用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

该方案具有重要意义，因为多重免疫荧光方案的开发、优化与转移过程复杂且具有挑战性。对于许多实验室而言，获得一个经过优化的实验方案是极为宝贵的。多光谱免疫荧光技术使我们能够评估肿瘤内部及周围多种细胞类型的定位及其身份特征。

这是肿瘤免疫学研究中一种强大的信息组合。多重免疫荧光最具说服力的应用领域就是肿瘤免疫学。但在原位同时检测多种免疫细胞类型的能力，也可广泛应用于所有自身免疫性和炎症性疾病的治疗研究中。

了解免疫细胞在实体细胞内部及其周围的位置和表型，对于预测肿瘤特异性免疫治疗的预后和治疗反应具有重要意义。方案的优化与验证是关键步骤，不应仓促进行。新使用者应熟悉与多光谱成像相关的新型人工假象。

为了找到基础的多重染色方案，请先将其加载到自动染色仪上。在方案界面中，将筛选条件设置为显示“全部”而非“首选”。在进行修改前，先保存原始方案，然后点击“方案”标签页，右键单击 Opal 6 Multiplex 并选择“复制”。

在新窗口中将名称更改为“7 多重检测方案 1”，并选择与正确设备关联的选项卡。参照补充表 S1 中的方案，点击“添加试剂”以加入一个持续十分钟的过氧化物酶抑制步骤，并选择过氧化物酶抑制剂作为试剂。确认封闭步骤使用的是蛋白激酶抑制剂封闭缓冲液，每一步一抗对应正确的试剂，二抗步骤使用辣根过氧化物酶聚合物，且使用多光谱自动化试剂盒中提供的光谱DAPI。

确保该实验方案包含过氧化物酶抑制剂，随后进行六轮连续染色，每轮依次包含蛋白封闭步骤、一抗、二抗、酪胺信号放大（Tyramide）染色，然后进行抗原修复以去除抗体。为添加滴加对照，复制“7重多重染色方案1”的名称，并将其更改为“7重多重染色方案1 CD68滴加对照”。将CD68抗体试剂更改为小鼠IgG，然后保存该方案。

然后，再创建六个新的实验方案，分别为每个滴定对照以及完整的同型对照，创建方法与上述相同。针对每个靶标，均按照此处演示的方法建立滴定对照方案。为准备多重检测研究试剂盒，请将标记为1X Tris缓冲盐水的30毫升敞口容器中装入1X Tris缓冲盐水，并将该容器放置于多重研究试剂盒1中距离手柄最远的位置。

取两个30毫升的敞口容器，分别标记为“多光谱封闭液”和“多光谱二抗”，从多光谱染色试剂盒中取30毫升封闭缓冲液抗体稀释液加入多光谱封闭液容器中。从多光谱染色试剂盒中取30毫升抗小鼠抗兔二抗聚合物加入多光谱二抗容器中，并向十个7毫升的敞口容器中各加入600微升抗体稀释液。接着，根据表格中指示的体积，将浓缩的一抗加入相应的试管中，并通过轻柔吹打混匀。

向一个7毫升的敞口容器中加入3毫升双蒸水和12滴光谱级DAPI，向另一个7毫升的敞口容器中加入3毫升过氧化物酶阻断液。用75微升二甲基亚砜重悬每种冻干粉，并通过移液混匀。然后，将酪胺信号放大（Tyramide signal amplification）储备液储存于4摄氏度，待用时取出。

在制备单个TSA平板梯度稀释液的同时，将所有试剂登记在自动染色仪上，然后将每个容器放入试剂架中，并将所有试剂装载到自动染色仪上。染色仪将检测每种试剂的存在并确认其体积。

所有试剂加载完毕后，启动程序并过夜运行。染色程序结束后，用盖玻片封片，并将样本载入多光谱成像平台扫描仪进行扫描。所有样本扫描完成后，图像将被格式化为 qptiff 文件。

打开合适的 qptiff 分析软件程序，点击“加载切片”以打开目标切片的五通道全切片扫描图像。登录后，使用图章工具选择五个区域进行多光谱成像。在“选择用于：”中选择“采集”，在“视野大小：”中选择“1x1”，在“视野分辨率”中选择“0.5 微米 20x”。

根据细胞角蛋白染色结果，从整体扫描图像中选择多个同时包含细胞角蛋白阳性肿瘤组织和细胞角蛋白阴性间质组织的区域进行成像。当所有多光谱图像均选定后，切换至Vectra软件，将每张切片的任务由“扫描”更改为“多光谱成像”。然后，点击扫描以执行多光谱图像采集。

当完成多光谱图像采集后，使用光谱分离软件打开多光谱图像文件夹中的文件。在图像格式中选择“多光谱”，在样本格式中选择“荧光”，在光谱库来源中选择“inForm”。为选择图层，请从样本库切片中选择并加载全部六个图层以及DAPI，然后点击“准备全部”。光谱分离软件将利用提供的光谱特征对所有已打开的图像执行光谱分离。

识别并标注自体荧光的光谱特征。务必检查自体荧光特性，确保在光谱分离后，自体荧光信号被完全保留在自体荧光通道中，并通过测试不同的采样参数直至其被可接受地去除。随后，在同一组织的连续切片中，由病理学家将染色模式与相同靶标的显色单染结果进行比对评估。

为了评估每个通道的荧光强度，使用计数工具对打开的图像进行检测。然后返回染色方案，调整TSA浓度，以校正超出或未达到可接受范围的标准化计数。在此代表性分析中，扁桃体组织显示出清晰界定的细胞角蛋白染色，位于扁桃体表面和鳞状上皮内，淋巴组织中无背景信号，同时在隐窝的网状上皮中可见细胞角蛋白和PDL-1染色。

滤泡生发中心易于辨认，且富含Ki-67阳性淋巴细胞。生发中心内的巨噬细胞通过其CD-68表达得以识别，部分巨噬细胞亦可见于生发中心外。CD-8染色的淋巴细胞呈T细胞分布，而PD-1表达则强烈标记了聚集在生发中心周边以及散在分布于滤泡间区域的小淋巴细胞。

在确认扁桃体组织对照中出现预期的染色模式后，即可在肺癌样本中评估相同的染色结果。同时应评估同型阴性对照和加样对照；这不仅有助于检测背景信号和自发荧光，还可识别伞状效应和光谱溢出。在优化新的多重免疫荧光检测面板时，加样对照对于评估多重免疫荧光方法可能引起的染色假象具有重要意义。

每个去抗体对照应显示与完整多重检测面板相同的染色模式，仅缺少各自对应的单一一抗。通过多光谱免疫荧光进行免疫谱型分析，能够依据免疫学标准对肿瘤及其区域进行分层，进而可在同一组织切片中开展大规模多重基因组、转录组和蛋白质组研究。我已应用多重免疫荧光技术研究肿瘤学及自身免疫性疾病的作用机制，该技术可在单一切片中实现对免疫细胞和致病细胞的鉴定与表征。

在使用针对人类蛋白质的抗体、Tyramide 和 DAPI 时应采取常规预防措施，但本方案中所使用的任何试剂或材料均未被认定具有特别危害性。