体外3D 球形培养模型小鼠前列腺叶的鉴定、组织学特征及解剖

该方法有助于启动前列腺癌的基因工程小鼠模型，并通过体内和体外分析研究前列腺癌机理。该技术的主要优点是，它允许对前列腺癌小鼠模型进行完整的分析，从组织解剖到细胞分离和培养。暴露泌尿系统（UGS）后，用中等钝钳牢牢抓住膀胱，将整个系统从小鼠腹部抬起来。

将一把剪刀滑到膀胱和前列腺下，一直滑到脊柱上，通过脊髓进行切口，并切断与腹腔的任何剩余连接，以便切除整个 UGS。在解剖显微镜下将 UGS 转移到含有 2 到 6 毫升 PBS 的六厘米培养皿中。使用一对细钳和微切除剪刀小心地清除组织系统后侧和腹侧的所有脂肪，而无需剪断任何前列腺组织。

当所有的脂肪已被移除后，用钳子拉膀胱，并切除其底部的膀胱。将剩余的组织腹侧向上放置，用钳子握住一个管道末端，用剪刀将容器跟随到其底部，并在其底部切除容器。移除另一侧的同一容器，并在骨囊和前列腺之间插入钳子，以便必要时剪断任何相邻的结缔组织。

然后追踪在尿道的开创性囊泡，并在不刺穿它们的情况下取出血管。当两个囊泡被切除后，将组织后侧向上放置，以便可以看到类似蝴蝶翅膀的后叶。用钳子握住每个支叶，用剪刀切割其底部的组织，以收集支点叶，将组织转向腹侧。

收集侧叶，这是小，通常包裹尿道的一侧，并楔在前叶，内，腰和背叶之间以相同的方式。收集比横向叶大的腹叶，并躺在尿道上。然后切割并丢弃尿道以收获前叶。

要处理前列腺组织进行3D培养，请将叶转移到含有2至3毫升DMEM的10厘米培养皿中，并使用手术刀尽可能精细、均匀地切碎前列腺管。将组织片段转移到无菌组织培养罩中，并将组织溶液添加到新的 15 毫升管中。用新鲜介质将管中的体积带到9毫升，并在组织混合物中加入1毫升的 TenX 胶原酶储存溶液。

涡旋后，在37摄氏度下用震动孵育管子两小时，以降解细胞外基质。在孵育结束时，通过离心收集组织，并在EDTA中将颗粒重新悬浮在两毫升温暖的05%条中。在5分钟37摄氏度后，为了便于细胞对细胞和细胞对基质粘附的切割，使用P1000管头与宽板尖端三角组织8至10次，以分解任何团块。

使用 P200 管头尖端重复分离。然后用三毫升的完整介质中和尝试素。将 500 个单位的 DNASE1 混合到组织浆中，通过装有 18 量针的 5 毫升注射器将溶液通过 5 到 10 次，然后通过 20 量针 5 次。

当不再看到大组织碎片时，通过40微米过滤器将悬浮液过滤成50毫升的圆锥管，并通过离心收集细胞。对于细胞电镀和培养，将颗粒重新悬浮在0.5毫升完全前列腺上皮细胞生长介质中，并暗指细胞每毫升前列腺上皮细胞生长介质的5倍10至第五细胞。将细胞与基底膜外细胞基质以2至3个体积的溶液比混合，并在适当的实验细胞培养容器中镀块悬浮液。

然后将细胞放在细胞培养箱中30分钟。当细胞外基质凝固后，用预热的完整前列腺上皮细胞生长介质覆盖培养物，注意不要打扰地下室膜外细胞基质塞。然后将细胞返回到细胞培养箱5至10天，每两到三天刷新一半的培养。

要收获球体，请小心吸气介质，而不干扰地下室膜外细胞基质凝胶塞，并添加一毫升 Disbase 溶液，用于 100 微升的地下室膜外细胞基质。使用细胞刮刀，沿着板的底部刮擦，将基底膜外细胞凝胶从板的底部提升为上清液，并一次将整个溶液管起，将插头分解成更小的碎片。在细胞培养培养箱中孵育额外的细胞基质片段一到两个小时，直到地下室膜外细胞基质完全溶解。

然后将细胞悬浮液转移到15毫升管。通过离心收集细胞，以进一步下游操作。小鼠前列腺由四对叶组成，这些叶位于骨泡和呼吸道上。

前列腺叶由多个腺体轮廓组成，每个腺体由流明组成，周围是分泌的上皮细胞。叶的形状、细胞的组织和分泌物的性质因叶而异。分离的前列腺细胞早在地下室膜外细胞基质培养后四天就开始生长成器官。

在接下来的一到六天里，大多数细胞成长为固体球体，其中一小部分球体表现出部分或完全流明。球体还演示了一种强β卡泰宁染色在细胞到细胞的交汇点，与F-actin染色共同本地化。在尝试此过程时，必须仔细执行微切除步骤。

例如，分离前列腺叶，而他们仍然连接到尿道，所以你知道哪个叶是基于他们在哪里与尿道。在解剖程序之后，分离的叶可用于下游分析，如RMA测序、西游毛病或免疫污染。主要的 3D 培养技术允许您进一步深入了解前列腺癌机制，因为您可以使用球体监测生命形态和行为变化，并识别任何肿瘤变化。

总之，这种前列腺解剖和培养方法可以融入到各种下游应用中，为利用基因工程小鼠模型研究前列腺癌的机理提供有价值的信息。