基于叶酸受体靶向的表面增强共振拉曼散射纳米探针比率法检测微小卵巢癌

该方法采用纳米颗粒的局部应用来成像微小肿瘤，尤其适用于尚未侵入血管系统的恶性肿瘤，例如卵巢癌的转移灶。该技术具有比率测量特性，可在单次扫描中同时成像靶向性和非靶向性纳米颗粒，从而减少假信号并揭示肿瘤的真实范围。这些纳米颗粒可通过腹腔内或静脉注射给药，实现对卵巢癌及多种其他肿瘤类型的高精度成像。

在4°C条件下，将含有800毫升新鲜配制的抗坏血酸溶液的锥形瓶置于磁力搅拌器上，启动搅拌形成稳定的漩涡。迅速将8毫升新鲜配制的四氯金酸溶液加入漩涡中。数秒内即形成金纳米星，溶液变为深蓝色。

将纳米星悬液倒入50毫升锥形管中进行离心，离心结束后用移液器吸除每根离心管中除最后200微升上清液以外的全部液体。使用微量移液器将每根管中的纳米颗粒重新悬浮，然后将所有纳米颗粒汇集至一个透析盒中。随后，将纳米颗粒在2升去离子水中透析至少三天，每天更换一次水。

进行二氧化硅壳层形成时，首先在50毫升锥形管中加入10毫升异丙醇、500微升TEOS、200微升去离子水和60微升染料。然后在15毫升管中加入3毫升乙醇和200微升氢氧化铵。接下来，对透析后的纳米星进行超声处理以分散任何聚集体，并将1.2毫升纳米星加入该管中。

将50毫升离心管置于涡旋混合器上，形成稳定的漩涡。迅速将纳米星溶液加入该50毫升离心管中，继续混合约5秒钟，随后立即将离心管转移至摇床中，在室温下以300 RPM振荡15分钟。两个管中的溶液必须迅速混合，并在持续混匀的条件下完成，以确保硅化反应发生在纳米星表面，同时尽量减少游离二氧化硅的生成。

孵育结束后，用乙醇充满离心管以终止反应，并通过离心收集纳米星。用移液器吸除上清液，仅保留约最后500微升，注意不要扰动沉淀；随后将纳米颗粒重悬于1毫升新鲜乙醇中。然后将溶液转移至1.5毫升离心管中，通过离心进行四次每次1毫升乙醇的洗涤，每次洗涤之间用超声处理约1秒使沉淀重新悬浮。

为了将巯基引入颗粒表面，在最后一次洗涤后，将沉淀重悬于1毫升含85%乙醇、10% 3-巯基丙基三甲氧基硅烷和5%去离子水的溶液中，在室温下孵育1至2小时。孵育结束后，按前述方法通过离心洗涤巯基功能化的纳米颗粒，每次洗涤之间通过超声处理重新分散沉淀。对于抗体功能化的抗叶酸受体纳米探针，将200微克抗叶酸结合蛋白抗体与10倍摩尔过量的PEG交联剂在500微升HEPES缓冲液中反应。

30分钟后，使用离心滤器通过离心浓缩抗体，并将滤器倒置插入新离心管中进行额外离心以回收抗体。然后将巯基功能化的纳米颗粒与浓缩的抗体混合，并在室温下孵育至少30分钟。为了制备非靶向纳米探针，将5毫克甲氧基封端的马来酰亚胺-PEG 5000溶于DMSO中，加入至500微升HEPES缓冲液中的巯基功能化纳米颗粒内，在室温下孵育至少30分钟。

进行纳米探针注射时，先将两种类型的纳米探针离心，然后将沉淀重悬于新鲜MES缓冲液中，使其浓度为600皮摩尔。混合纳米颗粒后，将1毫升该溶液装入一支带有26号针头的1毫升注射器中，每只小鼠腹腔注射全部体积。随后轻轻按摩小鼠腹部，以促进纳米颗粒在腹腔内的均匀分布。

在安乐死后至少25分钟，将注射处理过的动物的四肢固定在手术平台上，使用有齿镊子和解剖剪去除皮肤以暴露腹膜。切开腹膜，将腹膜瓣固定在手术平台上，并用至少60毫升的PBS冲洗腹腔内部。

然后将平台转移至具有直立光学构型和电动载物台的拉曼分光光度计中，并在适当的成像参数下对腹部进行成像。确保拉曼扫描的焦平面位于大部分内脏表面至关重要。如果器官不在焦平面上，所获得的信号将无法使用。

出于质量控制的目的，可在合成过程中采用多种方法对纳米颗粒进行表征，包括透射电子显微镜、动态光散射、纳米颗粒追踪分析以及紫外-可见吸收光谱。拉曼测量结果显示，在整个合成过程中每种类型的纳米颗粒均呈现出其特有的光谱特征。典型的反应产率和浓度在很大程度上取决于洗涤步骤中的移液技术。

可对拉曼光谱进行处理以去除荧光，并归一化至单位面积，以在应用经典最小二乘法前校正信号强度。尽管经典最小二乘法在每种纳米探针参考光谱上的得分本身并不能提供肿瘤的具体位置，但逐点比值能够揭示弥散性微转移的存在。在进行该操作时，需始终记住在合成的每一步均对纳米颗粒进行验证，因为纳米颗粒的质量会显著影响最终结果。

该技术展示了研究人员利用SERRS纳米探针在动物模型和切除的患者组织中以高显微精度检测肿瘤相关标志物的潜力。