一种新的脑外伤体损伤模型

本文介绍了一种新的原发性爆炸创伤性脑损伤模型。压缩空气驱动的激波管被用来暴露在体外小鼠海马切片培养器的单个冲击波。这是一个简单而快速的协议, 产生可重复的脑组织损伤, 具有较高的吞吐量。

这种方法可以帮助回答爆炸伤害创伤性脑损伤领域的关键问题，并可用于在使用更复杂的Vivvo模型之前筛选神经保护药物。这项技术的主要优点是，它使用实验室仪器，使用简单而高通量的协议，使体外体脑组织暴露在冲击波中，从而可以产生可重复的损伤。首先，将无菌定制不锈钢环插入六孔板的井中。

然后添加预加热的无血清实验介质与碘化丙二烯到井中，确保介质水平不会达到环的缺口以上。将板转移到培养箱一小时，以确保培养物在组织培养插入物转移前温度为37摄氏度。一小时后，转移组织培养物插入有机体切片从他们的生长菜到六井板的环。

在三点钟位置的插入轮圈上用永久标记笔制作一个点，以便将插入物返回到其原始位置，然后用唯一的名称和日期标记每个六个井板，并绘制每个板的孔的地图，用字母命名每个孔，每个孔中每个切片都有一个数字，以便每个切片都有一个唯一的标识符。在37摄氏度下孵育一小时，以确保切片在成像前达到37摄氏度。转移到实验介质一小时后，通过快速成像每个切片，在低功耗下分别和顺序评估切片运行状况。

使用荧光显微镜，在昏暗的房间或光线昏暗的房间里配备适当的激发和发射过滤器。成像时，请将盖子放在板上。一些冷凝可能积聚在盖子内侧。

如果发生这种情况，请简要地在盖子外盖外部的低设置上使用吹风机。确保不同天和实验之间的成像条件相同。在基线，健康的切片显示很少荧光染色。

显示浓密红色染色区域的切片表示生存能力受损，应排除在进一步分析之外。为了进行比较，此处显示了 72 小时爆炸伤害切片的荧光。成像后，立即从六孔板取出一个组织培养物，并小心地将插入物转移到无菌聚乙烯袋中，里面装着 20 毫升预加热实验介质，其中含有 95% 的氧气和 5% 的二氧化碳。

小心地清除任何气泡，并通过扭动顶部并涂抹塑料夹来密封无菌袋。确保每个无菌袋都正确标有带车牌和井号标识。将每个组织培养物插入到单个无菌袋后，将袋子和带实验介质的六个井板放入37摄氏度的培养箱中。

一小时后，小心地将无菌袋与组织培养物插入塑料盒中，装在37摄氏度的电离水中。在整个冲击波暴露方案中，水应使有机切片保持生理温度。在准备冲击管和冲击波暴露时，请穿钢皮保护靴、实验室外套和手套。

使用消隐杆将无菌袋架架螺栓固定在冲击管外向法兰上，确保中央孔与冲击管出口对齐。传感器 1（压力传感器）位于驱动部分的中间部分，传感器 2 位于冲击管的端法兰中。通过电流电源电源单元将这些压力传感器连接到示波器，然后打开示波器。

确保冲击管的电磁阀和流量控制关闭，然后打开外部压缩空气管路，将电磁阀充电至 2.5 bar。打开压缩空气缸安全阀并缓慢打开压力调节器，将压力增加至约 5 bar。接下来，通过将 23 微米厚聚酯板切成 10 到 10 厘米的正方形来准备隔膜。

从自动处理胶带中准备手柄，并将它们贴在每个隔膜的顶部和底部。在违规中放置一个隔膜，并确保它们居中。接下来，使用四个 M24 螺栓和螺母夹紧隔膜。

以对角对称的方式按顺序设计它们，同时确保隔膜无皱纹。将无菌袋夹在支架框架的垂直位置，确保组织培养物表面与有机海马片朝向冲击管出口，组织培养物插入物位于无菌袋内。对于双隔膜配置，爆破压力取决于驾驶员和双冲压室之间的气压差。

因此，对于以受控方式爆裂的隔膜，一旦达到目标压力，双破安全阀将手动打开。戴上耳罩和安全眼镜，如果还没有戴。关闭电磁阀。

打开电流电源电源单元以获取冲击波数据。操纵冲击管控制面板上的流量控制旋钮，缓慢地为冲击管的驱动体积部分加压，实现单隔膜配置，或双隔膜配置的冲击管的驱动体积部分和双隔板部分。一旦隔膜破裂，使用流量旋钮快速关闭压缩空气流量，并打开电磁阀。

冲击波参数的理想组合应足以导致组织损伤，但程度不高，导致组织培养插入或无菌袋变形或破裂。将每片片暴露在单个冲击管波中后，立即将切片返回热调节盒。然后从包装盒中取出下一个无菌袋，并夹在支架框架上。

由于低于 37 的温度可能会干扰损伤的发展，因此平稳而快速地执行开关以防止实验介质冷却。一旦所有组织培养插入物都暴露在冲击波或假协议中，将组织培养物插入回原六井板中的井中，并返回到培养箱，直到进一步成像。此图像是使用 23 微米厚聚酯薄膜获得的冲击波和 55 千帕峰值过压的代表性示例。

冲击波速度为440米/秒。50 和 55 千帕的峰值过压冲击波都造成了严重的伤害，与假组相比，在整个 72 小时协议中发展成的损伤。55千帕峰过压波暴露造成的损伤明显高于48小时72时50千帕后，表明损伤的发展与冲击波的强度成正比。

此图显示了 50 千帕爆炸 72 小时后的切片。高扩散伤害是可见的。在55公斤的超压峰值爆炸后，伤害更为明显。

这张碘化荧光丙烯图像显示了一个虚假实验的有机切片。假切片显示低荧光水平。在尝试此程序时，重要的是要记住在整个过程中保持无菌技术，以避免组织污染，并快速但非常温和地操纵组织培养，以避免意外的细胞损伤。

按照这个程序，其他方法，如免疫荧光染色可以执行，以回答其他问题，如什么是细胞死亡的机制涉及爆炸诱发创伤性脑损伤？这项技术允许神经保护领域的研究人员进行高通量检测，以探索药物在暴露于爆炸冲击波后防止细胞死亡和脑组织扩散的潜力。