Name: 体外3D 球形培养模型小鼠前列腺叶的鉴定、组织学特征及解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习从小鼠泌尿生殖系统中解剖前列腺叶并进行组织学区分，分离原代前列腺细胞，建立三维球形培养模型。该方法支持前列腺癌机制的全面体内外研究。

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本工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 R01CA161018（LK 负责）的支持。

本文所述所有小鼠实验均按照纽约州立大学上州医科大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案指南进行。
1. 泌尿生殖系统（UGS）解剖
注意：示意图见图1。
<ol>
	<li>使用 CO2 吸入法或其他经批准的技术处死一只 3 个月大的雄性 C57BL/6 小鼠。 
	注意：3 至 12 个月龄的小鼠均可成功用于本实验。年龄较大的小鼠（&#62; 6 个月）在尿道生殖窦（UGS）周围可能含有较多脂肪，需予以清除。小于 3 个月的小鼠通常难以辨认和分离各叶。其他品系的小鼠也可用于本实验。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，并用图钉固定四肢，使其腹侧完全暴露。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠腹部，并擦拭干净。 
	注意：解剖前无需剃除腹部毛发。</li>
	<li>用中号钝头镊子提起腹部皮肤及肌肉层，用剪刀在腹部做倒 Y 形切口。
	<ol>
		<li>首先，用一把锋利的剪刀从阴茎稍上方开始，沿直线剪至胸骨（图 2a）。</li>
		<li>从切口基部向两侧下肢方向剪至大腿（图 2b）。将皮肤向两侧及底部翻折，以充分暴露整个腹部区域（图&#160;2c-e）。 
		注意：切口大小取决于小鼠的年龄和体型。初始直线切口的长度可能在 1.5 至 4 cm 之间，视小鼠大小而定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移开其他器官以暴露尿道生殖窦（UGS）。用镊子提起棕黄色的肠道（图 2f）。夹起腹部脂肪垫（呈不透明白色海绵状组织）并移向两侧（图 2g）。 
	注意：UGS 包括精囊、尿道、前列腺、输精管和膀胱。可通过其特征性的成对不透明白色半圆形弓状结构（即精囊）加以识别，其基部连接着充满液体的膀胱囊。位于精囊正下方的透明组织即为前列腺。</li>
	<li>找到 UGS 后，用钝头镊子牢固夹住膀胱，并将整个 UGS 自小鼠腹腔向上提起。 
	注意：若膀胱充盈，应先用小号注射器排空，以便镊子更好夹持，并降低膀胱破裂风险。</li>
	<li>持续向上牵拉膀胱，将剪刀从膀胱和前列腺下方一直插入至脊柱处，进行剪切。剪断所有与腹腔残余的连接组织（图&#160;2h 和 2i）。注意不要过于靠近 UGS，以免意外剪破前列腺组织。 
	注意：在 UGS 下方剪切时，应将剪刀完全插入小鼠背部，使剪切动作同时切断椎骨。该方法可在一次剪切中几乎完全切断 UGS 与腹腔的所有连接，从而缩短组织取出时间。</li>
	<li>取出 UGS 并将其置于盛有 2–6 mL（足以覆盖组织）磷酸盐缓冲液（PBS）或高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）的 6 cm 培养皿中（图&#160;2j 和 2k），然后转移至解剖显微镜（10X 放大倍数）下操作。 
	注意：根据后续步骤需要，适时更换解剖用培养液。</li>
</ol>
2. 前列腺的解剖
<ol>
	<li>使用精细镊子和显微解剖剪，清除背侧和腹侧的所有脂肪组织（图3a）。后续解剖步骤中也使用类似的手术器械。 
	注意：脂肪组织常与尿道生殖窦（UGS）紧密缠绕（可通过其白色海绵状外观识别），因此此步骤必须小心操作，避免意外剪除任何前列腺组织。完全清除脂肪可能需要10-15分钟。</li>
	<li>用镊子夹住并拉起膀胱，用剪刀在基部将其剪断（图3b）。</li>
	<li>将剩余组织腹侧朝上放置。用镊子夹住一侧输精管，沿其走向用剪刀追踪至基部并剪断（图3c），然后在另一侧重复该操作。去除输精管后，此时留下前列腺（半透明、蠕虫状）、精囊（不透明、白色、半圆形）和尿道（粉红色至红色、不透明管状结构）（图&#160;3d 和 3e）。</li>
	<li>将镊子插入精囊内侧弓部与前列腺前叶组织之间，轻轻撑开精囊与前列腺，并根据需要剪断任何连接的结缔组织（图3f）。沿精囊追踪至其在尿道的基部，将其完整移除（图&#160;3g 和 3h）。操作时注意避免穿破精囊。</li>
	<li>继续分离各个前列腺叶。</li>
</ol>
3. 前列腺的大体解剖及单个叶的显微解剖（图 3i-n，图 4）
<ol>
	<li>用一对钝头镊子将组织翻转，使背侧朝上，露出背侧叶，其形态类似于蝴蝶的翅膀。</li>
	<li>用镊子夹住背侧叶，用剪刀在基部剪下以采集背侧叶（图3j）。</li>
	<li>将剩余的组织翻转至腹侧。</li>
	<li>采集侧叶，侧叶较小，通常包裹在尿道侧面，位于前叶、腹侧叶和背侧叶之间（图3k）。</li>
	<li>接着采集腹侧叶，其体积大于侧叶，位于尿道腹侧（图3l）。</li>
	<li>最后，通过切割并弃去尿道，收获四个叶中最大的前叶（图3m）。</li>
	<li>根据实验需求处理所采集的组织样本。如需进行组织学分析，请进入第4节；如需进行类球体培养，请进入第5节。</li>
</ol>
4. 通过苏木精和伊红染色切片进行肺叶识别与形态学观察
<ol>
	<li>固定前列腺组织并将其包埋在石蜡中。按照Oliveira et al.12 所述的组织学特征，对切片进行苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色，以观察和区分前列腺各叶之间的差异（图5）。</li>
</ol>
5. 用于三维培养的组织处理10
注意：如图6所示。
<ol>
	<li>根据实验需求，继续培养整个前列腺或单个叶组织。将前列腺组织转移至一个含有 2–3 mL DMEM 的 10 cm 培养皿中。在解剖显微镜下，使用手术刀尽可能细致且均匀地切碎前列腺小管。</li>
	<li>在组织培养超净台内、无菌条件下继续后续步骤。</li>
	<li>将组织碎片连同 DMEM 一起转移至一个 15 mL 离心管中，并用 DMEM 将体积补至 9 mL。向 DMEM-组织混合液中加入 1 mL 10 倍浓度的胶原酶储备液，涡旋混匀。 
	注意：胶原酶储备液为 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 培养基中含 10 mg/mL 胶原酶，最终在 15 mL 管中的浓度为 1 mg/mL。</li>
	<li>将离心管置于旋转摇床或管式旋转器上，在 37 °C 条件下孵育 2 小时，使胶原酶降解细胞外基质。</li>
	<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 2 mL 预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，以裂解细胞间及细胞-基质黏附。将离心管转移至 37 °C 孵育 5 分钟。 
	注意：若组织块过大导致混匀困难，可用刀片切去移液器吸头尖端，以增大孔径。</li>
	<li>使用 P1000 移液器吹打 8–10 次以分散组织团块，随后再用 P200 移液器重复吹打。</li>
	<li>加入 3 mL 完全 DMEM 培养基以中和胰蛋白酶活性。加入 500 U DNAase I，并充分混匀。</li>
	<li>使用 18 G 针头连接 5 mL 注射器吹打 5–10 次，随后再用 20 G 针头重复吹打 5 次。</li>
	<li>若溶液中仍存在较大组织块，重复步骤 4–8 一次。</li>
	<li>将细胞悬液通过置于 50 mL 管上的 40 μm 滤膜过滤。用 5 mL DMEM 冲洗原 15 mL 管，并将冲洗液通过同一滤膜，重复冲洗一次。</li>
	<li>弃去滤膜，将含有滤过液的 50 mL 管在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
</ol>
6. 细胞接种与培养
<ol>
	<li>用0.5 mL完全前列腺上皮细胞生长培养基（PrEGM）重悬沉淀。使用细胞计数器或血细胞计数板测定细胞密度，并用完全PrEGM将细胞稀释至5 × 105 个细胞/mL。 
	注意：一只3月龄小鼠全前列腺的细胞产量通常在3 × 105–106 个细胞之间。因此，初始重悬沉淀时所用PrEGM体积不应超过0.5 mL（如上所述），以确保即使产量较低，也能达到所需的细胞密度。</li>
	<li>按2:3的体积比（60%基底膜ECM和40%细胞悬液）将所需体积的细胞与基底膜ECM混合，并根据实验需求接种至多孔板或腔室载玻片中。 
	注意：若用于免疫染色，应将混合物接种于玻璃底培养板或腔室载玻片上，覆盖整个孔或孔的中央区域。若需计数生成的类器官，则沿孔边缘接种；若接种体积较大，可将混合物以多个液滴形式均匀分布于孔内。注意避免铺得过厚或过薄。每1 cm2 接种面积至少接种100 µL基质-细胞混合物；例如，在孔底表面积为2 cm2 的腔室载玻片中，应接种含5 × 104 个细胞的200 µL基质-细胞混合物。</li>
	<li>将培养板或载玻片转移至37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育30分钟，使基底膜ECM凝固。随后，加入预热的完全PrEGM培养基覆盖整个孔，注意避免扰动基底膜ECM凝胶块。</li>
	<li>每隔2–3天更换一半培养基，并补充新鲜培养基。球状体培养5–10天。</li>
	<li>进行后续操作，包括收获（步骤7）、免疫染色（步骤8）和/或成像，用于下游应用。</li>
</ol>
7. 收集类球体
<ol>
	<li>收集球体时，小心吸除培养基，避免扰动基底膜ECM凝胶块，每100 µL基底膜ECM中加入1 mL浓度为1 mg/mL的dispase溶液（溶于PrEGM中）。 
	注意：若将球体接种在孔板中央或边缘（而非覆盖整个孔底），则更易于收集，以确保可向孔中加入足量的dispase溶液。</li>
	<li>使用细胞刮刀轻轻刮取培养板底部，使基底膜ECM凝胶脱离并进入dispase-PrEGM溶液中。</li>
	<li>用宽口的1000 µL移液枪头或5 mL移液器将整个溶液上下吹打一次，使凝胶块破碎成较小片段。 
	注意：可用剃刀片切去1000 µL移液枪头的尖端，以制成宽口枪头。</li>
	<li>将样品置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育1–2小时，直至基底膜ECM完全溶解。 
	注意：可通过倾斜孔板并肉眼观察孔底，确认无残留凝胶块，以判断消化是否完全。</li>
	<li>将细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>在室温下以250 × g离心5分钟，随后进行后续实验操作。</li>
</ol>
8. 类球体的免疫染色13
注意：类球体培养至所需时间后，可溶解基底膜细胞外基质，并按照 Colicino et al.13 中所述方法对类球体进行染色。
<ol>
	<li>简而言之，用 PBS 清洗培养物，然后直接向基底膜 ECM 凝胶块中加入 4% 多聚甲醛（PFA）。在室温下缓慢振荡孵育 30–90 分钟，直至基底膜 ECM 完全溶解，每 30 分钟更换一次新鲜的 PFA。 
	注意：在此过程中，PFA 会溶解凝胶块并同时固定类球体。</li>
	<li>随后用 PBS 洗涤 3 次，加入 50 mM 氯化铵孵育 10 分钟，以淬灭 PFA 可能产生的自发荧光。再用 PBS 重复洗涤 3 次。</li>
	<li>使用 0.1% 非离子型去垢剂透化处理 5 分钟，并用 PBSAT（PBS、1% BSA、0.5% Triton X-100）封闭 30 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，用 PBSAT 稀释的一抗溶液孵育过夜，随后用 PBSAT 洗涤 3 次，再加入 PBSAT 稀释的二抗溶液，在室温下孵育 2 小时。</li>
	<li>再次用 PBSAT 洗涤，并根据需要按照试剂生产商的说明书使用 DAPI 染色。最后用 PBS 洗涤 3 次或更多次。</li>
	<li>加入含 200 mM 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）抗荧光淬灭试剂的 PBS，随后进行成像。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本文概述了小鼠前列腺的解剖方法及各个叶的鉴定。同时还描述了将小鼠前列腺细胞进行三维培养的实验方案。 体外 分析。
解剖方案中的关键步骤包括：（1）从 小鼠体内完整取出整个泌尿生殖窦（UGS），并在解剖显微镜下分离各个器官。前列腺组织非常微小，且被包围在泌尿生殖窦的其他组织之中；因此，在保持四对叶完整无损的前提下，直接从体腔中单独获取该器官几乎是不可能的。因此，必须首先完整取出整个泌尿生殖窦，然后再从中分离前列腺。本方案中的另一个关键点是（2）操作需及时进行，同时保持细致谨慎。由于解剖过程中必须尽量减少组织降解，时间控制至关重要。本文所述从小鼠中取出泌尿生殖窦的具体技术相比其他方法更为快速，强烈推荐使用。整个解剖及叶状结构分离过程通常耗时35–40分钟，随着操作熟练程度的提高，可缩短至25分钟。解剖过程中最具挑战性的环节是清除围绕泌尿生殖窦的脂肪组织，该步骤占据了总解剖时间的很大一部分。必须仔细彻底地去除脂肪，以确保其完全不残留在前列腺组织中，但同时需格外小心，避免在清理过程中意外丢失任何前列腺组织。另一个关键步骤是（3）在分离前列腺各叶之前，切勿提前移除尿道。尿道...

几十年来，科学界一直在努力阐明人类癌症发展的复杂机制。尽管潜在关键因子和药物靶点的鉴定始于患者细胞和组织研究，但这些发现的转化应用往往需要借助临床前动物模型。自小鼠人类癌症模型联盟（NCI-MMHCC）成立以来，利用基因工程小鼠模型（GEMMs）模拟人类癌症的研究稳步增加。该联盟旨在为全球科学家描述并统一小鼠癌症模型的特征1,2。在大多数类型癌症的临床前研究中，小鼠模型满足了对发病机制进行研究的需求，有助于理解癌症的发生、发展、治疗反应以及获得性耐药等过程3。
前列腺癌是男性中最常见的癌症，每年影响超过16万名男性4。该疾病的侵袭性形式每年导致数万人死亡。然而，疾病进展的机制仍不清楚，这导致针对晚期和转移性前列腺癌的有效治疗手段严重缺乏，晚期前列腺癌患者的高死亡率即是明证4。因此，迫切需要建立用于研究前列腺癌的临床前模型。然而，由于小鼠与人类前列腺之间存在固有的差异，直到2004年巴港分类系统（Bar Harbor Classification system）提出后，利用基因工程小鼠模型（GEMMs）模拟前列腺癌才逐渐受到重视。该系统明确了小鼠前列腺在基因操作后发生的组织病理学变化、肿瘤性病变的识别及其与人类癌症进展阶段的对应关系5。在研究任何前列腺GEMM模型时，必须考虑小鼠前列腺的一个重要特征：其具有四对明显不同的叶——前叶、侧叶、腹叶和背叶。这些叶在组织病理学和基因表达模式上存在显著差异6。在青春期后的年轻小鼠中，不同叶之间的前列腺素（probasin）蛋白表达模式可能存在差异7，这一点必须加以考虑，因为基于Cre的GEMM模型大多使用一种名为Pb-Cre4的基于probasin的启动子构建7。由此导致的Cre表达在空间和时间上的差异，常常引起各叶之间肿瘤起始和进展时间线以及肿瘤性病变的差异。因此，在研究前列腺GEMM中的肿瘤发育时，必须充分考虑这些差异，可能需要对各个叶分别进行评估，以获得可重复的结果。本文的第一部分将介绍正确分离小鼠前列腺、识别并分离各个叶，以及识别各叶之间组织学差异的适当方法。
尽管对肿瘤生长和组织病理学的分析能够为肿瘤的发生发展提供有价值的见解，但这些方法无法提供有关分子机制的详细信息。为了研究肿瘤发生与进展的机制，通常需要对肿瘤细胞进行分析 体外多年来已提出多种涉及这些细胞培养的方法，包括悬浮培养和三维培养8 以及近期常规的二维培养9然而，尽管大多数这些方法能够实现较高的细胞存活率和增殖率，三维培养所提供的环境最接近生理条件。在基底膜细胞外基质（ECM）中生长的三维或类球体培养中，完全分化的腔面细胞通常存活率极低；而基底细胞和中间细胞（主要是干细胞）则能够增殖并形成称为类球体的细胞簇10这使其适用于癌症研究，因为上皮性癌症被认为起源于干细胞（通常被称为癌症干细胞）。11本实验方案的第二部分描述了一种在三维培养体系中培养小鼠前列腺细胞的方法。所形成的球状结构可用于多种下游分析，包括通过活细胞成像研究类器官的形态与行为、对不同蛋白质进行免疫荧光染色，以及研究其对化疗药物处理的响应。
总体而言，本实验方案的目标是通过描述小鼠前列腺的解剖结构与分离技术，以及组织处理以建立类球体培养的方法，阐明利用小鼠模型开展前列腺癌研究的最佳实践。 体外 分析。

<table><tbody><tr><td>小鼠手术器械（小鼠解剖工具包）</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>解剖培养基（DMEM + 10% FBS）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17018029</td><td>用 RPMI 配制成 10 倍储存液（10 mg/ml），过滤除菌，分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%）</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001&amp;nbsp;ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>注射器和针头</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran&amp;nbsp;无菌细胞筛，40&amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>PrEGM BulletKit&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3166</td><td>加入全部组分，分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II 粉末</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td>用 PrEGM 配制成 10 倍储存液（10 mg/ml），过滤除菌，分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr></tbody></table>

小鼠前列腺叶的鉴定、组织学表征及用于体外三维球体培养模型的分离

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

基因工程小鼠模型（GEMMs）是研究包括前列腺癌（PCa）在内的大多数人类癌症的有效临床前模型。了解小鼠前列腺的解剖结构和组织学特征，对于高效利用和准确表征此类动物模型至关重要。小鼠前列腺具有四对结构明确的叶，每对叶均有其独特的特征。本文展示了用于疾病分析的小鼠前列腺叶的正确分离与鉴定方法。分离后，前列腺细胞可进一步进行培养

关键词：基因工程小鼠模型，前列腺癌，小鼠前列腺解剖，前列腺叶分离，原代细胞培养 体外 以获得机制性理解。由于小鼠前列腺原代细胞在培养过程中 tends to lose their normal characteristics when cultured 体外我们在此介绍一种分离细胞并将其培养为三维球状体的方法，该方法可有效维持细胞的生理特性。这些三维培养物可用于在接近生理条件下分析细胞形态和行为，研究疾病发生与发展过程中关键蛋白和信号通路的表达水平及定位变化，以及观察细胞对药物处理的反应。

小鼠前列腺叶可根据其相对于精囊和尿道的位置进行识别和分离。小鼠前列腺由4对叶组成，分别位于精囊和尿道的背侧和腹侧。 图 4a 和 4b （上图）显示完整前列腺的背侧和腹侧视图，以及精囊和尿道。下图（图 4c 和 4d) 显示为便于识别而标出的不同脑叶。脑叶可从低至3个月大的小鼠中分离。
不同的前列腺叶在组织学上存在显著差异（图5）。所有小鼠前列腺叶均由多个腺体轮廓组成，每个腺体包含由分泌性上皮细胞包围的管腔；然而，各叶在形态、细胞排列方式以及分泌物性质方面各不相同。H&amp;E染色小鼠前列腺的鉴别特征已被Oliveira et al.12进行...

基因工程小鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。本文介绍了一种从小鼠泌尿生殖系统中识别并分离前列腺叶的方案，基于组织学特征对其进行区分，并分离和培养原代前列腺细胞 体外 用于后续分析的球状体。

基因工程小鼠模型（GEMMs）可作为研究大多数人类癌症（包括前列腺癌）的有效临床前模型。

该方法有助于启动前列腺癌的基因工程小鼠模型，并通过体内和体外分析研究前列腺癌的机制。该技术的主要优势在于，它能够对前列腺癌小鼠模型进行完整分析，涵盖从组织解剖到细胞分离与培养的全过程。暴露泌尿生殖系统（UGS）后，用中等钝头镊子牢固夹住膀胱，并将整个系统从小鼠腹腔中提起。将一把剪刀插入膀胱和前列腺下方，一直深入至脊柱，切开脊髓，并剪断与腹腔相连的其余组织，以便完整取出整个尿生殖窦（UGS）。将尿生殖窦转移至一个六厘米的培养皿中，培养皿内含有 2 至 6 毫升磷酸盐缓冲液（PBS），并在解剖显微镜下操作。使用一对精细镊子和显微解剖剪，小心清除组织系统背侧和腹侧的所有脂肪组织，注意不得剪切任何前列腺组织。当所有脂肪组织完全去除后，用镊子夹住膀胱并从其基底部将其切除。将剩余组织腹侧朝上放置，用镊子夹住一侧导管末端，用剪刀沿血管向其基底部游离，并在基底部将其切断。以相同方式切除另一侧的血管，将镊子插入精囊与前列腺之间，必要时剪断相连的结缔组织。然后沿精囊追踪至其在尿道的基部，并在不刺破的情况下将其血管去除。当两侧精囊均被移除后，将组织背侧朝上放置，使呈蝴蝶翅膀状的背侧叶清晰可见。用镊子夹住每个背侧叶，用剪刀在基部剪开组织以收集背侧叶，并将组织翻转至腹侧。采集侧叶，侧叶体积较小，通常位于尿道侧面，以相同方式夹在前叶、腹叶和背叶之间。采集腹叶，腹叶较侧叶更大，位于尿道腹侧。随后剪切并弃去尿道，以收获前叶。为了进行前列腺组织的三维培养，将组织叶转移到含有两到三毫升 DMEM 的 10 厘米培养皿中，使用手术刀尽可能细致且均匀地切碎前列腺导管。将组织碎片转移至无菌的组织培养操作台，并将组织悬液加入一个新的 15 毫升离心管中。用新鲜培养基将管内液体体积补至 9 毫升，然后向组织混合物中加入 1 毫升 TenX 胶原酶储备液。涡旋后，将离心管在37摄氏度下振荡孵育两小时，以降解细胞外基质。孵育结束后，通过离心收集组织，并将沉淀重悬于2毫升温热的含0.5% EDTA的溶液中。在37摄氏度下继续孵育5分钟，以促进细胞间及细胞与基质间黏附的解离，随后使用带有宽口吸头的P1000移液器吹打组织8至10次，以分散任何团块。使用P200枪头重复解离操作。然后加入三毫升完全培养基中和胰蛋白酶。将500单位的DNASE1混入组织悬液中，并将溶液通过装有18号针头的五毫升注射器反复吹打5至10次，再通过20号针头反复吹打5次。当看不到较大的组织块时，将悬液通过40微米滤膜过滤至50毫升锥形管中，并通过离心收集细胞。进行细胞铺板和培养时，将细胞沉淀重悬于0.5毫升完全前列腺上皮细胞生长培养基中，并将细胞浓度调整为每毫升前列腺上皮细胞生长培养基含5 × 10⁵个细胞。按2:3的体积比将细胞与基底膜细胞外基质混合，然后将细胞悬液接种至适当的实验用细胞培养容器中。然后将细胞放入细胞培养箱中孵育30分钟。当细胞外基质凝固后，用预热的完全前列腺上皮细胞生长培养基覆盖培养物，注意不要扰动基底膜细胞外基质凝胶。随后将细胞放回细胞培养箱中培养5至10天，每2至3天更换一半培养基。收集球体时，小心吸出培养基，避免扰动基底膜细胞外基质凝胶塞，每100微升基底膜细胞外基质加入1毫升Disbase溶液。使用细胞刮棒沿培养板底部轻轻刮取，使基底膜细胞外基质凝胶从板底脱离并进入上清液中，然后用移液器将整个溶液吹打一次，使凝胶塞破碎成较小片段。将细胞外基质片段置于细胞培养孵箱中孵育1至2小时，直至基底膜细胞外基质完全溶解。然后将细胞悬液转移至15毫升离心管中，并通过离心收集细胞，以进行后续的下游操作。小鼠前列腺由四对叶组成，位于精囊和尿道的背侧和腹侧。前列腺叶由多个腺体轮廓组成，每个轮廓包含一个腔隙，周围环绕着分泌性上皮细胞。不同叶的形态、细胞排列方式以及分泌物性质各不相同。分离的前列腺细胞在基底膜细胞外基质培养后最早第4天即开始生长形成类器官。在接下来的1至6天内，大多数细胞会生长成实心球体，其中部分球体表现出不完整或完整的管腔结构。这些球状体还在细胞间连接处显示出强烈的β-catenin染色，且与F-actin染色共定位。在进行该操作时，必须严格遵循显微解剖的各个步骤。例如，在前列腺叶仍与尿道相连时分离它们，以便根据各叶相对于尿道的位置确定其具体归属。完成解剖步骤后，分离得到的前列腺叶可用于后续分析，如RMA测序、Western blot或免疫染色。主要的三维培养技术可帮助您进一步深入了解前列腺癌的发生机制，因为您能够通过球状体监测活细胞的形态与行为变化，并在其中识别任何肿瘤性改变。总之，这种前列腺分离和培养方法可结合多种下游应用，利用基因工程小鼠模型为研究前列腺癌的机制提供有价值的信息。

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癌症研究

体外3D 球形培养模型小鼠前列腺叶的鉴定、组织学特征及解剖

由肿瘤衍生的类器官是一种三维细胞培养模型，能够维持肿瘤的病理特征和器官特异性的细胞谱系。在本示例方案中，我们将看到科研人员利用基因工程小鼠模型中的前列腺肿瘤组织生成类器官。...

从肿瘤制备类器官：一种三维体外肿瘤模型

在本视频中，我们演示了使用基质凝胶环培养技术对分离的小鼠前列腺上皮细胞进行培养。该方法可为研究遗传或药物干预下前列腺上皮细胞分化形成三维腺样结构的能力提供补充信息。...

前列腺类器官检测：一种基于基质凝胶环的体外培养技术用于研究前列腺上皮细胞的分化能力

在本视频中，我们介绍了从雄性小鼠模型中分离泌尿生殖系统（UGS）的操作步骤。该泌尿生殖系统可在体外进一步解剖，以分离前列腺组织，并研究其在前列腺癌发生过程中的作用。...

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关键词：前列腺分离，小鼠，泌尿系统，生殖系统，雄性小鼠，器官分离

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关键词：前列腺叶分离，小鼠前列腺，组织采集，解剖技术，前列腺解剖

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小鼠前列腺叶的鉴定、组织学表征及用于体外三维球体培养模型的分离

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