逆向解剖与DiceCT揭示灵长类面部演化中难以察觉的数据

该方法有助于解答进化生物学中的关键问题，例如社会性交流行为的演化。该技术的主要优势在于能够为拟态肌的形态和存在提供直接证据。它消除了在解剖过程中的推测成分，并能有效保存肌肉层次结构。

结合DiceCT技术，逆向解剖已成为模拟肌肉研究的新金标准。首先，按照随附的文字方案进行标本固定与制备，随后将标本转移至通风橱中。

然后，用流动水冲洗标本数小时。冲洗完毕后，用纸巾轻轻吸干标本表面水分，并将其转移至工作台。在脑组织及覆盖的颅骨移除后，于颅骨眉部区域附近做一处切口，另一处切口位于颅骨尾侧、颅骨结构完整的部位。

触诊颅骨尾侧边缘的枕外隆凸，该部位标志着颅骨与脊柱的连接区域。然后使用手术刀，从枕外隆凸处开始，沿中线做一纵向切口。

在颅骨的顶骨和额骨区域，从喙侧开始进行切割。继续向眶部两眼之间延伸，沿鼻部区域直至两侧鼻孔之间的外鼻区域。接着，在下颌中切牙之间进行切割，并将手术刀向尾侧沿下颌骨方向移动至锁骨。

此时，选择面具的一侧，将其从颅骨上松解，另一侧保持原位。从枕部区域开始，使用手术刀将面部面具（包括表情肌）从颅骨的枕骨部分切割分离，同时将面具向吻侧和外侧牵拉。将枕肌从颅骨上切下，但在颅骨上保留少量肌肉组织，以便在面部面具移除后仍能观察到其附着点。

通过在骨性和软骨性颅骨上保留部分肌肉，可以在后续时间保存并记录其附着点。一旦暴露外耳，即寻找耳部肌肉。切断这些肌肉，使每块肌肉均残留一小部分附着于颅骨上。

然后，切开连接外耳与颅骨的弹性软骨。继续将面部肌肉向前方牵拉，并将每块表情肌从颅骨上剥离，但在颅骨上保留每块肌肉的一小部分。当一侧颅骨上的面部肌肉完整剥离后，将其置于空气中，使肌肉组织暴露1至3小时，具体时间根据标本大小而定。

这将使面罩上的结缔组织脱水，并增强肌肉与结缔组织之间的颜色对比。在肌肉与结缔组织之间的对比度得到增强后，使用3号手术刀、镊子和显微剪刀去除足够的结缔组织，以清晰显示肌肉结构。在此逆向解剖中的表层表情肌层，轻柔地抬起并分离深层肌肉与表层肌肉，并清除围绕表层肌肉的结缔组织。

完成后，将制备好的面部模具放回福尔马林中。在进入进一步解剖或继续染色之前，可在此暂停操作。在每个中间步骤中，应给予面部模具足够的干燥时间，以便能够清晰区分结缔组织与肌肉组织。

为了通过CT扫描观察仿生肌肉组织，需使用碘溶液对模型进行染色，具体方法是将模型浸入卢戈氏染色液中，操作步骤详见配套的文字版实验方案。染色过程通常在1.75%卢戈氏溶液中进行，约需两周时间。然而，染色时长会因多种因素而有所变化。

建议采用间歇性扫描并配合染色调整。进行CT扫描时，首先准备面部模型：使用木质牙签将面罩固定在低密度材料（如插花泡沫）上。这可以消除面罩上的褶皱，并在其扫描过程中轻微干燥时限制其移动。

接下来，将样本放入低密度容器中，并固定到位。固定后，将样本放入扫描仪中，关闭舱门，然后开启X射线。随后，设置CT扫描参数，以进行高分辨率X射线计算机断层扫描。

扫描时采用约 0.05 毫米的层间间距和像素间距离，因为较低分辨率会遮蔽较小的肌束。若因染色过深导致肌束无法完全可视化，可将面模置于脱色液（如 10% 甲醛或 5% 硫代硫酸钠）中，以去除部分染色。调整染色后，重新扫描面模，并持续进行必要调整，直至所有肌束均能完全可视化。

通过采用逆向解剖法制作面部标本，有时能够比传统解剖方法更完整地呈现表情肌的形态。该方法适用于多种体型的动物，从小型的狨猴到大型灵长类动物如黑猩猩均可应用。在面部肌肉纤细的小型灵长类动物中，部分表情肌可能与周围的结缔组织难以区分，因此在解剖过程中容易丢失。

碘染色剂（如卢戈氏碘液）可提高对比度，有助于分辨出单个的拟态肌以及单个的肌束，并首次获得这些纤细肌肉的完整肌肉体积。如图所示，在DiceCT扫描中，与外耳相关联的一些非常微小的肌肉清晰可见。在某些逆向解剖操作中，由于这些肌肉体积微小，遗漏它们的情况并不少见。

这种三维体积渲染可实现基本的体积阈值设定和颜色映射，相比仅通过横截面观察，能更直观地显示肌肉结构。在此您可以看到，单个肌束在横截面上清晰可见，使得数字化解剖成为可能。在进行该操作时，必须牢记：由于该方法具有破坏性，操作过程中应缓慢、谨慎且有目的地进行。

完成此操作后，可采用其他方法（如组织学处理）来回答更多问题，例如纤维直径或肌球蛋白纤维分型。该技术问世后，为进化生物学领域的研究人员探索非人类哺乳动物及人类面部表情和视觉交流的进化奠定了基础。请注意，使用甲醛和带刃的手术刀具有极高的危险性。

进行此操作时，应采取一些预防措施，例如冲洗样本，并始终清楚解剖刀的位置。