效应动力学。
本文提供了采用磷酸流式细胞术分析慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本的优化实验方案（图1A）。内容包括基础信号通路表征、抗IgM/B细胞受体刺激以及药物干预的示例。文中详细描述了荧光细胞条形码（FCB）矩阵的构建方法。该方案可轻松适用于其他悬浮细胞类型。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270169</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-039</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies AS</td><td>1114547</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>抗IgM</td><td>Southern Biotech</td><td>2022-01</td><td>用于B细胞受体刺激</td></tr><tr><td>BD Phosflow 固定缓冲液 I</td><td>BD</td><td>557870</td><td>固定缓冲液</td></tr><tr><td>BD Phosflow 穿膜缓冲液 III</td><td>BD</td><td>558050</td><td>穿膜缓冲液</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 5-TFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A30005</td><td>条形码试剂</td></tr><tr><td>Pacific Blue 琥珀酰亚胺酯</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10163</td><td>条形码试剂</td></tr><tr><td>Pacific Orange 琥珀酰亚胺酯，三乙基铵盐</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P30253</td><td>条形码试剂</td></tr><tr><td>补偿微珠</td><td>&lt;em&gt;由用户定义&lt;/em&gt;</td><td></td><td>正确的种属反应性</td></tr><tr><td>Falcon管</td><td>&lt;em&gt;由用户定义&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td>&lt;em&gt;由用户定义&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔V型底板</td><td>&lt;em&gt;由用户定义&lt;/em&gt;</td><td></td><td>与流式细胞仪兼容</td></tr><tr><td>离心机</td><td>&lt;em&gt;由用户定义&lt;/em&gt;</td><td></td><td>适用于Eppendorf管、Falcon管和板</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>&lt;em&gt;由用户定义&lt;/em&gt;</td><td></td><td>温度可控</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>&lt;em&gt;由用户定义&lt;/em&gt;</td><td></td><td>配备高通量采样器（HTS）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗原&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT (pS473)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4075</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; D9E&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少&amp;hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62&lt;br/&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控&amp;hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>ATF-2 (pT71)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8398</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; F-1&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞&amp;hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>BLNK (pY84)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558443</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; J117-1278&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少&amp;hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62&lt;br/&gt; Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控&amp;hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9&lt;br/&gt; Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式&amp;hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY223)/Itk (pY180)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>564846</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; N35-86&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式&amp;hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Btk (pY551)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558129</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 24a/BTK (Y551)&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控&amp;hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>Btk (pY551)/Itk (pY511)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558134</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 24a/BTK (Y551)&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少&amp;hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>CD3&amp;zeta; (pY142)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558489</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; K25-407.69&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Histone H3 (pS10)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9716</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; D2C8&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>I&amp;kappa;B&amp;alpha;</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>5743</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; L35A5&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式&amp;hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>LAT (pY171)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558518</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; I58-1169&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>Lck (pY505)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558577</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 4/LCK-Y505&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>MEK1 (pS298)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>560043</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; J114-64&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>NF-&amp;kappa;B p65 (pS529)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558422</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; K10-895.12.50&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控&amp;hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9&lt;br/&gt; Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞&amp;hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>NF-&amp;kappa;B p65 (pS536)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4887</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 93H1&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控&amp;hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9</td></tr><tr><td>p38 MAPK (pT180/Y182)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4552</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 28B10&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞&amp;hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (pT202/Y204)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4375</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; E10&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少&amp;hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62&lt;br/&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控&amp;hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9&lt;br/&gt; Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞&amp;hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>p53 (pS15)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 16G8&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达&amp;hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS20)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 多克隆&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达&amp;hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS37)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 多克隆&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达&amp;hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS46)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 多克隆&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达&amp;hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>p53 (pS392)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>NN</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 多克隆&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达&amp;hellip;, Blood, 109(6):2589-96</td></tr><tr><td>PLC&amp;gamma;2 (pY759)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558498</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; K86-689.37&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式&amp;hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>Rb (pS807/pS811)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558590</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; J112-906&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞&amp;hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>S6核糖体蛋白 (pS235/236)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4851</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; D57.2.2E&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SAPK/JNK (pT183/Y185)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9257</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; G9&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞&amp;hellip;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55</td></tr><tr><td>SLP76 (pY128)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>558438</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; J141-668.36.58&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410</td></tr><tr><td>STAT1 (pY701)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612597</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 4a&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式&amp;hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT3 (pY705)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557815</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 4/P-STAT3&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>STAT4 (pY693)</td><td>Zymed/ThermoFisher Scientific</td><td>71-7900</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 多克隆&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Uzel 等, 2001, 通过流式细胞术检测细胞内磷酸化STAT-4, Clin Immunol, 100(3): 270-6</td></tr><tr><td>STAT5 (pY694)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612599</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 47/Stat5(pY694)&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式&amp;hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr><tr><td>STAT6 (pY641)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>612601</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 18/P-Stat6&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284</td></tr><tr><td>SYK (pY525/Y526)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>12081</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; C87C1&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284&lt;br/&gt; Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少&amp;hellip;, Haematologica, 101(2):e59-62</td></tr><tr><td>ZAP70/SYK (pY319/Y352)</td><td>Beckton Dickinson Pharmingen</td><td>557817</td><td>&lt;strong&gt;克隆号:&lt;/strong&gt; 17A/P-ZAP70&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;参考文献:&lt;/strong&gt; Sk&amp;aring;nland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激&amp;hellip;, Biochem J, 460(3):399-410&lt;br/&gt; Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控&amp;hellip;, Exp Cell Res, 318(14):1611-9&lt;br/&gt; Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式&amp;hellip;, Blood, 129(6): 759-770</td></tr></tbody></table>

采用荧光细胞条形码技术的磷酸化流式细胞术用于单细胞信号通路分析与生物标志物发现

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

异常的细胞信号转导在癌症的发生和发展中起着核心作用。大多数新型靶向治疗确实以蛋白质及其功能为靶点，因此细胞信号转导的异常可作为生物标志物，用于提示个体化治疗方案的选择。与DNA和RNA分析相比，蛋白质活性的变化能更有效地评估药物敏感性和耐药性的潜在机制。磷酸化流式细胞术是一种强大的技术，可在细胞水平上检测蛋白质的磷酸化事件，这一重要特征使其区别于其他基于抗体的方法。该方法能够同时分析多种信号蛋白。结合荧光细胞条形码技术，可在短时间内利用标准流式细胞仪硬件获取中到高通量的大规模数据集。磷酸化流式细胞术既可用于基础生物学研究，也广泛应用于临床研究，包括信号通路分析、生物标志物发现以及药效动力学评估。本文提供了一项详细的实验方案，以慢性淋巴细胞白血病细胞为例，对纯化的外周血单个核细胞进行磷酸化流式分析。

磷酸流式细胞术实验方案的主要步骤如图所示 图1A在本示例中，CLL细胞使用Pacific Blue标记试剂在四个不同稀释浓度下进行染色。如图所示，通过组合三种条形码染料可实现三维条形码编码。 图1B随后通过依次对每个条形码试剂进行设门，对单个样本进行解卷积。 与 SSC-A（图1C）。条形码试剂的详细信息列于 表1.
根据此处描述的实验步骤，分析了慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者和正常对照组B细胞在不同条件下的磷酸化蛋白水平3。检测了B细胞受体（BCR）信号通路下游20种信号分子的基础磷酸化水平及刺激诱导后的磷酸化水平（所用磷酸化特异性抗体列表见材料表</str...

本文介绍了一种用于在细胞水平上进行中至高通量蛋白质磷酸化事件分析的实验方案。磷酸化流式细胞术是一种强大的方法，可用于表征信号转导异常、鉴定和验证生物标志物，以及评估药物效应动力学。

异常的细胞信号转导在癌症的发生和发展中起着核心作用。大多数新型靶向治疗药物确实以蛋白质及其功能为靶点，因此细胞信号转导的异常可作为生物标志物，用于提示个体化治疗方案的选择。与DNA和RNA分析相比，蛋白质活性的变化能更有效地评估药物敏感性和耐药性的潜在机制。磷酸化流式细胞术是一种在单细胞水平上检测蛋白质磷酸化事件的强有力技术，这一重要特征使其区别于其他基于抗体的检测方法。该技术可同时分析多种信号通路蛋白。结合荧光细胞条形码技术，仅需标准流式细胞仪硬件即可在短时间内获得中高通量的数据集。磷酸化流式细胞术在基础生物学研究和临床研究中均有广泛应用，包括信号通路分析、生物标志物发现以及药效动力学评估。本文以慢性淋巴细胞白血病细胞为例，提供了针对纯化的外周血单个核细胞进行磷酸化流式分析的详细实验方案。

该方法有助于回答细胞生物学和免疫学领域的一些关键问题，例如不同刺激物或药物如何影响信号通路？该技术的主要优势在于，能够以中高通量的方式进行单细胞信号传导分析。将细胞重悬于添加了补充物的RPMI 16/40培养基后，转移所需体积的细胞悬液至96孔V型底板的各孔中。将培养板转移至预热至37摄氏度的水浴中，静置10分钟。然后向新的96孔板的每个孔中加入60微升固定缓冲液一，以制备固定板。将该板置于37摄氏度水浴中。将50 µL对照样品转移至孔板中，并通过反复吹打混匀。可选地，向细胞中加入每毫升10 µL抗IgM以启动刺激时间进程，并通过反复吹打混匀。在每个时间点，将50 µL样品转移至固定板中，每加入一个样品均需混匀。添加完最后一个样本后，将固定板置于水浴中孵育10分钟。首先用PBS洗涤细胞三次。以500 × g离心5分钟，弃去上清液。接下来，准备一个新的96孔V型底板，加入条形码试剂。将每种条形码试剂各5 µL加入所需数量的孔中，以用于染色所有样本。在固定细胞板中，用190 µL PBS重悬每个孔中的细胞。然后，将每个孔的细胞转移至条形码板中对应的孔内，并充分混匀每个孔。将培养板在室温下避光静置20分钟。以500 × g离心5分钟，弃去上清液。随后，用流式洗涤液将每孔中的细胞洗涤两次。然后向每孔细胞中加入 190 微升流式洗涤液。将所有条形码标记的样本合并至一个 15 毫升离心管中，并将各补偿对照分别转移至不同的 1.7 毫升离心管中。以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。首先，将 2 毫升破膜缓冲液 3 转移至一个 15 毫升离心管中。于 -20 °C 保存，以便使用时呈冰冻状态。准备就绪后，将 1.5 毫升冰冻的破膜缓冲液逐滴加入含有条形码标记细胞群体的 15 毫升离心管中，同时涡旋震荡，以避免细胞结团。以相同方式向每个补偿对照中加入 100 微升预冷的破膜缓冲液。立即将细胞转移至 -80 摄氏度的冰箱中，冷冻至少 30 分钟。准备开始抗原染色时，将细胞从冰箱中取出，并转移至装有冰的容器中。用过量的流式洗涤液将细胞洗涤三次。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，并将条形码标记的细胞群体重悬于适量流式洗涤液中，使每种磷酸化抗体染色对应的细胞悬液体积为25 µL。用200微升流式洗涤液重悬补偿对照样品。开始准备染色用抗体时，向一个新的96孔V型底板的每孔中加入10微升用流式洗涤液稀释的磷酸化特异性抗体。每孔再加入15微升用流式洗涤液稀释的表面标志物抗体和25微升细胞悬液，最终每孔体积为50微升。将细胞在室温避光条件下静置30分钟。随后，用流式洗涤液洗涤染色后的细胞两次，每次以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 150 微升流式洗涤液中。然后按照文本方案中所述进行流式细胞术分析。在本方案中，通过结合三种条形码染料实现三维条形码标记。随后通过逐个设门分析每种条形码试剂与侧向散射面积的关系，对各个样本进行去卷积。在不同条件下，对慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者和正常对照样本的B细胞中B细胞受体下游20种信号分子的基础磷酸化水平及刺激诱导的磷酸化水平进行表征。结果显示，stat3在酪氨酸705位点的磷酸化水平显著上调。细胞经抗IgM刺激最多30分钟，以鉴定通过B细胞受体通路诱导的信号转导异常。尽管来自IGVH未突变型患者的CLL细胞对抗IgM刺激的敏感性增加，但仅在AKT磷酸化丝氨酸473位点（pS473）上具有统计学显著性。随后将细胞暴露于PI3-激酶δ抑制剂艾代拉里斯布（idelalisib），以检测异常的AKT pS473信号是否可被逆转。如上所示，经药物处理后，异常信号水平以浓度依赖的方式显著降低，表明激酶抑制剂可用于恢复正常慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中的异常信号传导。在进行该实验之前，重要的是要记得对细胞标记试剂和抗体进行滴定，并验证所选的表面标志物与固定和透化试剂相容。进行磷酸化分析时细胞必须处于单细胞悬液状态，但本方案也可通过适当处理（如完全胰蛋白酶消化）制备成单细胞悬液后，适用于其他异常细胞或组织样本。

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