Name: 福尔马林固定癌组织标本免疫肿瘤学自动复合免疫荧光小组研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 了解多重免疫荧光技术用于肿瘤免疫学研究的方法，使用自动化染色仪处理福尔马林固定癌组织标本。该技术可同时检测六种标志物，帮助研究人员评估肿瘤微环境中多种免疫细胞类型的分布与特性。

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编辑支持由MedImmune的Deborah Shuman提供。

注意： 本方案介绍如何在自动化染色仪上使用 TSA 技术对六种抗体（CD68、ki67、PD-L1、PD-1、CD8 和 AE1/AE3）组成的 mIF 面板进行免疫谱型分析（参见材料表）。该方案还描述了如何进行“缺失对照”（drop controls），以对新建立的 mIF 面板进行质量控制（参见补充材料）。在本方案中，使用来自人扁桃体（阳性对照）的八张未染色 FFPE 切片和来自人肺腺癌的八张未染色切片进行染色。第一张切片用于包含全部六种标志物的全多重染色，第二张切片用于同型对照（不使用任何一抗），其余六张切片用于缺失对照（参见补充材料）。强烈建议额外设置组织自发荧光对照，且在所有多重研究中均应包含该对照（参见补充材料）。然而，研究人员可根据自身项目目标选用其他肿瘤类型和对照。对于此前无 mIF TSA 方法及多光谱扫描技术经验的实验室操作人员，建议阅读《多重免疫组化开发指南》（可在线获取，网址：http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp）。尽管该指南描述的是手动操作流程，但仍为 mIF 染色方法提供了良好的入门指导。本方案所使用的所有组织切片均已匿名化处理，并符合《赫尔辛基宣言》的要求。
1. 组织样本
<ol>
	<li>选择含有淋巴组织增生的FFPE人扁桃体样本作为阳性对照，并选择已知PD-L1阳性的FFPE人肺腺癌样本。复查所选肺癌组织块的苏木精-伊红（H&amp;#38;E）切片，以确认肿瘤的存在。应避免使用坏死区域广泛的肿瘤，因为这可能会增加非特异性背景染色。 
	注意：在本优化过程中，避免使用储存10年或更长时间的石蜡包埋组织块，以及石蜡块中呈现干燥外观的组织（请咨询组织学技术人员）。</li>
	<li>使用切片机从每个组织块连续切取10张厚度为4 µm的连续切片。将切片展于用于免疫组化（IHC）的带正电荷的玻璃载玻片上，每张载玻片放置一张切片。 
	注意：切片必须平整贴附，不得有皱褶，因为皱褶可能导致染色伪影。将连续切片的载玻片按顺序编号为1至10。</li>
	<li>对第一张切片制作新的H&amp;#38;E染色切片。在病理医师协助下复查H&amp;#38;E切片，以确认扁桃体组织或肺部肿瘤在组织块中仍然存在。 
	注意：该H&amp;#38;E切片可在后续多光谱分析和表型鉴定中，辅助选择感兴趣区域。</li>
	<li>将未染色的切片置于塑料载玻片盒中，于4 °C保存，最长可保存三个月。</li>
</ol>
2. 在自动化染色仪上创建新的多重免疫荧光染色程序：试剂注册
注意：在自动染色机软件中，试剂必须先添加到试剂列表中，然后才能在实验方案中使用。有关自动染色机型号和软件版本的信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>在自动染色机软件中点击 试剂 选项卡。点击 添加 以定义一种新试剂。输入名称（例如，&#34;520 TSA Reagent&#34;）和缩写名称（例如，&#34;520 TSA&#34;），注意缩写名称最多为八个字符。从下拉菜单中选择 辅助试剂，并设置供应商。请勿更改 单染/双染 选项，默认保持为 单染/连续双染。将默认染色程序设置为 程序 F，将默认 HIER 程序设置为 ER1 20。</li>
	<li>保存新试剂，并对 表 1 中列出的所有试剂重复步骤 2.1。</li>
</ol>
3. 自动染色机：容器的注册
<ol>
	<li>在每个容器的侧面写明将要使用的试剂名称。扫描容器侧面的条形码，在弹出的窗口中从列表中选择正确的试剂，选择有效期并保存。</li>
	<li>对表1中列出的所有试剂重复步骤3.1的操作。</li>
	<li>注册Open Research Kit，扫描试剂盒侧面的两个条形码，并按照屏幕提示操作。将该试剂盒命名为&#34;Multiplex Research Kit 1.&#34;，并将1x三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）缓冲盐溶液作为该试剂盒的一部分进行注册（表1）。</li>
</ol>
4. 自动染色仪：mIF 实验方案程序的建立
<ol>
	<li>新的自动染色机上已预装名为 Opal 7 Multiplex 的基础多重染色程序（参见材料表中的型号和软件版本）。在程序界面中，将筛选条件由“&#34;首选&#34;”更改为“&#34;全部&#34;”，以查找该程序。如果设备中不存在该基础程序，请联系制造商协助更新自动染色机的软件。</li>
	<li>所有修改均应在原始程序的副本上进行。在修改前，先保存原始程序，然后点击程序选项卡，右键单击Opal 7 Multiplex程序并选择复制以创建副本。</li>
	<li>在新窗口中将程序名称更改为7 Multiplex protocol 1，并选择与正确设备对应的选项卡（落地式或台式）。参照补充表 S1中的程序设置。点击添加试剂，增加一个10分钟的过氧化物酶抑制步骤（此步骤不属于标准程序），并选择过氧化物酶抑制剂作为该步骤的试剂。</li>
	<li>确认封闭步骤使用的是PKI封闭缓冲液。确保每种一抗对应正确的试剂，二抗步骤使用HRP聚合物，并使用多光谱自动化试剂盒中提供的光谱4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。通过在程序界面的下拉菜单中检查每个步骤所指定的试剂，确认所有选择无误。</li>
</ol>
5. 自动染色机：滴加对照的添加及同型对照方案
<ol>
	<li>复制名称 7 Multiplex protocol 1，并将其更改为 7 Multiplex protocol 1 CD68 DROP。将试剂 CD68 antibody 更改为 Mouse IgG，然后保存该方案。</li>
	<li>以相同方式再创建六个新方案，分别为每种drop对照各创建一个，并为完整的同型对照创建一个（将所有抗体更改为相应的同型对照抗体）。</li>
</ol>
6. 自动染色机：切片制备方案
<ol>
	<li>复制预染色方案 *Bake and Dewax，并将此方案重命名为 多光谱烘烤与脱蜡 2 小时。</li>
	<li>调整方案以匹配 表 2 中所示的试剂。在 60 °C 下烘烤载玻片 2 小时，在 72 °C 下脱蜡 30 秒。</li>
</ol>
7. 自动染色机：试剂的准备
<ol>
	<li>准备一个研究检测试剂盒。其中一种试剂必须永久与该试剂盒关联，因此将标记为1x Tris缓冲盐水（TBS）的30 mL敞口容器用1x TBS填充，并将其放置在指定为Multiplex Research Kit 1的研究检测试剂盒中的位置1（离手柄最远的位置）。该试剂将永久与此研究试剂盒关联，在后续使用中不得更改其位置。</li>
	<li>标记两个30 mL敞口容器，分别为多光谱阻断液和多光谱二抗。将来自多光谱染色试剂盒的封闭缓冲液/抗体稀释液30 mL加入多光谱阻断液容器中；将来自多光谱染色试剂盒的抗小鼠/抗兔二抗聚合物30 mL加入多光谱二抗容器中。</li>
	<li>准备十个7 mL敞口容器。所需体积（以微升计）为600 + (150 × [玻片数量])。本实验中每种抗体将应用于12张玻片（6张扁桃体和6张肺组织）。所有容器的标签及体积详见表3。</li>
	<li>对于每种一抗管，首先加入抗体稀释液，然后按表3所示体积加入浓缩的一抗，通过轻柔吹打混匀。</li>
	<li>准备一个7 mL敞口容器用于DAPI染色，每毫升双蒸水中加入4滴DAPI浓缩液；共16张玻片需进行DAPI染色（600 + [150 × 16] = 3,000 µL）。向容器中加入3 mL双蒸水和12滴光谱DAPI。每次实验均需新鲜配制DAPI溶液。</li>
	<li>准备一个7 mL敞口容器用于过氧化物酶抑制剂。全部16张玻片均需使用过氧化物酶抑制剂处理（600 + [150 × 16] = 3,000 µL）。向容器中加入3 mL过氧化物酶阻断液。</li>
	<li>在配制荧光工作液前，向厂家提供的每种冻干荧光染料管中加入75 µL二甲基亚砜，重悬所有冻干荧光染料。通过移液器吹打混匀。此即TSA荧光染料储备液。储存于4 °C。</li>
	<li>准备六个滴定容器，每种荧光染料各一个。&#160;所需体积（以微升计）为350 + (150 × [玻片数量])。本实验中每种荧光染料将应用于16张玻片（8张扁桃体和8张肺组织）。所有容器的标签及体积详见表4。</li>
	<li>当所有试剂均已登记并配制完成后，将各容器置于支架上的任意位置，并将所有试剂装载至全自动染色仪上。仪器探针将确认每种试剂的体积。</li>
</ol>
8. 自动染色仪：样本设置与多光谱染色
<ol>
	<li>在自动染色机软件中，点击屏幕顶部的“载玻片设置”。点击“添加研究”。在弹出窗口中填写研究编号、研究名称和备注。
	<ol>
		<li>从下拉列表中选择进行染色操作的研究人员姓名。分配体积保持为 150 µL。在 制备程序 中选择 多光谱脱蜡。点击 确定 并&#160;添加载玻片。在 备注 栏中输入 &#34;多重染色1 肺组织 123ABC&#34;。按以下要求填写各项： 组织类型 = 测试组织；分配体积 = 150 µL；染色模式 = 单次，常规；标记物 = 阴性；染色 = 输入 &#34;7重多重染色程序1&#34;；制备 = 多光谱烘烤，脱蜡2小时；HIER = 使用ER1进行HIER处理20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 添加载玻片，并修改备注和程序以添加滴加对照载玻片和同型对照载玻片。当所有载玻片均已添加至研究中后，关闭 添加载玻片 窗口并打印标签。将标签贴至每张载玻片对应的标签区域。</li>
	<li>将载玻片装入支架中，按正确方向盖上盖片，将支架插入自动染色机，并降下托盘。设备将自动扫描载玻片标签。</li>
	<li>当所有载玻片和试剂均完成扫描和测量后，运行按钮（►）将变为可点击状态。若自动染色机检测到任何错误（如试剂体积不足），受影响的托盘旁将出现黄色警示符号。若发生错误，请右键点击警示符号并排除故障。&#160;</li>
	<li>立即启动染色程序或设定延迟启动。该程序持续时间约为14小时。注意：请确保程序结束时能够立即取出载玻片，因为过度洗涤可能影响染色结果。&#160;</li>
</ol>
9. 多光谱切片的封片
<ol>
	<li>从自动染色机中取出载玻片，并将其存放在盛有1x TBS的染色架中。</li>
	<li>使用1.5号盖玻片和15 µL封片介质（见材料表）封固样本。用移液器吸头轻轻按压盖玻片以去除气泡。</li>
	<li>将载玻片置于实验台面上，室温下避光静置过夜固化。未完全固化的载玻片可在小心操作下立即进行扫描。</li>
</ol>
10. 多光谱扫描仪
<ol>
	<li>打开多光谱扫描仪及其计算机电源（有关型号和软件信息，请参见材料表）。启动显微镜控制软件。按下设备前面的触控按钮，打开多光谱扫描仪的前门。扫描仪中的每个弹簧加载载具可容纳四张载玻片。将所有载玻片装入载具中，并在将载具装入设备前记录其顺序。</li>
	<li>选择编辑方案，然后点击新建…；接着创建方案名称多重检测面板1和抗体缺失对照。创建研究名称多重检测面板开发，点击创建方案，输入全片扫描滤光片 DAPI；然后选择全片扫描和像素分辨率 0.50 µm (20X)。所有滤光片和波段均应被包含。若未全部包含，请点击编辑滤光片和波段，选中全部五个滤光片（DAPI、FITC、CY3、Texas Red 和 CY5），然后点击设置曝光。</li>
	<li>通过选择装有肺腺癌多重染色样本的载具来加载载具。使用图形用户界面选择正确的载玻片。通过手动或自动对焦功能对组织进行对焦。导航至DAPI染色效果良好的区域，点击自动曝光以设置曝光时间（单位为毫秒，范围为0–2,000 ms）。</li>
	<li>对“全片扫描”和“MSI区域”两列中的全部五个滤光片组重复相同操作。在为每个滤光片和放大倍数设置曝光前，务必导航至染色效果良好的区域并对显微镜重新对焦。对20倍全片扫描和20倍多光谱成像（MSI）区域中的全部五个滤光片执行自动曝光。设置像素分辨率为0.50 µm (20x)。保存方案后，点击返回回到Vectra软件主界面；然后点击扫描载玻片。</li>
	<li>打开每张载玻片的界面，将任务设置为扫描。将研究设置为多重检测面板开发，将方案设置为多重检测面板1和抗体缺失对照，将载玻片ID设置为多重肺ABC123、CD68缺失对照肺ABC123等。 当所有载玻片均被标记且任务设置完成后，点击扫描。自动化多光谱扫描仪将使用全部五个滤光片对所有载玻片进行全片扫描。</li>
</ol>
11. 多光谱扫描仪：多光谱成像
<ol>
	<li>扫描完成后，打开 QPTIFF 软件（&#34;Phenochart&#34;），然后单击左上角的加载切片（Load Slide）。这将打开一个 QPTIFF 文件，即五通道全切片扫描图像。每个图层包含来自多个荧光染料的信息，因此其用途有限，但组织结构和广泛的表达模式清晰可见，可用于选择质谱成像（MSI）区域。</li>
	<li>使用左侧的下拉树导航并打开研究中正确的切片。在右上角使用用户姓名首字母登录。</li>
	<li>使用屏幕顶部的印章（Stamp）工具选择五个用于质谱成像（MSI）的区域。如有条件，应咨询病理学家。在选择用途（Select for）下选择采集（Acquisition）；在视野大小（Size in fields）下选择1×1；在视野限制（Field restriction）下选择0.5 µm（20×）。根据细胞角蛋白（CK）染色结果（主要在 Cy5 通道），从整体扫描图像中选择多个同时包含肿瘤组织（CK+）和间质组织（CK−）的区域。对每张切片重复此操作。</li>
	<li>完成所有质谱成像（MSI）区域的选择后，关闭Phenochart软件，返回到Vectra软件。将每张切片的任务类型从扫描（Scan）更改为质谱成像（MSI），然后再次单击扫描（Scan）以执行质谱成像数据采集。</li>
</ol>
12. 光谱解混
注意：光谱解混步骤是实现切片通道分离和图像分析所必需的。在使用inForm软件进行光谱解混之前，必须利用仅用单一荧光染料染色以及仅用DAPI染色的肺腺癌切片建立光谱库。该程序也在前述的多重IHC检测开发指南中有描述。
<ol>
	<li>当完成质谱成像（MSI）数据采集后，使用光谱解混软件（&#34;InForm&#34;）打开位于 MSI 文件夹中的文件。这些文件以 .im3 为扩展名。</li>
	<li>在 图像格式 下选择 多光谱；在 样本格式 下选择 荧光；在 光谱库来源 下选择 InForm。</li>
	<li>为选择荧光染料，从肺腺癌组织库切片所建立的光谱库中选择并加载全部六种荧光染料及 DAPI。点击 准备全部（左下角）。光谱解混软件将使用提供的光谱特征对所有已打开的图像进行光谱解混。</li>
	<li>与病理医师共同评估染色模式，并与同一组织连续切片中相同靶标的显色单染结果进行比对。</li>
</ol>
13. 荧光强度与信号衰减的评估
注意：计数工具显示为带有一个小棕色方框的箭头，是多重检测优化过程中最重要的工具，应频繁使用（参见补充材料）。在光谱解混软件中使用计数工具评估信噪比，其最小值应超过10:1（有关使用滴控对照评估多重染色的故障排除方法，请参见补充材料）。
<ol>
	<li>13.1. 在光谱解混软件中打开图像后，启用计数工具并扫描图像，以评估每个通道的荧光强度。肺组织中的目标强度应介于 10 至 20 个归一化计数之间。归一化计数工具如图 1所示。</li>
	<li>若任一标记物的信号最大计数低于 10，或正常信号区域计数低于 5，则应排除该切片，以避免自发荧光和非特异性染色干扰真实信号。</li>
	<li>若任一通道的最大计数超过 30，则应排除该切片，以防止光谱溢出或光谱解混效率降低。</li>
	<li>通过调整 TSA 浓度来调节过高或过低的归一化计数。</li>
</ol>
14. 多光谱图像分析
<ol>
	<li>在spectral unmixing software中打开一个或多个MSI文件，并仅选择在至少一个已打开图像中出现的荧光染料进行解混。点击Prepare All，对当前所有已打开的彩色图像进行解混，以获得光谱解混后的图像。</li>
	<li>选择计数工具，通过将光标悬停在感兴趣区域上，对每幅图像中的信号计数进行检测。</li>
	<li>选择眼睛图标以打开视图编辑器。选择并调整每个独立通道的显示强度。</li>
	<li>选择Configure以打开组织分割、细胞分割、表型鉴定和评分模块。这些工具可用于多重染色与显色单染之间的客观验证，并可用于生成定量的表型分析数据（Figure S1）。</li>
	<li>使用Export选项卡导出表型分析模块生成的灰度图像、荧光图像、类Pathview风格的无压缩TIFF图像以及数据文件，用于进一步分析、存档和展示（Figure S1）。</li>
</ol>

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<li>Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+it+is+just+good+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: it is just good science.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
</ol>

本工作由全球生物制剂研发部门MedImmune资助，&amp;D 为阿斯利康（AstraZeneca）的部门。C.W.、K.R. 和 C.C.H. 为 Perkin Elmer 公司员工，该公司生产了本研究中所使用的试剂（TSA 试剂盒）及多光谱扫描仪。M.S.、K.D.、A.H.、W.Z.、C. Bagnall、C. Brown、J.C.、A.L.、K.S.、M.R. 和 J.R.C. 为 MedImmune 公司员工，持有阿斯利康的股票所有权和/或股票权益或期权。

当前癌症免疫治疗的革命正在为癌症患者开辟全新且富有前景的治疗选择13。免疫肿瘤学领域的进展需要更深入地了解炎症性肿瘤微环境，这不仅有助于理解致癌过程中所涉及免疫机制的生物学特性，也有助于发现可用于新型免疫治疗的预测性生物标志物1,2。由于癌症免疫学具有复杂的生物学特性，通常需要对肿瘤组织样本进行分析，以不断扩展免疫标志物的检测清单。这些标志物在组织中不同细胞群体之间相互作用，并经常共表达1,2,5。临床试验通常采用小体积活检样本，例如穿刺活检或内镜活检，在治疗过程的不同时间点采集，以评估和监测患者的治疗反应。此类活检所提供的组织量有限，从而限制了可用于癌症免疫谱型分析的组织切片数量。当使用传统技术（如标准单重免疫组化）时，这一限制尤为严峻。因此，迫切需要开发新的癌症免疫谱型分析方法，采用多...

对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织样本进行免疫谱型分析已成为肿瘤免疫学研究中的关键组成部分，尤其在临床试验背景下，用于发现和验证癌症免疫治疗的新型预测性生物标志物1,2。使用化学显色剂（如二氨基联苯胺）的显色免疫组化（IHC）仍是病理诊断中对活检组织进行免疫标记的标准技术3。标准IHC也可用于癌症组织的免疫谱型分析，包括定量分析肿瘤相关淋巴细胞亚群以及评估免疫检查点分子（如程序性细胞死亡配体1（PD-L1））的表达水平4,5。然而，标准IHC存在局限性，即每张组织切片只能标记一种抗原。由于免疫谱型研究通常需要分析多个标志物的联合表达情况，若使用标准IHC，则需对多张组织切片分别染色，每张切片仅染一种标志物，因此在分析核心针活检等小组织样本时会受到显著限制。此外，标准IHC方法在评估由不同细胞群体共表达的标志物时也存在局限，例如PD-L1等免疫检查点标志物常在肿瘤相关巨噬细胞和癌细胞中均有表达。这一局限性已在病理学家使用标准单重IHC对多种细胞类型表达的IHC标志物进行定量分析时被报道6。开发在同一组织切片上使用多种颜色显色剂的多重显色免疫组化技术，是对传统单重IHC方法的重要改进7，但其仍受限于仅能标记少数几个标志物，并且在准确评估同一细胞群体中相同亚细胞区域表达的标志物时面临重要的技术挑战。
上述关于临床样本中组织可获得性的注意事项，以及多重显色免疫组化（IHC）技术的局限性，促使人们需要开发更先进的多重检测方法，以用于基于荧光标记并结合成像系统的肿瘤免疫学研究，该系统能够有效分离同一张切片上多种荧光染料的信号。其中一种技术基于酪胺信号放大法（tyramide signal amplification, TSA），结合多光谱显微成像，实现高效的颜色分离8。一种市售的基于TSA的试剂盒采用了专为多光谱成像优化的荧光染料8（见材料表）。该系统的一个关键优势在于，其可兼容那些已用于常规显色IHC并经过验证和优化的未标记一抗9,10,11。这不仅加快了优化过程，还为引入新靶点的方案优化和抗体组合调整提供了灵活性。此外，多重免疫荧光（mIF）TSA方法可适配市售的自动化IHC染色系统，从而实现从单重显色IHC向mIF的顺利过渡。
本文介绍了一种基于自动化多重免疫荧光TSA染色并结合多光谱扫描仪成像的免疫肿瘤学研究用多重免疫荧光（mIF）检测方案。任何具备文中所述仪器设备和试剂的实验室用户均可对该方案进行适配与修改。该方案包含六种针对癌瘤免疫谱型分析的一抗组合：PD-L1、PD-1、CD68（泛巨噬细胞标记物）、CD8（细胞毒性T细胞）、Ki-67以及AE1/AE3（泛细胞角蛋白，作为上皮标记物用于识别癌瘤细胞）。近期一项研究报道了通过以显色免疫组化（IHC）作为标准参照，对人工操作的TSA多重免疫荧光方案进行优化的过程12. 本文介绍的改进方法采用了一种市售的七色TSA试剂盒，并在自动化染色仪中进行了优化，将染色时间从3–5天显著缩短至14小时，同时提高了染色结果的一致性。除本文提供的详细主实验方案外，还包含 补充材料 部分包括 &#34;液滴控制&#34; 方法，一种用于评估新mIF panel的附加质量控制流程，以及针对优化、故障排除和开发新多重panel的技术说明，以帮助实验室用户建立并优化定制mIF panel的mIF TSA方法。

<table><tbody><tr><td>&quot;InForm 2.4.2&quot; 光谱解混与图像分析软件</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151066</td><td>文中称为 &quot;光谱解混软件&quot;</td></tr><tr><td>&quot;Phenochart 1.0.9&quot; 用于多光谱成像区域选择与整张切片扫描浏览的 QPTIFF 软件</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151067</td><td>文中称为 &quot;QPTIFF 软件&quot;</td></tr><tr><td>#1.5 盖玻片</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2975246</td><td></td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>20x Tris-缓冲盐溶液</td><td>VWR</td><td>J640-4L</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>DAKO</td><td>S2203</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD68 小鼠单克隆抗体</td><td>DAKO</td><td>M087601-2</td><td>克隆号 PG-M1</td></tr><tr><td>抗 CD8 兔单克隆抗体</td><td>Ventana</td><td>M5392</td><td>克隆号 SP239</td></tr><tr><td>抗 CK 小鼠单克隆抗体</td><td>DAKO</td><td>M351501-2</td><td>克隆号 AE1/AE3</td></tr><tr><td>抗 ki67 小鼠单克隆抗体</td><td>DAKO</td><td>M724001-2</td><td>克隆号 MIB-1</td></tr><tr><td>抗 PD-1 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#86163</td><td>克隆号 D4W2J</td></tr><tr><td>抗 PD-L1 兔单克隆抗体</td><td>Ventana</td><td>790-4905</td><td>克隆号 SP263</td></tr><tr><td>Bond 脱蜡液</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td>文中称为 &quot;脱蜡液&quot;</td></tr><tr><td>Bond 抗原修复液 1</td><td>Leica</td><td>AR9961</td><td>文中称为 &quot;ER1&quot;</td></tr><tr><td>Bond 抗原修复液 2</td><td>Leica</td><td>AR9640</td><td>文中称为 &quot;ER2&quot;</td></tr><tr><td>Bond 开放式容器，30 mL</td><td>Leica</td><td>OP309700</td><td>文中称为 &quot;30 mL 开放式容器&quot;</td></tr><tr><td>Bond 开放式容器，7 mL</td><td>Leica</td><td>OP79193</td><td>文中称为 &quot;7 mL 开放式容器&quot;</td></tr><tr><td>Bond Polymer Refine 检测试剂盒</td><td>Leica</td><td>DS9800</td><td>文中称为 &quot;显色检测试剂盒&quot;</td></tr><tr><td>Bond 研究用检测试剂盒</td><td>Leica</td><td>DS9455</td><td>文中称为 &quot;研究检测试剂盒&quot;</td></tr><tr><td>Bond 滴定试剂盒</td><td>Leica</td><td>OPT9049</td><td>文中称为 &quot;滴定试剂盒&quot;</td></tr><tr><td>Bond Universal Covertile Novocastra</td><td>Leica</td><td>S21.2001</td><td>文中称为 &quot;盖片&quot;</td></tr><tr><td>Bond 洗涤液 10X 浓缩液</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td>文中称为 &quot;10x 洗涤液&quot;</td></tr><tr><td>BondRX 自动染色机</td><td>Leica</td><td></td><td>文中称为 &quot;自动染色仪&quot;</td></tr><tr><td>BondRX 软件版本 5.2.1.204</td><td>Leica</td><td></td><td>文中称为 &quot;自动染色仪软件&quot;</td></tr><tr><td>Opal 7 色自动化 IHC 试剂盒</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL801001KT</td><td>文中称为 &quot;多光谱染色试剂盒&quot;</td></tr><tr><td>过氧化物酶阻断剂</td><td>Leica</td><td>RE7101</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo</td><td>P36965</td><td>文中称为 &quot;载玻片封片剂&quot;</td></tr><tr><td>Starfrost 载玻片</td><td>Fisher</td><td>15-183-51</td><td></td></tr><tr><td>Vectra Polaris 多光谱显微镜，配备 &quot;Vectra 3.0.5&quot; 显微镜控制软件</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS143455</td><td>文中称为 &quot;显微镜控制软件&quot;</td></tr></tbody></table>

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

免疫肿瘤学的持续发展需要更深入地理解癌症免疫学的机制。对来自福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）活检组织样本的免疫谱型分析，已成为理解肿瘤免疫学复杂性以及发现癌症免疫治疗新型预测性生物标志物的关键工具。组织的免疫谱型分析需要在肿瘤微环境中联合评估多种标志物，包括炎性细胞亚群和免疫检查点。新型多重免疫组织化学方法的出现，使得对单个组织切片进行多参数分析的效率显著高于传统的单重免疫组织化学（IHC）。一种 commercially available 的多重免疫荧光（IF）方法基于酪胺信号放大技术，结合多光谱显微分析，可在组织中实现不同标志物信号的更好分离。该方法可兼容已针对FFPE组织样本上的标准IHC优化过的非偶联一抗。本文详细描述了一种自动化方案，可实现对癌组织样本进行六重标志物多重免疫荧光标记，所用抗体组合包括PD-L1、PD-1、CD68、CD8、Ki-67以及AE1/AE3细胞角蛋白，并以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）作为细胞核复染剂。该多重抗体组合方案在自动化IHC染色仪中进行了优化，染色时间短于手动操作流程，可由任何实验室研究人员直接应用并根据需要调整，用于人类FFPE组织样本的免疫肿瘤学研究。本文还介绍了几种对照和工具，包括一种用于新多重免疫荧光抗体组合精细质量控制的滴加对照方法，有助于该技术的优化与验证。

本方案将产生如图所示的结果 图2从扁桃体对照的染色评估开始，首先观察表面鳞状上皮细胞。可与病理学家共同回顾扁桃体样本的组织学特征，并结合H&amp;E滑片作为参考。如果在同一组织块上使用相同标记物进行显色免疫组化切片，则可用这些切片来确认mIF滑片上各标记物的密度和分布情况。如图所示 图2A，扁桃体组织应在扁桃体表面鳞状上皮中显示出清晰可辨的AE1/AE3细胞角蛋白染色（图2A；标记为红色伪彩色），淋巴组织中无背景染色。染色应位于细胞质，偶见膜强化，细胞核必须为阴性。隐窝中的网状上皮应同时对细胞角蛋白（红色）和PD-L1呈阳性图2A；绿色伪彩）。随后应识别扁桃体的滤泡生发中心。生发中心应易于辨认，并富含Ki-67阳性淋巴细胞（<stro...

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。

肿瘤免疫学领域的持续发展需要对癌症免疫学机制有更深入的理解。癌症免疫谱型分析的……

该方案具有重要意义，因为多重免疫荧光方案的开发、优化与转移过程复杂且具有挑战性。对于许多实验室而言，获得一个经过优化的实验方案是极为宝贵的。多光谱免疫荧光技术使我们能够评估肿瘤内部及周围多种细胞类型的定位及其身份特征。这是肿瘤免疫学研究中一种强大的信息组合。多重免疫荧光最具说服力的应用领域就是肿瘤免疫学。但在原位同时检测多种免疫细胞类型的能力，也可广泛应用于所有自身免疫性和炎症性疾病的治疗研究中。了解免疫细胞在实体细胞内部及其周围的位置和表型，对于预测肿瘤特异性免疫治疗的预后和治疗反应具有重要意义。方案的优化与验证是关键步骤，不应仓促进行。新使用者应熟悉与多光谱成像相关的新型人工假象。为了找到基础的多重染色方案，请先将其加载到自动染色仪上。在方案界面中，将筛选条件设置为显示“全部”而非“首选”。在进行修改前，先保存原始方案，然后点击“方案”标签页，右键单击 Opal 6 Multiplex 并选择“复制”。在新窗口中将名称更改为“7 多重检测方案 1”，并选择与正确设备关联的选项卡。参照补充表 S1 中的方案，点击“添加试剂”以加入一个持续十分钟的过氧化物酶抑制步骤，并选择过氧化物酶抑制剂作为试剂。确认封闭步骤使用的是蛋白激酶抑制剂封闭缓冲液，每一步一抗对应正确的试剂，二抗步骤使用辣根过氧化物酶聚合物，且使用多光谱自动化试剂盒中提供的光谱DAPI。确保该实验方案包含过氧化物酶抑制剂，随后进行六轮连续染色，每轮依次包含蛋白封闭步骤、一抗、二抗、酪胺信号放大（Tyramide）染色，然后进行抗原修复以去除抗体。为添加滴加对照，复制“7重多重染色方案1”的名称，并将其更改为“7重多重染色方案1 CD68滴加对照”。将CD68抗体试剂更改为小鼠IgG，然后保存该方案。然后，再创建六个新的实验方案，分别为每个滴定对照以及完整的同型对照，创建方法与上述相同。针对每个靶标，均按照此处演示的方法建立滴定对照方案。为准备多重检测研究试剂盒，请将标记为1X Tris缓冲盐水的30毫升敞口容器中装入1X Tris缓冲盐水，并将该容器放置于多重研究试剂盒1中距离手柄最远的位置。取两个30毫升的敞口容器，分别标记为“多光谱封闭液”和“多光谱二抗”，从多光谱染色试剂盒中取30毫升封闭缓冲液抗体稀释液加入多光谱封闭液容器中。从多光谱染色试剂盒中取30毫升抗小鼠抗兔二抗聚合物加入多光谱二抗容器中，并向十个7毫升的敞口容器中各加入600微升抗体稀释液。接着，根据表格中指示的体积，将浓缩的一抗加入相应的试管中，并通过轻柔吹打混匀。向一个7毫升的敞口容器中加入3毫升双蒸水和12滴光谱级DAPI，向另一个7毫升的敞口容器中加入3毫升过氧化物酶阻断液。用75微升二甲基亚砜重悬每种冻干粉，并通过移液混匀。然后，将酪胺信号放大（Tyramide signal amplification）储备液储存于4摄氏度，待用时取出。在制备单个TSA平板梯度稀释液的同时，将所有试剂登记在自动染色仪上，然后将每个容器放入试剂架中，并将所有试剂装载到自动染色仪上。染色仪将检测每种试剂的存在并确认其体积。所有试剂加载完毕后，启动程序并过夜运行。染色程序结束后，用盖玻片封片，并将样本载入多光谱成像平台扫描仪进行扫描。所有样本扫描完成后，图像将被格式化为 qptiff 文件。打开合适的 qptiff 分析软件程序，点击“加载切片”以打开目标切片的五通道全切片扫描图像。登录后，使用图章工具选择五个区域进行多光谱成像。在“选择用于：”中选择“采集”，在“视野大小：”中选择“1x1”，在“视野分辨率”中选择“0.5 微米 20x”。根据细胞角蛋白染色结果，从整体扫描图像中选择多个同时包含细胞角蛋白阳性肿瘤组织和细胞角蛋白阴性间质组织的区域进行成像。当所有多光谱图像均选定后，切换至Vectra软件，将每张切片的任务由“扫描”更改为“多光谱成像”。然后，点击扫描以执行多光谱图像采集。当完成多光谱图像采集后，使用光谱分离软件打开多光谱图像文件夹中的文件。在图像格式中选择“多光谱”，在样本格式中选择“荧光”，在光谱库来源中选择“inForm”。为选择图层，请从样本库切片中选择并加载全部六个图层以及DAPI，然后点击“准备全部”。光谱分离软件将利用提供的光谱特征对所有已打开的图像执行光谱分离。识别并标注自体荧光的光谱特征。务必检查自体荧光特性，确保在光谱分离后，自体荧光信号被完全保留在自体荧光通道中，并通过测试不同的采样参数直至其被可接受地去除。随后，在同一组织的连续切片中，由病理学家将染色模式与相同靶标的显色单染结果进行比对评估。为了评估每个通道的荧光强度，使用计数工具对打开的图像进行检测。然后返回染色方案，调整TSA浓度，以校正超出或未达到可接受范围的标准化计数。在此代表性分析中，扁桃体组织显示出清晰界定的细胞角蛋白染色，位于扁桃体表面和鳞状上皮内，淋巴组织中无背景信号，同时在隐窝的网状上皮中可见细胞角蛋白和PDL-1染色。滤泡生发中心易于辨认，且富含Ki-67阳性淋巴细胞。生发中心内的巨噬细胞通过其CD-68表达得以识别，部分巨噬细胞亦可见于生发中心外。CD-8染色的淋巴细胞呈T细胞分布，而PD-1表达则强烈标记了聚集在生发中心周边以及散在分布于滤泡间区域的小淋巴细胞。在确认扁桃体组织对照中出现预期的染色模式后，即可在肺癌样本中评估相同的染色结果。同时应评估同型阴性对照和加样对照；这不仅有助于检测背景信号和自发荧光，还可识别伞状效应和光谱溢出。在优化新的多重免疫荧光检测面板时，加样对照对于评估多重免疫荧光方法可能引起的染色假象具有重要意义。每个去抗体对照应显示与完整多重检测面板相同的染色模式，仅缺少各自对应的单一一抗。通过多光谱免疫荧光进行免疫谱型分析，能够依据免疫学标准对肿瘤及其区域进行分层，进而可在同一组织切片中开展大规模多重基因组、转录组和蛋白质组研究。我已应用多重免疫荧光技术研究肿瘤学及自身免疫性疾病的作用机制，该技术可在单一切片中实现对免疫细胞和致病细胞的鉴定与表征。在使用针对人类蛋白质的抗体、Tyramide 和 DAPI 时应采取常规预防措施，但本方案中所使用的任何试剂或材料均未被认定具有特别危害性。

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Cancer Research

癌症研究

福尔马林固定癌组织标本免疫肿瘤学自动复合免疫荧光小组研究

研究肿瘤微环境可能发现用于预测免疫治疗临床反应的预后或预测性生物标志物。本文介绍了一种基于 原位 荧光多光谱成像用于自动分析和计数CD8的不同亚群+...

多重免疫荧光分析与肿瘤内 PD-1+ Tim-3+ CD8+ T 细胞的定量

本文介绍了一种用于淋巴瘤组织中多种癌症相关抗原同时定位的多重荧光免疫组织化学染色与成像方案。该方案可推广应用于所有组织切片中生物标志物的共定位分析。...

淋巴瘤组织样本中多重荧光免疫组织化学染色、成像与分析

多重荧光免疫组织化学是一种新兴技术，可在完整的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中实现多种细胞类型的可视化。本文提供了成功进行七色多重染色的指导原则，包括抗体和试剂优化、切片制备、实验设计以及避免常见问题的建议。...

优化、设计及规避手动多重荧光免疫组织化学中的陷阱

本文介绍了一种手动酪胺信号放大（TSA）多重免疫荧光（mIF）染色结合图像分析与空间分析的实验方案。该方案可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，每张切片可检测两至六种抗原，具体数量取决于实验室所配备的切片扫描仪。...

多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

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肿瘤微环境中空间免疫细胞格局的多重免疫组织化学分析

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多重免疫组织化学染色法用于石蜡包埋的肺癌组织

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多重循环荧光免疫组织化学

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用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

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基于DNA条形码的多重免疫荧光成像分析基因重编程小鼠黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本

多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。...

多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

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用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

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