采用荧光细胞条形码技术的磷酸化流式细胞术用于单细胞信号通路分析与生物标志物发现

该方法有助于回答细胞生物学和免疫学领域的一些关键问题，例如不同刺激物或药物如何影响信号通路？该技术的主要优势在于，能够以中高通量的方式进行单细胞信号传导分析。将细胞重悬于添加了补充物的RPMI 16/40培养基后，转移所需体积的细胞悬液至96孔V型底板的各孔中。

将培养板转移至预热至37摄氏度的水浴中，静置10分钟。然后向新的96孔板的每个孔中加入60微升固定缓冲液一，以制备固定板。将该板置于37摄氏度水浴中。

将50 µL对照样品转移至孔板中，并通过反复吹打混匀。可选地，向细胞中加入每毫升10 µL抗IgM以启动刺激时间进程，并通过反复吹打混匀。在每个时间点，将50 µL样品转移至固定板中，每加入一个样品均需混匀。

添加完最后一个样本后，将固定板置于水浴中孵育10分钟。首先用PBS洗涤细胞三次。以500 × g离心5分钟，弃去上清液。

接下来，准备一个新的96孔V型底板，加入条形码试剂。将每种条形码试剂各5 µL加入所需数量的孔中，以用于染色所有样本。在固定细胞板中，用190 µL PBS重悬每个孔中的细胞。然后，将每个孔的细胞转移至条形码板中对应的孔内，并充分混匀每个孔。

将培养板在室温下避光静置20分钟。以500 × g离心5分钟，弃去上清液。随后，用流式洗涤液将每孔中的细胞洗涤两次。

然后向每孔细胞中加入 190 微升流式洗涤液。将所有条形码标记的样本合并至一个 15 毫升离心管中，并将各补偿对照分别转移至不同的 1.7 毫升离心管中。以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。

首先，将 2 毫升破膜缓冲液 3 转移至一个 15 毫升离心管中。于 -20 °C 保存，以便使用时呈冰冻状态。准备就绪后，将 1.5 毫升冰冻的破膜缓冲液逐滴加入含有条形码标记细胞群体的 15 毫升离心管中，同时涡旋震荡，以避免细胞结团。

以相同方式向每个补偿对照中加入 100 微升预冷的破膜缓冲液。立即将细胞转移至 -80 摄氏度的冰箱中，冷冻至少 30 分钟。准备开始抗原染色时，将细胞从冰箱中取出，并转移至装有冰的容器中。

用过量的流式洗涤液将细胞洗涤三次。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。弃去上清液，并将条形码标记的细胞群体重悬于适量流式洗涤液中，使每种磷酸化抗体染色对应的细胞悬液体积为25 µL。

用200微升流式洗涤液重悬补偿对照样品。开始准备染色用抗体时，向一个新的96孔V型底板的每孔中加入10微升用流式洗涤液稀释的磷酸化特异性抗体。每孔再加入15微升用流式洗涤液稀释的表面标志物抗体和25微升细胞悬液，最终每孔体积为50微升。

将细胞在室温避光条件下静置30分钟。随后，用流式洗涤液洗涤染色后的细胞两次，每次以500 × g离心5分钟。

弃去上清液，将细胞重悬于 150 微升流式洗涤液中。然后按照文本方案中所述进行流式细胞术分析。在本方案中，通过结合三种条形码染料实现三维条形码标记。

随后通过逐个设门分析每种条形码试剂与侧向散射面积的关系，对各个样本进行去卷积。在不同条件下，对慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者和正常对照样本的B细胞中B细胞受体下游20种信号分子的基础磷酸化水平及刺激诱导的磷酸化水平进行表征。结果显示，stat3在酪氨酸705位点的磷酸化水平显著上调。

细胞经抗IgM刺激最多30分钟，以鉴定通过B细胞受体通路诱导的信号转导异常。尽管来自IGVH未突变型患者的CLL细胞对抗IgM刺激的敏感性增加，但仅在AKT磷酸化丝氨酸473位点（pS473）上具有统计学显著性。随后将细胞暴露于PI3-激酶δ抑制剂艾代拉里斯布（idelalisib），以检测异常的AKT pS473信号是否可被逆转。

如上所示，经药物处理后，异常信号水平以浓度依赖的方式显著降低，表明激酶抑制剂可用于恢复正常慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中的异常信号传导。在进行该实验之前，重要的是要记得对细胞标记试剂和抗体进行滴定，并验证所选的表面标志物与固定和透化试剂相容。进行磷酸化分析时细胞必须处于单细胞悬液状态，但本方案也可通过适当处理（如完全胰蛋白酶消化）制备成单细胞悬液后，适用于其他异常细胞或组织样本。