Name: 一种新的脑外伤体损伤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 了解使用压缩空气驱动激波管模拟原发性爆炸性脑外伤的新方法。该技术利用小鼠海马脑片培养物建立可重复的体外损伤模型，适用于高通量神经保护药物筛选及神经元损伤机制研究。

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资助单位：英国伯明翰皇家国防医学院、英国伦敦帝国理工学院皇家英国退伍军人协会爆炸伤研究中心、英国伦敦医学研究理事会（MC_PC_13064；MR/N027736/1）、英国伦敦燃气安全基金会。丽塔·坎波斯-皮雷斯获得了葡萄牙里斯本科学技术基金会的博士培训奖学金。凯蒂·哈里斯获得了英国伦敦威斯敏斯特医学院研究基金会的博士研究生奖学金。
该模型是在帝国理工学院皇家英国军团爆炸伤研究中心（RBLCBIS）的支持下开发的。我们感谢皇家英国军团提供的资金支持。有意开展合作或希望了解更多信息的研究人员可联系作者或RBLCBIS。
我们感谢英国伯明翰皇家国防医学院研究主任Amarjit Samra博士对本工作的支持，以及Scott Armstrong外科部门 &amp;#38; 癌症，伦敦帝国理工学院，感谢其在初步实验中提供的帮助，Theofano Eftaxiopolou，Hari Arora &amp;#38; Luz Ngoc Nguyen，伦敦帝国理工学院生物工程系， &amp;#38; William Proud，伦敦帝国理工学院物理系，提供关于激波管的建议；Raquel Yustos，伦敦帝国理工学院生命科学系研究技术员，提供技术支持；Paul Brown MBE 和 Steve Nelson，伦敦帝国理工学院物理系车间经理与车间技术员，负责制作金属环；Neal Powell，伦敦帝国理工学院物理系，负责美术设计。

本文所述实验均依照英国1986年《动物（科学程序）法案》进行，并已获得动物福利伦理委员会批准 &amp;#38; 伦敦帝国理工学院伦理审查委员会。动物护理遵循伦敦帝国理工学院的机构指导方针。
1. 海马器官型切片的制备与培养
注意：本方案允许根据Stoppini及其同事所描述的界面法并稍作修改后制备海马区器官型脑片21,22,23。理想情况下，每次实验不应超过三只动物同时处死和解剖，以确保每一步操作迅速完成，并避免影响脑片质量。整个过程中应采用无菌技术。
<ol>
	<li>开始解剖实验方案前，请确保完成以下步骤。
	<ol>
		<li>提前使用 0.22 µm 滤膜制备并过滤除菌所有溶液。</li>
		<li>在储存期间以及整个脑组织解剖和海马切片制备过程中，将溶液保持在 4 °C；始终将储存容器和培养皿置于湿冰上的金属散热板上。</li>
		<li>对所有金属器械、金属环和纸巾进行高压灭菌处理。</li>
		<li>确保实验方案每一步所需的所有器械和材料均已准备就绪，提前摆放整齐，并用 70% 乙醇喷洒；确保其已冷却并干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过颈椎脱位法处死一只出生 5–7 天的 C57BL/6N 小鼠幼崽，并用浸有 70% 乙醇的无菌纸巾轻轻擦拭整个体表皮肤。轻拍皮肤使其干燥，然后使用梅奥剪刀将幼崽头部剪下。</li>
	<li>使用虹膜剪沿头部正中线从枕部开始向前至吻部剪开头皮，并向两侧牵拉暴露颅骨。</li>
	<li>将范纳斯剪的尖端插入枕骨大孔，在横窦处沿两侧骨面做两个小的横向剪切，然后沿正中线向上剪开颅骨至嗅球区域，并在此区域垂直于正中线做两个小切口。</li>
	<li>使用细头弯镊将颅骨瓣向两侧轻轻掀开，小心用小刮匙取出脑组织，并转移至一个盛有&#34;解剖液&#34;的 90 mm 硅弹性体包被培养皿中。 
	注：解剖液为盖氏平衡盐溶液（含 5 mg/mL D-葡萄糖、1% 抗生素-抗真菌素溶液，其中含 10,000 单位/mL 青霉素、10 mg/mL 链霉素和 25 µg/mL 两性霉素 B）。</li>
	<li>使用刀片去除小脑，并沿正中线分离大脑半球。用刮匙将大脑半球转移至另一个盛有新鲜冰冻解剖液的 90 mm 硅弹性体包被培养皿中。若一次实验需使用多只动物，请重复步骤 1.2–1.6。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用刀片切除嗅球和额叶皮层尖端，并用细头镊子将大脑皮层与其他脑组织分离。此步骤可使海马在皮层组织内侧表面暴露。从本步骤起，应在层流式组织培养罩内操作（已进行紫外线灭菌并用 70% 乙醇溶液清洁）。</li>
	<li>将冰冻的解剖液滴加至平坦的塑料切片盘上，用刮匙将脑组织置于切片盘上，使皮层内侧面朝上，海马轴线与切片刀轴线垂直。</li>
	<li>使用细头巴斯德移液管尽可能吸除切片盘上的解剖液。</li>
	<li>使用组织切片机以 50% 的切割速度和力度将脑组织切成 400 µm 厚的切片。 
	注：此步骤必须尽快完成，因为脑组织未浸没在解剖液中。</li>
	<li>将硅弹性体包被培养皿中的解剖液更换为新鲜的冰冻解剖液。</li>
	<li>切片完成后，小心将脑组织浸入新鲜解剖液中，并使用直刃手术刀将切好的组织转移回 90 mm 硅弹性体包被培养皿中。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用细头镊子小心分离皮层切片。对每一片切片，检查海马形态以及是否存在因解剖或切片造成的组织损伤。</li>
	<li>使用细头镊子和小型范纳斯剪，将海马从内嗅皮层和海马伞中分离出来。通常每个半球可获得约 6 至 8 个海马切片。</li>
	<li>使用剪口的巴斯德移液管将最多 6 个海马切片转移至组织培养插入式小室中，并将其放入 35 mm 培养皿内。确保切片之间间隔数毫米（以保证每个切片可被单独成像）。</li>
	<li>立即向每个培养皿底部、组织培养插入式小室下方加入冰冻的&#34;生长培养基&#34;，液面加至略低于插入式小室边缘顶部。 
	注：生长培养基包含 50% Eagle 最低必需培养基、25% Hank's 平衡盐溶液、25% 马血清、5 mg/mL D-葡萄糖、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1% 抗生素-抗真菌素溶液和 10 mmol/L HEPES，用氢氧化钠调节 pH 至 7.2。</li>
	<li>解剖后次日更换一次生长培养基，之后每 2 至 3 天更换一次（使用 37 °C 的生长培养基）。确保加入足量培养基，但不可过多以致溢出组织培养插入式小室膜表面，否则可能影响组织切片的存活率。</li>
	<li>将组织切片置于 37 °C、5% 二氧化碳空气氛围的湿润化培养箱中培养 12 至 14 天，之后方可用于实验。</li>
</ol>
2. 实验性爆震性创伤性脑损伤方案用海马器官型切片的制备
注意：本节所有步骤（除成像外）均须在层流式组织培养罩内进行。
<ol>
	<li>将定制的不锈钢环插入6孔板中（每孔一个）。 
	注意事项：这些环状物具有带缺口的边缘（缺口应位于12点钟位置），可紧密地嵌入孔内，而组织培养插入物可轻松置于该边缘上。确保提前用杀菌消毒剂清洗环状物，用纯化水彻底冲洗，高压灭菌，并使其充分冷却。</li>
	<li>用预热（37 °C）的无血清培养基填充6孔板的孔 &#34;实验培养基&#34; 碘化丙啶染色。 
	注意：含碘化丙啶的实验培养基成分为：75% Eagle 最低必需培养基，25% Hanks' 平衡盐溶液，5 mg/mL D-葡萄糖，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1% 抗生素-抗真菌素溶液，10 mmol/L HEPES 和 4.5 µmol/L 碘化丙啶，用氢氧化钠调节 pH 至 7.2。</li>
	<li>确保培养基液面不超过环形支架的切口位置。将带有环形支架的6孔板放回培养箱中孵育1小时，以保证在转移组织培养小室前培养基温度立即达到37 °C。</li>
	<li>使用镊子将带有类器官切片的组织培养小室从35 mm培养皿转移至含有支撑环和实验培养基的6孔板中。</li>
	<li>用永久性记号笔在插入件边缘的3点钟位置做一个标记点。 
	注意：在实验过程中， inserts 将从6孔板中取出，此步骤有助于在冲击波暴露后将 insert 放回原始位置，并在整个实验流程中方便追踪每个脑片。</li>
	<li>为每个6孔板标记唯一的名称 &amp;#38; 日期，并绘制每块板各孔的位置图，为每个孔命名（例如A、B、C 等等）以及每个孔中的每一片（例如., 1, 2, 3, 等等），以便每个切片都有一个唯一的标识符（例如., A1, A2, A3 等等.).</li>
	<li>将6孔板转移至培养箱中孵育1小时，以确保成像前脑片温度达到37 °C。 
	注意：避免培养基溢出或组织培养插件膜下产生气泡，以免影响切片的存活率。</li>
	<li>转移至实验培养基后1小时，使用配备适当激发滤光片（BP 535/50 nm）和发射滤光片（LP 610 nm）的荧光显微镜（2倍物镜，NA 0.06），对每一片组织切片单独成像，以在实施损伤实验方案前评估切片的健康状态。 
	注意事项：在此阶段，若切片出现密集红色染色区域，则表明其活性受损，应排除在后续分析之外（此类切片通常占总切片数的不到10%）。成像过程应按顺序尽快完成，以尽量缩短切片在培养箱外的时间（通常6个孔的成像时间应略少于30分钟）。</li>
	<li>始终盖好6孔板的盖子。盖子内部可能会产生一些冷凝水。如果发生这种情况，可短暂使用吹风机低档吹干。</li>
	<li>确保不同日期及不同实验之间的成像条件完全一致。 
	注意：成像的目的是定量组织荧光，因此该步骤对于确保结果的可重复性以及对所获数据进行比较至关重要。</li>
</ol>
3. 海马组织切片培养插件的浸没与转运
<ol>
	<li>成像后立即在超净工作台中用镊子从6孔板中取出一个组织培养小室。</li>
	<li>小心地将插入物转移至无菌聚乙烯袋（3&#34; × 5&#34;预先装有20 mL温热（37 °C）实验培养基的容器，培养基经新鲜通入95%氧气和5%二氧化碳混合气体。 
	注意：确保将实验培养基置于Dreschel瓶内，使用烧结玻璃鼓泡器通入95%氧气和5%二氧化碳混合气体至少40分钟，然后在超净台中用带细菌过滤器的20 mL注射器和连接的无菌填充管（127 mm）将培养基转移至无菌聚乙烯袋中。立即密封袋子并转移&#160;置于37 °C培养箱中孵育至少1小时，然后再进行组织培养小室的转移。</li>
	<li>确保每个无菌袋均正确标记（标注培养板和孔的编号）。对每个组织培养插件重复此步骤。密封无菌袋时需小心排除气泡（通过扭转袋口并使用塑料夹夹紧来确保密封）。</li>
	<li>将装有组织培养插件和实验培养基的无菌袋以及6孔板放回37 °C培养箱中。</li>
	<li>孵育1小时后，将含有组织培养插件的无菌袋小心装入塑料盒中，并置于充满37 °C去离子水的温控箱内，以确保在冲击波暴露实验过程中类器官切片始终维持在生理温度。</li>
</ol>
4. 冲击管与海马器官型脑片冲击波暴露的准备
<ol>
	<li>在制备激波管和进行激波暴露时，需穿戴钢头防护靴、实验服和手套。</li>
	<li>将无菌袋支架框架用螺栓固定在激波管远端法兰上，确保其中心孔与激波管出口对齐（使用堵杆进行校准）。</li>
	<li>径向安装两个压力传感器：传感器1位于驱动段中部，传感器2位于激波管的远端法兰上（图1A）。通过恒流电源单元将压力传感器连接至示波器。</li>
	<li>确保所有激波管释放阀和流量控制阀均处于关闭状态。</li>
	<li>打开外部压缩空气管线，将电磁阀充气至2.5 bar。</li>
	<li>打开压缩空气钢瓶的安全阀，缓慢打开压力调节器，将压力升至约5 bar。 
	注意：该调节器设定的压力应略高于隔膜破裂的最高压力。</li>
	<li>准备隔膜：将23 µm厚的聚酯薄膜裁剪成10 x 10 cm2的正方形。使用高压灭菌胶带制作手柄，并将其粘贴在每张隔膜的顶部和底部。</li>
	<li>在药室中放置一张隔膜（双药室单槽——单隔膜构型）或两张隔膜（双药室双槽——双隔膜构型）（图1B）。</li>
	<li>将隔膜居中，并使用四个M24螺栓和螺母按对角对称顺序依次紧固，确保隔膜平整无褶皱。</li>
	<li>将每个无菌袋单独垂直夹紧在支架框架上，确保含有类器官型海马切片的组织培养插件表面正对激波管出口，且组织培养插件在无菌袋内居中（图1C）。务必确保无菌袋四周牢固夹紧，以实现稳定且均匀的固定。</li>
	<li>在对激波管加压时，需佩戴耳罩和护目镜。打开恒流电源单元和示波器以采集激波数据（采样速率为50兆样本/秒，记录长度为20 ms，共100万个数据点），并关闭电磁阀。</li>
	<li>使用激波管控制面板上的流量控制旋钮，缓慢对驱动段加压（单隔膜构型），或同时对驱动段和双药室段加压（双隔膜构型）。 
	注意：对于单隔膜构型，破裂压力仅取决于隔膜材料、厚度，当达到材料的破裂压力时，隔膜将自发破裂。对于双隔膜构型，破裂压力还取决于驱动段与双药室腔之间的气体压力差；为实现可控破裂，需在达到目标压力后手动打开双药室安全阀。</li>
	<li>一旦隔膜破裂（产生巨大声响），立即使用流量旋钮关闭压缩空气流，并打开电磁阀。 
	注意：通过插入堵块可调节驱动段的总体积，从而获得更广泛的激波峰值超压和持续时间。理想的激波参数组合应足以引起组织损伤，但又不能过高，以免导致组织培养插件或无菌袋变形或破裂。</li>
	<li>对每个装有组织培养插件的无菌袋施加一次激波后，立即将其放回温控箱中，随后从箱中取出下一个无菌袋并夹紧在支架框架上。确保步骤4.10–4.14尽可能平稳且迅速地完成（数分钟内），以防止实验培养基冷却，因温度低于37 °C可能干扰损伤的发展。</li>
	<li>所有组织培养插件完成激波暴露（或假处理程序）后，将其放回原始的6孔板中对应孔位（在超净台内操作），并放回培养箱。</li>
	<li>将6孔板置于37 °C、含5%二氧化碳的培养箱中，直至进行后续成像分析。</li>
	<li>每次实验均应设置假处理对照组，与切片激波暴露实验同时进行。 
	注意：假处理切片的处理方式与激波暴露切片完全相同（密封于含实验培养基的无菌袋中，用相同的温控箱运送至激波管实验室，并在金属支架上悬挂相同时间），但不触发激波管。</li>
</ol>
5. 海马类器官切片损伤定量分析
<ol>
	<li>在24 h、48 h和72 h时，按照步骤2.8和2.9所述方法对切片进行成像。</li>
	<li>在冲击波暴露后72 h成像完成后，根据当地生物废弃物处理规程丢弃组织，并对金属环进行消毒和高压灭菌。</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

在与爆炸性创伤性脑损伤（原发性、继发性和三级爆炸损伤机制）相关的所有损伤机制中，原发性爆炸损伤是爆炸伤所特有的，也是目前对爆炸相关机制中了解最少的一种1,2. 本研究中描述的新方案旨在利用开放式冲击管暴露系统研究原发性爆震性创伤性脑损伤（primary blast TBI） 体外 利用一种简单且快速的方案，对中国台湾地区小鼠海马脑片培养物施加单次冲击波，以实现可重复的原发性爆炸性创伤性脑损伤的高通量构建。
第一个 体外 初级爆震性创伤性脑损伤模型对细胞施加了静水压力波26,27然而，压力输出并未呈现Friedlander函数特征，因为静水压力脉冲的持续时间远长于空气中爆炸超压波的持续时间。13特征性的弗里德兰德函数可使用激波管在实验室中轻松模拟。1,8冲击管可在常规实验室环境中产生冲击波，模拟真实开放场地爆炸，同时通过改变隔膜材料与厚度以及驱动气体体积，精确控制波形参数，如峰值超压、正压相持续时间和冲量。8,28,29.
简单 体外 细胞培养等模型通常缺乏细胞类型的异质性和突触连接性30最近，爆炸对 体外 已对包含不同类型细胞的脑细胞“类球体”进行了研究31值得进一步研究这些有趣的制备样本；然而，目前尚不清楚它们的细胞组织和连接方式在多大程度上模拟了完整大脑的结构。OHSC 是一种成熟的 体外 实验模型23,32，易于培养，其三维组织细胞结构、细胞分化和突触连接均得到良好保存，且与体内情况非常相似 体内33,34,35,36. OHSCs 代表了介于细胞培养与完整 organism 之间的中间复杂性水平 体内 模型23,32. OHSCs 已被证明能够复制 体外 在神经退行性病变中观察到的病理性级联反应 体内 模型在潜在神经保护药物的筛选及其作用机制研究中发挥了重要作用17,21,22,37,38最后，所研究的解剖区域——海马体——在转化性创伤性脑损伤（TBI）研究中具有高度相关性，因为该区域在TBI患者中常受到损伤。39,40,41.OHSC 已被用于模拟爆炸性创伤性脑损伤28,42,43,44然而，我们的模型相对简单，无需复杂的改装，即可适配现有的水平或垂直构型的激波管。
OHSC 可在培养条件下维持多天，便于随时间推移对生物过程进行研究34在此模型中，使用碘化丙啶（propidium iodide）这一公认的细胞损伤标志物，于爆震暴露后连续三天每日检测冲击波暴露所致的组织损伤。碘化丙啶是一种无毒且高度极性的染料，可穿透细胞膜受损的细胞，在细胞内与核酸结合后产生特征性的亮红色荧光。24,25,45使用碘化丙啶测得的荧光已被证明具有&#160;与尼氏染色法测定的损伤细胞数量具有良好的相关性46,47.
鉴于该模型产生的损伤是弥散性的（图2C），在进行分析时测量了整个切片的荧光强度，这与先前在其他脑损伤模型中发表的研究类似。21,22，而不是像其他研究中那样使用特定区域 体外 爆震性创伤性脑损伤模型28,43,44,48该模型所采用的全局分析方法还能消除在划定特定感兴趣区域时可能引入的变异性，从而更全面地呈现与爆炸相关的损伤情况。两种冲击波峰值超压（50 kPa 和 55 kPa）均导致了显著的（p&#160;&#60;0.05 和 p&#160;&#60;0.0001），与假手术组切片相比出现损伤图2B). 正如预期，峰值超压最高的冲击波（55 kPa）造成的损伤大于50 kPa冲击波。在一项 体外 脑组织模型直接暴露于冲击波下，如何准确地将其效应 Scaling 至完整生物体或人类并不简单。然而，本研究所使用的冲击波峰值超压处于实地观测到的范围内，通常为 50–1,000 kPa8,49.
为了在冲击波暴露过程中维持离体脑片（OHSC）处于生理温度以及正常的氧气和二氧化碳水平，同时确保其在整个实验过程中免受污染，采用无菌操作技术将组织培养插入物密封于无菌聚乙烯袋中，并浸入预热至 37 °C 并经 95% 氧气和 5% 二氧化碳新鲜通气的实验培养基中，方法类似于先前已发表的研究28,43,44,48。与以往使用复杂装置固定无菌袋进行冲击波暴露的模型不同，本方案采用一种简单且快速的方法，将离体脑片（OHSC）组织培养插入物悬置于冲击管出口前方（图 1A、C）。本文所述模型可实现快速处理和高通量操作，同时最大限度降低低温风险。这些优势在神经保护研究中尤为重要，因为某些治疗干预措施在创伤性脑损伤（TBI）后可能仅有非常短暂的有效应用时间窗。该新型冲击波暴露方案可在短时间内（约 1 小时）使 6 至 9 个组织培养插入物（通常为 36 至 54 片海马区类器官组织切片）接受冲击波暴露。
在整个操作过程中，OHSCs 需要良好的无菌技术。在培养以及将组织转移至无菌袋进行爆震处理时，必须始终使用无菌超净工作台。为了在保持6孔板盖子封闭的无菌条件下进行切片成像，我们使用定制的金属环将细胞培养插件抬升至显微镜的焦平面。本实验方案的一个重要环节是：每次实验均包含未受损伤的假手术对照切片。假手术切片除不触发激波管外，其余处理均与爆震切片完全相同；另一个关键步骤是，所有切片均需在损伤或假手术处理前1小时进行成像，以确保所用切片群体的健康状况一致（图2B）。
除了随时间定量评估切片中的细胞损伤外，还可在实验结束时对组织进行固定，用于常规免疫组织化学分析50。我们采用小鼠海马切片开发并评估了该方法。然而，本技术也可轻松适用于其他可在体外培养的组织，例如脊髓、视网膜、肺或上皮组织。在本文及我们此前对该模型的研究中，仅探讨了单次爆炸暴露的影响。然而，该模型也非常适合用于研究反复低强度爆炸对脑组织或其他组织的影响。离体脑片培养物（OHSCs）可在培养中维持数周甚至数月，从而可研究其慢性效应。
体外 模型，相较于 体内 模型通量更高、成本更低，且实验通常可在更短的时间尺度内完成17然而，使用以下方法获得的结果 体外 模型需要在动物模型中进行验证 体外 培养的组织被置于人工环境中，其对损伤的反应可能与在自然条件下有所不同 体内17然而， 体外 模型在增进我们对脑损伤级联反应的理解以及在使用更复杂的模型前筛选神经保护药物方面已变得极为重要 体内 模型17,22,51,52尽管该模型具有诸多优势，但需要注意的是 体外 模型缺乏动物创伤性脑损伤（TBI）中的关键特征 体内 模型，例如对血管系统的影响、颅内压升高、全身免疫反应以及功能行为障碍，这凸显了验证在这些模型中所获得结果的必要性 体外 整体动物模型。然而， 体外 诸如本文所述的模型，是极具转化相关性的科学工具。
综上所述，本研究介绍了一种简单直接的新方法，利用实验室冲击管对小鼠海马组织器官型培养物施加严格控制且可重复的、接近真实情况的冲击波。通过碘化丙啶（一种公认的细胞损伤标志物）定量分析所产生的整体性损伤，结果显示该损伤具有高度可重复性，并与所施加冲击波的峰值超压成正比。

爆炸性创伤性脑损伤（blast traumatic brain injury，blast TBI）是一种由爆炸装置引爆引起的复杂类型的脑损伤1,2。在过去15年中，随着伊拉克和阿富汗战争的爆发，爆炸性TBI已成为一个重大的健康问题2,3。总体估计，从伊拉克和阿富汗返回的士兵中有4.4%至22.8%遭受过轻度TBI，其中很大一部分与爆炸有关，且美国部队中报告的爆炸性TBI发生率高于英国部队4,5。
简易爆炸装置的使用是导致军事人员遭受爆炸相关创伤（包括爆炸性创伤性脑损伤）的主要原因6。爆炸物引爆后会在毫秒内引发极为迅速但短暂的压力升高。真实开放环境中爆炸所产生的超压波可用Friedlander函数建模，其特征为压力迅速上升至峰值超压，随后呈指数衰减7,8。爆炸事件中所出现的极端力值及其快速的时间进程，通常在非爆炸性创伤中不会出现1,9。峰值超压（即波形的最大压力）以及正压相持续时间被认为是导致爆炸性脑损伤的重要因素，而这些参数取决于爆炸物的装药量以及与爆炸点的距离10,11。
爆炸冲击所致的创伤可分为四种独立的类型，分别称为原发性、继发性、三级和四级冲击伤10,12,13,14。每种类型均与特定的致伤机制相关。原发性冲击伤由超压波对器官和组织的直接作用引起2,13。继发性冲击伤由投射物碎片的撞击引起，可导致穿透性和非穿透性损伤2,15。三级冲击伤发生在受害者身体被冲击力抛掷并与地面或周围物体发生碰撞时，通常与加速度/减速度力相关1,10,13。四级冲击伤指与爆炸直接相关但未被前述三种机制涵盖的一类异质性损伤12,13，包括（但不限于）热损伤、烟雾吸入、辐射、电磁波以及不良心理效应13,15。大多数与爆炸相关的创伤性脑损伤（TBI）直接源于前三种致伤机制，而四级冲击伤机制通常与全身性损伤相关13。加速度/减速度力（例如，挥鞭样损伤）、钝性及穿透性创伤性脑损伤在其他类型的TBI（例如，机动车事故、跌倒、弹道损伤）中已有广泛研究。然而，原发性冲击超压波是冲击伤所特有的，其对脑组织的影响尚不十分清楚16。与超压波相关的原发性冲击伤机制是首先作用于脑组织的机械力。
在过去的几十年中，人们开发了多种创伤性脑损伤（TBI）的临床前模型，这些模型对于理解爆炸所致TBI的损伤机制和病理生理过程，以及探索潜在的新疗法具有重要价值，而这些研究若仅在临床环境中进行则是不可能实现的17,18,19尽管没有任何单一的临床前模型能够完全再现临床爆震性脑损伤的复杂性，但通常不同的临床前创伤性脑损伤（TBI）模型可以分别模拟人类TBI的不同方面。与爆炸相关的各种致伤力的作用可以在体外或体内单独或联合进行研究。 体外 和 体内 爆震性TBI模型 体外 模型的优势在于能够严格控制实验环境（组织生理条件和损伤生物力学），从而减少生物学变异，提高可重复性，使得在排除动物模型中混杂因素干扰的情况下研究特定分子级联反应成为可能20我们的目标是开发&#160;一个 体外 用于研究初级爆震对脑组织影响的模型。我们的目标是开发一种具有超音速冲击波且呈现Friedlander波形的模型，以模拟自由场爆炸（如简易爆炸装置（IED）产生的爆炸）所引发的冲击波特征。

<table><tbody><tr><td>格伊斯平衡盐溶液</td><td>Sigma 英国</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma 英国</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>Sigma 英国</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Eagle最低必需培养基</td><td>Sigma 英国</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Hanks平衡盐溶液</td><td>Sigma 英国</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma 英国</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma 英国</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Prolabo，比利时</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma 英国</td><td>S-0945</td><td></td></tr><tr><td>组织培养小室</td><td>Millicell CM 30 mm 低高度 Millipore</td><td>PICM ORG 50</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>NUNC，丹麦</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma 英国</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>无菌聚乙烯袋 - Twirl'em 无菌采样袋</td><td>Fisherbrand</td><td>01-002-30</td><td></td></tr><tr><td>Portex Avon Kwill 填充管 5&quot; (127 毫米)</td><td>史密斯医疗用品公司</td><td>E910</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>NIKON Eclipse 80i，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>尼康 Plan UW 放大倍数 2x，数值孔径 0.06，工作距离 7.5 mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜滤光片</td><td>尼康 G-2B（长通发射）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚酯电气绝缘膜，304 毫米 × 200 毫米 × 0.023 毫米</td><td>RS Components 英国</td><td>785-0782</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Dytran Instruments Inc.</td><td>2300V1</td><td></td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>英国萨里郡吉尔福德，Mickle 实验室工程公司</td><td>Mcllwain组织切碎机</td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶弹性体</td><td>美国道康宁公司</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>绘图 &amp;和统计软件</td><td>GraphPad Software，美国</td><td>Prism 7.0</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型方法 体外 爆炸性创伤性脑损伤模型

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

创伤性脑损伤是军用和民用人群中导致死亡和残疾的主要原因。爆炸性创伤性脑损伤由爆炸装置的引爆引起，然而，暴露于爆炸超压所导致脑损伤的机制尚未完全明确，并被认为具有此类脑损伤的独特性。临床前模型是深入理解爆炸所致脑损伤的重要工具。本研究采用一种开口式激波管建立了一种新型的体外（in vitro）爆炸性TBI模型，以模拟符合Friedlander波形的真实开放环境爆炸冲击波。将C57BL/6N小鼠的海马器官型脑片培养物暴露于单次冲击波，并利用碘化丙啶（propidium iodide）在长达72小时的时间内表征损伤的发展过程；碘化丙啶是一种公认的荧光性细胞损伤标志物，仅能穿透细胞膜受损的细胞。在整个实验过程中，与假暴露组脑片相比，暴露于冲击波的脑片中碘化丙啶荧光强度显著升高。脑组织损伤具有高度可重复性，并与施加冲击波的峰值超压呈正比关系。

本方法所用的激波管能够产生超压瞬态，以模拟由弗里德兰德函数建模的真实开放场地爆炸7,8。实验中获得了速度为440 m/s（马赫数1.3）的超音速激波（图2A）。所报告的波形数据来自传感器2，该传感器径向置于激波管驱动段末端。
采用上述方案，暴露于单次冲击波的海马区器官型脑片培养物（图 2A使用碘化丙啶（一种高极性荧光染料，仅能穿透细胞膜受损的细胞）进行定量，可检测到显著的细胞损伤24,25 (图2B, C).
即使在最佳条件下，也与其他已发表的OHSC模型一致21,22，背景中的碘化丙啶荧光水平较低，部分原因在于固有的组织操作（如培养期间的换液或成像时将样本从培养箱中取出）导致的轻微损伤。该爆炸性创伤性脑损伤（blast TBI）实验方案涉及大量操作，包括将脑片浸入无菌袋中的培养基内，以及在冲击波暴露过程中进行较多的样本处理。例如，将无菌袋夹在支架框架上）。然而，只要所有步骤均谨慎操作，这种额外操作不会影响OHSC的基本健康状况，因为在全程保存于6孔板中的对照组切片之间未观察到显著差异（即，插入物未被浸没或触碰）以及假手术组，该组包含被置于无菌袋内并夹在冲击管上的切片图2B).
选择的两个冲击波（峰值超压分别为 50 kPa 和 55 kPa）在爆炸暴露方案后的所有时间点均产生了显著（p &lt;0.05 和 p &lt;0.0001， respectively）且可重复的损伤，与未受伤的假手术组切片相比，未对组织培养插件或无菌袋造成任何损害（图 2B）。为了确定该模型对峰值超压微小差异的敏感性，我们选择相差约 10% 的数值。这些结果还表明，正如预期，55 kPa 冲击波造成的损伤高于 50 kPa 冲击波。 
数据以均值 ± 均值标准误表示。采用双因素重复测量方差分析（Holm-Sidak法）进行显著性检验。 事后检验 检验。因素1为组别（对照组、假手术组、爆震组），因素2为损伤后时间（-1 h、24 h、48 h和72 h），其中因素1为重复因素。对 p 用于多重比较的值。 P 小于0.05的值被视为组间差异具有统计学意义。统计检验使用图形与统计软件包进行。
<img alt="用于压力分析的冲击管装置示意图，包含控制面板、传感器和示波器设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：带有无菌袋固定架框架的冲击管装置示意图。（A）冲击管是一根长3.8 m的不锈钢管，由三段各长1.22 m的管段通过垫片和法兰连接而成，内径为59 mm。（B）插图显示双膛室组件。一个或两个聚酯薄膜隔膜可通过橡胶O形圈密封后夹紧在该组件中。（C）无菌袋固定架框架。框架本体由两块金属板组成，中央有一个圆形孔（直径59 mm），与冲击管出口对齐。两片薄（4 mm）硅胶弹性体片安装在两块金属板之间。这些片材的作用是提供均匀且防滑的表面，以夹紧无菌袋。无菌袋与冲击管出口之间的距离为7 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="爆炸暴露研究中的压力-时间曲线图、荧光强度柱状图及荧光细胞图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：器官型海马脑片培养中的典型冲击波及所致损伤。 (A) 冲击波的代表性示例，通过使用获得 23 µm- 厚聚酯薄膜，爆破压力为2.16 bar，峰值超压为55 kPa，正压相持续时间为0.4 ms，冲量为10.1 kPa·ms。波形数据来自安装在激波管驱动段远端法兰上的径向传感器2。激波速度为440 m/s（马赫数1.3）。(B损伤程度与冲击波强度成正比。与假暴露组相比，50 kPa和55 kPa峰值超压冲击波均引起显著损伤，且损伤在72小时实验过程中持续发展。在48小时和72小时时间点，55 kPa峰值超压冲击波导致的损伤显著高于50 kPa冲击波。假暴露组脑片处理方式与冲击组相同，但冲击管未触发。对照组脑片则置于6孔板中，在培养箱内静置，不进行任何处理。柱状图表示均值，误差线为标准误（n = 7，对照组；n = 48，假暴露组；n = 30，50 kPa冲击组；n = 51，55 kPa冲击组；n为脑片数量，来自6次独立实验）。 *p &lt;0.05, ****p &lt;0.0001，与假手术组相比。 #p &lt;0.05, ##p &lt;0.01，与爆震55 kPa相比。C代表性碘化丙啶荧光图像，来自器官型脑片i) 假手术组，（ii) 冲击 50 kPa 和 (iii) 爆震55 kPa组在损伤后72 h。假手术切片显示荧光水平较低， 即损伤，且爆炸暴露的切片显示出高水平的弥漫性损伤，55 kPa峰值超压暴露切片中的损伤更为显著（比例尺 = 500 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种原发性冲击波致创伤性脑损伤的新型模型。采用压缩空气驱动的激波管对受试对象进行暴露 体外 小鼠海马脑片培养单次冲击波处理。该方法是一种简单、快速的方案，可高通量地产生可重复的脑组织损伤。

创伤性脑损伤是军用和民用人群中死亡和残疾的主要原因。爆炸性创伤性脑损伤由……引起。

该方法有助于解答爆炸性创伤性脑损伤领域中的关键问题，并可在使用更复杂的体内模型之前，用于筛选神经保护药物。该技术的主要优势在于，它利用实验室仪器，通过一种简单且高通量的方案，对体外的大块脑组织施加冲击波，从而实现可重复的损伤建模。首先，将无菌的定制不锈钢环插入六孔板的孔中。然后向孔中加入预热的含碘化丙啶的无血清实验培养基，确保培养基液面不超过环形支架的凹口。将培养板转移至培养箱中孵育1小时，以确保培养基温度达到37摄氏度，然后再转移组织培养插件。1小时后，将含有类器官切片的组织培养插件从生长培养皿中转移至六孔板中的环形支架上。用永久性记号笔在插入物边缘三点钟位置做一个标记点，以便将插入物恢复至原始位置；然后为每块六孔板标注唯一的名称和日期，并绘制每块板的孔位图，用字母标记每个孔，用数字标记每个孔中的脑片，使每一片脑片具有唯一的标识符。在成像前，于37摄氏度孵育一小时，以确保脑片在成像时立即达到37摄氏度。转移至实验培养基后一小时，通过在低倍镜下依次快速成像每一片脑片，评估脑片的健康状态。使用配备适当激发和发射滤光片的荧光显微镜进行观察，理想条件下应在暗室或光线较暗的房间中操作。成像时保持培养板盖子处于关闭状态。盖子内部可能会产生一些冷凝水。如果发生此情况，可短暂使用吹风机低档对外部盖子进行吹风。确保不同天数及不同实验之间的成像条件保持一致。在基线状态下，健康的脑片仅显示极微弱的荧光染色。出现密集红色染色区域的切片表明其活性受损，应排除在进一步分析之外。作为对比，此处展示了爆炸损伤切片在72小时时的荧光图像。成像后立即从六孔板中取出一个组织培养插件，并小心将其转移至含有20毫升预热实验培养基的无菌聚乙烯袋中，该培养基经95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和。小心去除所有气泡，并通过扭转无菌袋顶部并夹上塑料夹来密封。确保每个无菌袋均正确标注了培养板和孔的编号。将每个组织培养小室转移至单独的无菌袋后，将无菌袋连同含实验培养基的六孔板一起放入37°C培养箱中。一小时后，将含有组织培养插件的无菌袋小心地装入塑料盒中，并置于装有37摄氏度离子化水的温控箱内。水温应在整个冲击波暴露过程中保持类器官切片的生理温度。在准备冲击管和进行冲击波暴露时，应穿戴钢头防护靴、实验服和手套。使用封堵杆将无菌袋支架框架固定到激波管远端法兰上，确保其中心孔与激波管出口对齐。传感器一为压力换能器，位于驱动段中部；传感器二位于激波管的远端法兰。通过恒流电源单元将这些压力换能器连接至示波器，并打开示波器。确保激波管的电磁阀和流量控制阀处于关闭状态，然后打开外部压缩空气管路，将电磁阀充气至2.5 bar。打开压缩空气钢瓶的安全阀，缓慢调节减压阀，使压力升至约5 bar。接下来，准备膜片：将23微米厚的聚酯薄膜裁剪成10厘米×10厘米的正方形。使用高压灭菌胶带制备手柄，并将其粘贴到每个隔膜的顶部和底部。将一个隔膜放置在开口处，并确保其居中。接着，使用四个 M24 螺栓和螺母将隔膜夹紧。以对角线对称的方式依次成型，同时确保隔膜无皱褶。将无菌袋垂直夹持在支架框架上，确保带有器官型海马切片的组织培养插入物的表面朝向冲击管出口，并且组织培养插入物位于无菌袋内部中央。对于双隔膜结构，破裂压力取决于驱动腔与双破裂腔之间的气体压力差。因此，为了以受控方式使隔膜破裂，在达到目标压力后需手动打开双破裂安全阀。如果尚未佩戴，请戴上护耳器和防护眼镜。关闭电磁阀。打开电流源电源单元以获取激波数据。调节激波管控制面板上的流量控制旋钮，缓慢加压激波管的驱动腔部分（单膜片配置），或同时加压驱动腔部分和双破裂腔部分（双膜片配置）。一旦膜片破裂，立即使用流量旋钮关闭压缩空气流动，并打开电磁阀。理想的冲击波参数组合应足以引起组织损伤，但又不能过高，以免导致组织培养插入物或无菌袋发生形变或破裂。每次脑片暴露于单次激波管冲击后，应立即将其放回温控箱中。随后从箱中取出下一个无菌袋，并将其固定在支架框架上。操作切换应平稳迅速，以防止实验培养基冷却，因为低于37°C的温度可能干扰损伤的形成。当所有组织培养小室均接受冲击波或假处理方案后，将组织培养小室放回原始的六孔板中的对应孔内，并放回培养箱中，直至进行后续成像。此图像为使用23微米厚的聚酯膜并产生55千帕峰值超压时获得的冲击波的代表性示例。冲击波速度为 440 米每秒。与假手术组相比，50 千帕和 55 千帕峰值超压冲击波均在 72 小时实验过程中引起显著损伤。在暴露于 55 千帕峰值超压冲击波后，48 小时和 72 小时的损伤程度显著高于 50 千帕组，表明损伤的发展程度与冲击波强度成正比。此图像显示了一次50千帕爆炸后72小时的脑组织切片。可见广泛的损伤。在55千帕峰值超压爆炸后，损伤更为明显。该碘化丙啶荧光图像显示了一次假手术实验的器官型脑片。假手术组脑片显示出较低水平的荧光。在进行此操作时，重要的是始终牢记保持无菌技术，以避免组织污染，并应快速但极其轻柔地操作组织培养物，以防止意外的细胞损伤。采用此方法后，可进一步进行免疫荧光染色等其他实验，以回答更多科学问题，例如：爆炸所致创伤性脑损伤中涉及的细胞死亡机制是什么？该技术为神经保护领域的研究人员提供了一种高通量检测手段，可用于探索药物在暴露于爆炸冲击波后阻止细胞死亡及脑组织损伤扩散的潜力。

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