Name: 荷尔斯坦奶牛肝线粒体耗氧量和质子泄漏动力学评价线粒体呼吸 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 了解荷尔斯坦奶牛肝线粒体耗氧量与质子泄漏动力学测定方法，用于评估线粒体呼吸效率及饲料转化率。该技术通过直接测量分离线粒体的氧耗，为奶牛营养能量学研究提供可靠数据。

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本研究由Alltech和美国农业部哈奇基金通过加州大学戴维斯分校兽医学院食品动物健康中心资助。

本文所述所有方法、方案和研究均经加州大学戴维斯分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 从荷斯坦奶牛获取肝活检样本
注意：肝脏活检应由有资质的兽医进行。活检可在奶牛所在的奶牛场现场实施。泌乳期奶牛在活检前后可照常挤奶，且奶制品无需从食物供应链中下架。建议至少需要4人协作完成奶牛肝脏活检：一名兽医负责执行活检操作；一名动物操作员站在奶牛臀部位置，以保护活检区域及兽医；一名实验室技术人员位于围栏外，负责在兽医与外部之间传递工具、材料和活检样本，并维护清洁区域（该区域可设于车辆后部）（图1）；另需一名技术人员负责取回肝脏样本并开始线粒体分离操作。
<ol>
	<li>在进行肝脏活检前一个月，给奶牛接种梭菌疫苗。通过高压灭菌手术巾、活检器械、手术刀柄和手术器械来制备手术包。</li>
	<li>肝脏活检前一天，按每公斤体重0.044 mL剂量，于颈部皮下注射盐酸头孢噻呋。监测奶牛的体温、采食量和粪便评分，作为正常功能的基线参考。</li>
	<li>配制线粒体分离介质（MIM），包含220 mM甘露醇、70 mM蔗糖、20 mM HEPES、1 mM EDTA和0.1%（w/v）无脂肪酸牛血清白蛋白，用4 °C的溶液调节pH至7.4。每个样品约需30 mL。</li>
	<li>根据需要使用头夹和鼻缰对奶牛进行物理固定（图2）。利用鼻缰将牛头系在颈夹左侧。如有必要，可使用化学保定（静脉注射盐酸赛拉嗪，100 mg/mL，剂量为每公斤体重0.010–0.015 mg）。</li>
	<li>活检部位位于右侧第10–11肋间间隙（图3）。从右侧坐骨结节向右侧肩点画一条直线，活检位置即为该直线与第10–11肋间间隙的交点。剃除约10 cm见方的区域毛发以消毒活检部位（图4）。使用10%聚维酮碘溶液以环形方式清洗该区域（图5），然后喷洒70%乙醇溶液（图6）。重复聚维酮碘和乙醇清洗步骤。 
	注意：与肉牛相比，荷斯坦奶牛的肝脏位置略有不同。</li>
	<li>在局部注射2%盐酸利多卡因（10–15 mL），以麻醉皮肤及皮下肌肉和结缔组织（图7）。再次进行聚维酮碘和70%乙醇清洗。 
	注意：神经末梢主要分布于皮肤和肌肉中，内脏器官无痛觉感受器，因此仅需局部麻醉。活检过程中，奶牛最多仅会感到轻微压力，不应感到疼痛。</li>
	<li>在第10–11肋间间隙的皮肤上做一个1–2 cm的穿刺切口（图8）。将Schackelford-Courtney牛用肝脏活检器械穿过皮肤，并在穿过膈肌进入肝脏的过程中，将器械略朝头侧方向引导（图9、图10）。获取约1 g的肝脏组织后取出器械（图11）。用缝合线闭合皮肤切口（图12）。</li>
	<li>将肝脏样本放入锥形管中，加入足量MIM浸没样本，并置于冰上，立即进行线粒体分离。</li>
	<li>活检后24小时内检查切口是否有红肿、发热或疼痛现象，并在接下来的3天内每天于颈部皮下注射一次盐酸头孢噻呋（0.044 mL/kg体重）（图13）。肝脏活检后连续7天每日监测奶牛体温、采食量和粪便评分。若出现发热，应由兽医根据情况决定是否继续使用抗生素。 
	注意：若奶牛在肝脏活检后1小时内表现出疼痛症状，如踢击切口部位、卧地不起、红肿、发热或触碰反应明显，可静脉注射氟尼辛葡甲胺（1 mg/kg体重）以缓解疼痛和炎症。如有需要，可给予第二次注射。</li>
	<li>活检7天后拆除缝线。</li>
</ol>
2. 从奶牛肝脏中分离线粒体
<ol>
	<li>从牛体内取出肝组织样本后，应尽快用MIM（步骤1.3）清洗样本以去除红细胞，并用剪刀将组织精细剪碎。剪碎过程应在预冷的烧杯中进行，烧杯内加入足量的分离介质以保持组织湿润。</li>
	<li>将剪碎的肝组织放入一个30 mL的玻璃瓶中，瓶内装有间隙为0.16 mm的聚四氟乙烯（Teflon）研杵，并置于冰上预冷，同时加入MIM（1:4 w/v）。</li>
	<li>在500 rpm转速下，以每分钟4次研磨的频率，用聚四氟乙烯研杵均质化肝组织样本1分钟。 
	注意：在整个操作过程中，肝匀浆物需始终置于装有MIM的冰浴烧杯中，后续所有离心步骤均在4 °C下完成。</li>
	<li>将匀浆液在500 × g条件下离心10分钟，弃去沉淀，将上清液转移至预冷的离心管中，再以10,000 × g离心10分钟，以获得线粒体沉淀。</li>
	<li>用10 mL含无脂肪酸BSA的MIM重悬并洗涤沉淀，然后在8100 × g下离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL不含无脂肪酸BSA的MIM重悬并洗涤沉淀，然后在8100 × g下离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于200 µL分离介质中，置于冰上保存，待用于氧消耗和质子泄漏动力学测定。</li>
	<li>采用BCA试剂盒（以BSA为标准品，按制造商说明书操作），测定沉淀悬液（1/100稀释）的蛋白浓度。所有蛋白均视为线粒体蛋白。</li>
</ol>
3. 测量线粒体氧消耗（状态3和状态4）
<ol>
	<li>用120 mM KCl、5 mM KH2PO4、5 mM MgCl2、5 mM Hepes 和 1 mM EGTA 配制耗氧培养基（OCM），用0.3%去脂肪BSA调节pH至7.4（30 °C条件下）。每份样品约需3 mL。另配制8 μg/mL的寡霉素乙醇溶液。</li>
	<li>将OCM在30 °C下预温。按照制造商说明设置呼吸室、泵和氧电极（氧电极系统）。计算机应已安装相应的氧电极系统软件。</li>
	<li>向呼吸室中加入1 mL OCM并剧烈搅拌，以确保溶液充分与空气饱和。</li>
	<li>向呼吸室中加入0.35 mg线粒体蛋白，并维持温度在30 °C。</li>
	<li>记录约5分钟的耗氧量。氧电极系统记录的是氧浓度，随着呼吸作用增强，氧浓度下降。当耗氧速率趋于稳定（呈下降的直线）时，记录耗氧速率（直线斜率 = 氧浓度/时间），此为本底耗氧速率。</li>
	<li>加入1.25 µL 4 mM 鱼藤酮溶液以抑制复合物I，随后加入5 µL 1 M 琥珀酸溶液，使呼吸室中琥珀酸终浓度达到5 mM。此为状态4呼吸。</li>
	<li>加入1 µL 100 mM ADP溶液，使呼吸室中ADP终浓度为100 μM。氧浓度将下降（呼吸增强），约5分钟后再次形成直线。记录此时的耗氧速率（直线斜率 = 氧浓度/时间），此为状态3呼吸。</li>
	<li>可选：实验结束时，加入FCCP（总体积0.2 μM）以诱导最大呼吸速率。记录约5分钟的呼吸速率。当耗氧速率稳定后，记录耗氧速率。此为最大耗氧速率。</li>
	<li>使用公式“状态3耗氧速率 / 状态4耗氧速率”计算呼吸控制比（RCR）。</li>
	<li>吸出呼吸室中的全部溶液，并用双蒸水反复冲洗数次。</li>
</ol>
4. 测量线粒体膜电位（MMP）和质子驱动力（PMF）
<ol>
	<li>在乙醇中配制80 ng/mL的尼日里菌素溶液。 
	注意：这些化学物质溶于乙醇中，应尽量将添加的乙醇体积控制在1 μL以下，因为乙醇可解偶联电子传递系统，导致线粒体功能障碍。</li>
	<li>用双蒸水彻底冲洗反应室后，向呼吸室中加入1 mL OCM溶液，并用磁力搅拌子剧烈搅拌。这有助于确保溶液充分与空气饱和。将甲基三苯基磷（TPMP+）敏感电极加入反应室装置中。TPMP+电极应连接至pH计，读数通过pH计获取。</li>
	<li>向呼吸室中加入 0.35 mg 线粒体蛋白。</li>
	<li>加入1.25 µL 4 mM 鱼藤酮溶液以抑制复合物I。记录约2-5分钟的呼吸情况。当耗氧量趋于稳定时，记录耗氧速率。</li>
	<li>加入0.56 μL浓度为8 μg/mL的寡霉素溶液，使终浓度达到每0.35 mg线粒体蛋白含2.8 µg寡霉素，以抑制ADP的利用。记录约2–5分钟的呼吸情况。当耗氧量趋于稳定时，记录耗氧速率。</li>
	<li>加入0.112 μL 80 ng/mL尼日里菌素溶液，以消除线粒体内膜两侧的pH梯度。记录约2–5分钟的呼吸情况。当耗氧量趋于稳定时，记录耗氧速率。 
	注意：鱼藤酮和寡霉素分别用于阻断电子传递链的复合物 I 和 ATP 合酶。加入尼日里菌素可将跨膜 H+ 梯度转化为可用电极测量的 K+ 梯度。</li>
	<li>通过向线粒体孵育体系中加入5 µL 10 mM TPMP+溶液，制备TPMP+的标准曲线。重复此步骤四次，直至TPMP+的总浓度达到2.5 μM。</li>
	<li>通过向反应室中加入 5 μL 1M 琥珀酸启动呼吸。</li>
	<li>记录呼吸信号直至获得稳定的曲线，然后通过添加丙二酸进行系统滴定。依次向孵育室中加入0.5 µL、1 µL、1.5 µL、3.0 µL、6.0 µL、9.0 µL和12.5 µL的0.1 mM丙二酸溶液，使孵育室中丙二酸的终浓度依次达到0.1、0.2、0.3、0.6、1.2、1.8和2.5 mM。</li>
	<li>从两个电极（氧气和TPMP）收集数据+可使用氧图仪系统配套的数据采集软件，同步收集线粒体耗氧量和线粒体膜电位的测量数据，并实时观察耗氧量的变化。 图14 展示氧电极系统如何随着实验的进行记录氧气消耗量。</li>
	<li>根据能斯特方程计算以 mV 为单位的线粒体膜电位（MMP）： 
	MMP = 61.5 × log（[添加的TPMP⁺] – 外部[TPMP⁺]）× TPMP⁺结合校正 /（0.001 × 蛋白质毫克数/mL × [TPMP⁺]） 
	一种TPMP+结合校正方法，每毫克线粒体蛋白校正0.4 µL-1 被使用。 
	根据方案中的浓度进行的示例计算： 
	MMP = 61.5 × log (5 µM – 2 µM) × 0.4 / (0.001 × 0.35 mg线粒体蛋白/mL × 2 µM) 
	MMP = 198.9 mV</li>
	<li>通过绘制MMP图来估算PMF 与 氧气消耗（图15). PMF 报告为膜电位 165 mV 时的耗氧量。 
	注意：通过丙二酸（0.1 至 2.5 mM）滴定电子传递链，可显示质子漏对线粒体膜电位（MMP）的动力学响应。随后，通过绘制氧消耗量与MMP的关系曲线，确定质子漏动力学。质子动力势（PMF）通过计算在相同膜电位（165 mV）下的氧消耗量来确定。</li>
	<li>在样品最后一次运行结束时，加入FCCP（终体积0.2 μM），以诱导最大呼吸并释放TPMP+，用于基线校正。</li>
	<li>吸出呼吸室中的所有溶液，用双蒸去离子水冲洗数次。每天实验结束后，还需用乙醇冲洗数次。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该实验方案中最关键的步骤是获取具有代表性的肝组织样本，并在活检后尽快开始线粒体的分离。由于从奶牛到实验室的运输时间较短，呼吸测量值的变异程度较低（表1）。为缩短运输时间，我们在奶牛场办公室内设立了一个小型实验室，每采集一个肝组织样本后即刻送往该办公室内的实验室，确保在活检后10分钟内完成线粒体的分离。在样本采集和处理前一天，预先搭建并测试呼吸室及电极（氧气电极、TPMP+电极），同时校准用于记录质子梯度变化的pH计，可避免出现诸如质子漏动力学早期测量数据缺失等仪器故障（图16）。
由于需要新鲜的肝组织样本并快速分离线粒体，每天能够收集和处理的样本数量有限。每个样本的处理时间约为5至6小时，因此每个呼吸测定室每天大约只能完成5个样本的收集与分析。该方法通量较低，处理组的样本量受限，且微小的误差可能增加结果的变异性，影响显著性检测的能力。
分离技术可能会排除一些与细胞组分相关联的线粒体，这些线粒体会残留在沉淀中，或者在离心步骤的沉淀洗涤过...

线粒体对应激非常敏感，其细胞内环境可能与多种代谢性疾病相关。线粒体的耗氧量和质子泄漏是衡量线粒体健康状况的指标。本文所述方法通过基于有无质子泄漏情况下的耗氧量，利用呼吸控制率（RCR）来估算线粒体的能量效率。这些结果可解释营养物质利用过程中约30%的能量损失1。耗氧量和质子泄漏的变化能够识别导致代谢性疾病的线粒体功能障碍，并反映能量效率的下降。这些方法还可用于评估不同处理对线粒体呼吸的影响。测定线粒体耗氧量和质子泄漏动力学的总体目标是评估线粒体功能及能量利用效率。
肝脏线粒体功能障碍已与奶牛的多种疾病相关。在泌乳早期面临能量负平衡时，细胞代谢在碳水化合物和脂类燃料之间转换的能力受到细胞内线粒体数量和功能的影响2。当线粒体无法适应能量需求增加以及β-氧化增强时，可能导致细胞内脂质积聚，进而引发胰岛素抵抗，并可能造成泌乳早期奶牛脂肪肝的形成。线粒体是酮体生成和利用的场所，因此在奶牛酮病中可发挥关键作用3。线粒体数量不足或功能障碍将影响外周组织的能量供应，并反映为氧耗量或呼吸控制率（RCR）的变化。
线粒体耗氧量会随炎症反应而发生变化。将7日龄的肉鸡随机分为两组，一组感染Eimeria maxima，另一组作为对照组4。未接受球虫感染攻击的肉鸡由于质子漏导致的耗氧量较低，且呼吸控制率（RCR）较高，表明肝脏线粒体在应对免疫刺激时会增加质子漏。尽管过去质子漏和活性氧的产生曾被视为线粒体膜功能障碍的标志，并被认为会损害能量利用效率，但现在已知其在线粒体蛋白质和钙离子的导入5以及产热过程1中具有重要作用。
呼吸链中的电子泄漏使线粒体易于产生活性氧，并导致线粒体膜蛋白、脂质和线粒体DNA发生氧化损伤。随着线粒体老化，损伤尤其容易在线粒体DNA（mtDNA）中累积，从而进一步导致线粒体代谢功能障碍6，并增加奶牛对疾病的易感性。在实际生产中，许多家畜常被饲喂高水平的铜（Cu）、锌（Zn）和锰（Mn）等添加剂，以增强抗氧化功能。然而，饲喂高水平的Cu、Zn和Mn会因质子泄漏（状态4呼吸）7而导致产奶量下降，并增加氧气消耗。
以往关于线粒体功能在牛能量利用效率中作用的研究主要集中在线粒体耗氧量和质子泄漏的变化。有关奶牛的研究报道极少，大多数论文将肉牛的饲料残差（RFI）形式的生产效率与线粒体功能进行比较。研究人员通过测定泌乳荷斯坦奶牛以及泌乳肉牛（安格斯牛、布拉 Angus 牛和海福特牛）肝脏中的状态3、状态4和呼吸控制率（RCR），考察了线粒体呼吸速率的变异性8。研究未发现肉牛的线粒体呼吸与生长或泌乳性状之间存在相关性，但在荷斯坦奶牛中报告了线粒体呼吸与泌乳性状之间的相关性。在两项研究中，将肉牛的RFI与其肌肉线粒体的线粒体呼吸速率（状态3、状态4和RCR）进行了比较9,10。线粒体呼吸速率随干物质采食量（DMI）发生变化，较低的呼吸速率与较低效率的肉牛公牛相关。在另一项研究中，比较高RFI和低RFI公牛后代公牛的RFI值，并比较两组后代之间的线粒体呼吸速率和质子泄漏动力学11。组间差异源于增重，证实了增重不影响肉牛线粒体呼吸的结论。
本文通过一项实验，研究在给泌乳奶牛饲喂3种抗氧化矿物质后肝脏RCR的变化，以此说明测定呼吸状态4和状态3期间耗氧量以及质子动力势（PMF）的方法的应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;肝脏活检&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney 牛肝活检器械</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>缝合针</td><td>NA</td><td>NA</td><td>随缝合线提供</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># 用于刀柄和刀片</td></tr><tr><td>手术巾</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>注射针头（22号，2 1/2英寸）</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>牛用鼻缰</td><td>Tractor Supply Co.</td><td>101966599</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>棉纱布方块（4×4英寸）</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>医用剪刀</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>球虫病疫苗，每头牛0.75瓶</td><td></td><td></td><td>由兽医提供</td></tr><tr><td>梭菌疫苗</td><td></td><td></td><td>由兽医提供</td></tr><tr><td>肝活检用抗生素（Excenel），每100磅体重注射2 cc，连续3天</td><td></td><td></td><td>由兽医提供</td></tr><tr><td>聚维酮碘消毒液</td><td>Aspen Veterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪，静脉注射，剂量为0.010–0.015 mg/kg体重，浓度100 mg/mL</td><td></td><td></td><td>由兽医提供</td></tr><tr><td>2%盐酸利多卡因（10–15 mL）</td><td></td><td></td><td>由兽医提供</td></tr><tr><td>氟尼辛葡甲胺静脉注射，剂量为1 mg/kg体重</td><td></td><td></td><td>由兽医提供</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;线粒体分离（肝脏）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mL Wheaton 玻璃瓶，配带聚四氟乙烯（Teflon）研杵，间隙为0.16 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>匀浆机电机</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>匀浆探头</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>自动移液器（10 mL）</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>盛有冰的烧杯（500 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>制冷型微量离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒（适用于酶标仪的微孔板）</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（无脂肪酸）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>用于配制线粒体分离介质：220 mM 甘露醇、70 mM 蔗糖、20 mM HEPES、20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA 和 0.1%（w/v）无脂肪酸 BSA，&amp;nbsp;在 4 &amp;deg;C 下 pH 为 7.4，置于冰箱中可保存 2 天</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;线粒体耗氧量测定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧电极测定系统 + 克拉克型氧电极</td><td>Hansatech (PP Systems)</td><td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td>温控循环水浴泵</td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>克拉克型氧电极</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>自动移液器（1 mL）</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>随 OXY1 系统提供</td></tr><tr><td>小型磁力搅拌子</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器（10 &amp;mu;L）</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>用于配制线粒体耗氧量测定介质：120 mM KCl、5 mM KH2PO4、5 mM MgCl2、5 mM Hepes 和 1 mM EGTA，&amp;nbsp;在 30 &amp;deg;C 下 pH 为 7.4，含 0.3% 脱脂 BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮（4 mM 溶液）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸（1 M 溶液）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP（100 mM 溶液）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素（溶于乙醇，浓度为 8 &amp;mu;g/mL）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;线粒体膜电位与质子驱动力测定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP 电极</td><td>World Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂—溶液无需新鲜配制，但需在每次实验间保存于冷冻条件下&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙二酸（0.1 mM 溶液）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素（8 &amp;mu;g/mL 溶于乙醇），需保存于冷冻条件下</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>尼日尔菌素（80 ng/mL 溶于乙醇），需保存于冷冻条件下</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP 溶液：10 mM TPMP、120 mM KCl、5 mM Hepes 和 1 mM EGTA，&amp;nbsp;在 30 &amp;deg;C 下 pH 为 7.4，含 0.3% 脱脂 BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

测量荷斯坦奶牛肝脏线粒体耗氧量和质子泄漏动力学以估算线粒体呼吸

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

耗氧量、质子动力势（PMF）和质子漏是线粒体呼吸功能的测量指标，反映了线粒体将NADH和FADH转化为ATP的能力。由于线粒体也是氧气利用以及营养物质氧化生成二氧化碳和水的主要场所，其利用氧气并生成ATP的效率直接关系到动物的营养代谢效率、营养需求以及整体健康状况。本方法旨在检测线粒体呼吸功能，可用于评估不同药物、饮食及环境因素对线粒体代谢的影响。检测结果包括以质子依赖性呼吸（状态3）和质子漏依赖性呼吸（状态4）表示的耗氧量。状态3与状态4呼吸的比值定义为呼吸控制比（RCR），可反映线粒体的能量转化效率。线粒体质子漏是一种使线粒体膜电位（MMP）耗散的过程，其通过解偶联氧化磷酸化与ADP的结合，降低ATP合成的效率。本方法采用对氧气和TRMP+敏感的电极，并结合线粒体底物及电子传递链抑制剂，用于测定状态3和状态4呼吸、线粒体膜PMF（即生成ATP的潜力）以及质子漏。该方法的局限性在于肝组织必须尽可能新鲜，所有活检和检测需在10小时内完成，这限制了单人在一天内可采集和处理的样本数量，约为5个。然而，每个检测仅需1 g肝组织，因此对于奶牛等大型动物而言，所需样本量相对于肝脏总体积较小，且动物恢复所需时间较短。

显示RCR和质子漏出动力学阳性结果的数据分别见表1和图15。在本研究中7，测定了一组荷斯坦奶牛在产后70天时的RCR和质子漏出动力学，这些奶牛在之前28天内被饲喂5种不同水平的铜（Cu）、锌（Zn）和锰（Mn）。状态4（最大质子漏依赖性呼吸）有受到Cu、Mn和Zn矿物质摄入影响的趋势（p &lt; 0.1）。状态3呼吸（最大ATP刺激性呼吸）以及RCR = 状态3 / 状态4（呼吸控制比）则未受矿物质摄入的影响。状态4呼吸在LowMn组中最高，在对照组中最低，表明Mn在减少质子漏依赖性呼吸方面具有重要作用。已知锰通过锰超氧化物歧化酶（Mn Superoxide Dismutase）可减少线粒体基质中的活性氧物质，从而降低质子漏12。较高的状态4呼吸与较低的乳产量和乳蛋白产量相关。由于质子漏是能量利用效率的重要组成部分，通过补充Mn降低状态4呼吸可能有助于提高能量利用效...

本文介绍了测量线粒体耗氧量（营养能量学的核心概念）以及质子漏（线粒体生成ATP效率低下的主要原因）的方法。这些结果可解释营养利用过程中30%的能量损失，有助于评估线粒体功能。

氧气消耗、质子驱动力（PMF）和质子漏是线粒体呼吸功能的测量指标，用于评估线粒体将……转化为能量的效率。

该方法有助于解答能量学领域的关键问题，例如线粒体健康、能量转化效率以及能量利用情况。该技术的主要优势在于能够直接测量分离线粒体的耗氧量，结果无需校正其他细胞内代谢过程的干扰。当我们希望研究线粒体效率如何影响饲料效率时，首次决定在奶牛中采用此方法。该方法的视频演示至关重要，因为线粒体分离步骤难以掌握，需要操作一致且精确。奶牛肝脏样本取出后，应尽快在线粒体分离培养基中清洗样本，以去除红细胞。用剪刀将组织精细剪碎，放入含有足量分离培养基的预冷烧杯中，以保持组织湿润。将剪碎的肝脏转移至含有线粒体分离培养基的30毫升玻璃瓶中。加入一个间隙为0.16毫米且已在冰上预冷的聚四氟乙烯（Teflon）研杵，以每分钟500转的速度匀浆1分钟，每分钟进行4次研磨。此后，将匀浆转移至含有线粒体分离培养基的离心管中，并将该管置于装有冰块的烧杯内。在4℃条件下以500 × g离心10分钟。弃去沉淀，将上清液转移至预冷的离心管中。将所得上清液在 10,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，以获得线粒体沉淀。用 10 毫升含无脂肪酸 BSA 的线粒体分离培养基重悬并洗涤沉淀。然后在 8,100 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 200 µL 分离培养基中。置于冰上保存，待用于氧消耗和质子泄漏动力学测定。使用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，按照生产商说明书，采用二辛可宁酸试剂盒测定沉淀悬液的蛋白浓度。首先，按照文本方案中的说明配制氧气消耗培养基。将氧气消耗培养基在30摄氏度下孵育。接下来，根据制造商的说明设置氧电极系统所需的呼吸室、泵和氧电极。然后将1毫升氧气消耗测定用培养基加入呼吸室中。随后向呼吸室中加入0.35毫克线粒体蛋白。剧烈搅拌以确保溶液充分与空气饱和，并维持温度为30摄氏度。记录约五分钟的氧气消耗量。当氧气消耗趋于稳定，表现为一条下降的直线时，将此记录为基线氧气消耗量。加入1.25 µL的4 mM鱼藤酮溶液以抑制复合体I，然后加入5 µL的1 M琥珀酸溶液，使呼吸室中琥珀酸的终浓度达到5 mM。这是IV态氧消耗。此后，加入1微升100毫摩尔/升的ADP溶液，使呼吸室中的终浓度达到100微摩尔/升。氧消耗将在约五分钟内下降，随后变为一条直线。将此耗氧量记录为III态呼吸。按照文本方案中所述计算呼吸控制比。然后吸出呼吸室中的所有溶液。用双蒸水冲洗腔室数次。首先，配制80纳克/毫升的尼日霉素乙醇溶液，所加乙醇体积需控制在1微升以下。同时，配制8微克/毫升的寡霉素乙醇溶液。用双蒸水彻底冲洗呼吸室后，向呼吸室内加入1毫升耗氧培养基，并用磁力搅拌子剧烈搅拌。向呼吸室中加入0.35毫克线粒体蛋白。将甲基三苯基磷鎓敏感电极插入呼吸室装置中，并确保另一端正确连接至pH计。加入1.25 µL的4 mM鱼藤酮溶液以抑制复合物I。记录2至5分钟的呼吸情况，并在氧消耗值趋于稳定时记录该数值。接着，加入0.56 µL寡霉素溶液以抑制ADP的利用。记录约两到五分钟的呼吸情况。当氧气消耗值趋于稳定时，记录该数值。然后加入0.112微升浓度为80纳克/毫升的尼日里菌素溶液，以消除线粒体内膜两侧的pH梯度。记录呼吸两到五分钟，当氧气消耗值趋于稳定时记录该数值。向线粒体孵育液中加入5微升10毫摩尔的三苯基甲基溴化膦溶液，开始制备标准曲线。重复此步骤四次，直至总浓度达到2.5。已加入微摩尔浓度的物质。随后，向反应室中加入五微升一摩尔的琥珀酸溶液以启动呼吸作用。记录呼吸过程，直至获得稳定的曲线。然后按照文本方案中所述，加入丙二酸以滴定系统。本研究中，在荷斯坦奶牛饲喂不同水平的铜、锌和锰28天后第70天，测定其乳汁中的呼吸控制率（RCR）和质子漏泄动力学。结果显示，接受低水平锰饲喂的奶牛其状态IV呼吸最高，而对照组奶牛最低，表明锰在减少依赖质子漏泄的呼吸过程中发挥重要作用。对肝脏质子泄漏依赖性呼吸的分析显示，低锰处理组奶牛的该呼吸作用最强，而对照组奶牛最低。这些结果证实，低锰组的状态IV呼吸最高，而对照组最低。尽管来自低饲料效率残留值（RFI）公牛的安格斯阉牛的饲料效率高于来自高RFI公牛的个体，但这一差异并未体现在线粒体呼吸控制比（RCR）或质子泄漏动力学上。在进行该实验操作时，处理线粒体的过程中，必须将所有离心管和烧杯保持在冰上。该技术建立后，为乳品营养学领域的研究人员探索线粒体效率在饲料利用率中的作用以及肝脏中线粒体功能奠定了基础。请注意，使用鱼藤酮可能存在危险，因此在进行该操作时，必须采取佩戴手套、护目镜及适当的个人防护装备等安全防护措施。

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Biochemistry

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荷尔斯坦奶牛肝线粒体耗氧量和质子泄漏动力学评价线粒体呼吸

来源：Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros...

活细胞和透化细胞中线粒体呼吸的氧通量测量

本文所述方法提供了利用少量小鼠骨骼肌分离的线粒体进行基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。这些实验能够检测常用动物模型中线粒体氧消耗的机制性变化与适应性改变。...

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通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

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测量荷斯坦奶牛肝脏线粒体耗氧量和质子泄漏动力学以估算线粒体呼吸

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