磷流式细胞仪与荧光细胞条形码用于单细胞信号分析和生物标志物发现

在这里, 提出了一种中-高通量分析在细胞级蛋白质磷酸化事件的协议。磷流式细胞术是表征信号畸变、识别和验证生物标志物、评估药效学的有力手段。

这种方法可以帮助回答细胞生物学和免疫学领域的关键问题，例如信号通路如何受到不同刺激或药物的影响？此技术的主要优点是，它允许您以中高吞吐量的方式执行单单元信令分析。在补充的 RPMI 16/40 介质中重新悬浮电池后，将所需数量的电池悬浮液转移到 96 孔 V 底板的孔中。

将盘子转移到预热的 37 摄氏度水浴中，让其在那里休息 10 分钟。然后，在新的 96 井板的每个井中添加 60 微升固定缓冲液，以设置固定板。将此盘放在 37 摄氏度的水浴中。

将 50 微升控制样品转移到板上，然后上下移液混合。可选地，向细胞中每毫升添加 10 微升抗 IgM，以启动模拟时间过程，然后通过上下移液进行混合。在每个时间点将 50 微升样品转移到固定板，在添加每个样品时混合。

添加最后一个样品后，将固定板留在水浴中 10 分钟。首先，用PBS清洗细胞三次。将板在 500 倍 G 下离心五分钟，然后丢弃上一代。

接下来，准备一个新的96孔V底板与条形码试剂，通过移液五微升每个条形码试剂到每个井，填补所需的孔数，污渍每个样品。在固定细胞板中，用190微升PBS重新向每一个井中的细胞重新暂停。然后，将每个细胞井转移到条形码板中的相应井中，将每一个井彻底混合。

让盘子在室温下在黑暗中休息20分钟。将板在 500 倍 G 下离心五分钟，然后丢弃上一代。在此之后，用流洗洗两次洗涤每个井中的细胞。

然后向每个细胞井添加190微升的流量洗涤剂。将所有条形码样品组合到一个 15 毫升管中，并将每个补偿控制转移到单独的 1.7 毫升管中。在500次G下离心5分钟，然后丢弃上一代。

首先，将两毫升的 perm 缓冲液三转移到 15 毫升管中。储存在零下20摄氏度，所以使用时会很冷。准备就绪后，在15毫升的管中加入1.5毫升的冰冷法度缓冲液，其中含有条形码的细胞数量，同时在涡旋时下降，以避免细胞结块。

以相同方式向每个补偿控制添加 100 微升的冰冷法膜缓冲液。立即将电池转移到零下80摄氏度的冰柜中，至少30分钟。当准备开始抗原染色时，从冰柜中取出细胞，并将其转移到一盒冰中。

用过量的流量洗涤洗三次细胞。将细胞在500倍G和4摄氏度下离心5分钟。丢弃上流剂，在流量洗涤量中重新悬浮条形码细胞群，即每个磷抗体染色有25微升细胞悬浮液。

在 200 微升流量清洗中重新暂停补偿控制。要开始准备染色抗体，在流洗中稀释的10微升磷特异性抗体，在新鲜96井V底板的每个井中稀释。将 15 微升表面标记物添加到每井中，在流洗中稀释，并在每井中加入 25 微升的细胞悬浮液，最终每井体积为 50 微升。

让细胞在黑暗中室温下休息30分钟。在此之后，用流洗洗洗两次染色的细胞。在500次G下离心5分钟。

丢弃上流液，在150微升的流量洗涤中重新悬浮细胞。然后执行文本协议中概述的流细胞学分析。在提出的协议中，三维条形码通过组合三种条形码染料来执行。

然后，通过在每个条形码试剂与侧面散射区域上的后续浇注来消除单个样品。B细胞受体下游20个信号分子的基底和刺激诱导磷酸化水平，然后由CLL患者的B细胞和各种条件下的正常控制进行描述。stat3磷酪氨酸705被认为被显著上升的调节。

细胞用抗IgM刺激长达30分钟，以识别通过B细胞受体通路诱导的信号畸变。虽然来自未突变IGVH患者的CLL细胞显示对抗IgM刺激的敏感性增加，但仅对KT磷素473具有统计学意义。然后，细胞暴露在PI 3-激酶三角洲抑制剂伊德拉利西布测试，如果异常的KT pS473信号可以逆转。

如这里所示，在以浓度依赖的方式治疗时，异常水平显著降低，表明激酶抑制剂可应用于CLL细胞中的异常信号正常化。在尝试此过程之前，必须记住对条形码试剂和抗体进行滴定，并验证所选表面标记是否与固定和渗透试剂兼容。细胞需要在悬浮液中进行磷分析，但协议仍可适应异常细胞或组织按照程序获得单细胞悬浮，如全试增。