成人脊髓细胞核在大规模平行单核 RNA 测序中的分离

在这里, 我们提出了一个协议, 快速隔离高品质的核从新鲜或冷冻组织的下游大规模平行 RNA 测序。我们包括洗涤剂-机械和低渗-机械组织破坏和细胞裂解选择, 两者都可用于核分离。

单细胞RNA测序是研究细胞转录特征的有力工具，特别是在异质组织中，如中枢神经系统。该协议为单核RNA测序提供了一种分离核的方法。通过使用核代替细胞，此方法可以应用于难以分离的组织以及冷冻组织。

此外，此方法可应用于研究疾病或损伤后细胞类型特异性变化。以鼠标安乐死开始此过程，如文本协议中所述。接下来，沿着身体的长度做一个切口，以暴露内脏。

使用钳子将内器官从体腔中拉出，使小鼠除去。请勿使用纸巾清洁区域或去除器官，因为这可能引入污染物。用剪刀切割L2和L3椎骨之间的椎柱。

要弹出脊髓，请将含有冰冷 PBS 的三毫升注射器与 25 量表 1/4 英寸针头配合使用。将针头尖放入椎柱的圣端。用两根手指捏住椎骨，在针头周围形成紧密的密封，然后按下柱塞，将脊髓松弦弹出。

将脊髓放在带冰冷 PBS 的培养皿中。如果只需要脊髓的腰部部分，修剪掉脊髓的囊和胸部。此时，将组织冻结并储存在零下80摄氏度，或立即用于此处所述的洗涤剂机械细胞解解或文本协议中描述的低度机械解解。

要确定洗涤剂机械细胞解解，请将腰椎脊髓放在预冷的 Dounce 均质器中，并加入 500 微升预冷却洗涤剂解液缓冲液。Dounce 与五笔松散的害虫，A，然后五到十冲程的紧刺，B.避免解除均质剂外解解在两次冲程之间，并避免引入气泡。现在，将 40 微米过滤器放在预冷却的 50 毫升锥形管上，用一毫升低蔗糖缓冲液预湿。

在含有解解缓冲液中粗核的 Dounce 均质器中加入一毫升低蔗糖缓冲液，通过移液轻轻混合两到三次。将粗核准备在40微米过滤器上，放入预冷却的50毫升锥形管中。在 40 微米过滤器上再传递一毫升低蔗糖缓冲液，使最终体积达到低蔗糖缓冲液的三毫升和 500 微升的解液缓冲液。

如果组合多个电源线，请重复这些步骤，在同一锥形管中冷却。然后，在3200次G下将样品离心，在4摄氏度下10分钟。离心完成后，将上经下一个液去。

我们使用三毫升的低蔗糖缓冲液暂停调色板。轻轻旋转以从墙壁上去除颗粒，以方便重新暂停。让样品在冰上坐两分钟后，将悬浮液转移到橡树岭管。

在设置一中使用均质器，在低蔗糖缓冲液中均匀地使核质化 15 至 30 秒，使样品保持在冰上。然后，使用血清移液器将12.5毫升的密度蔗糖缓冲液层分层，在低蔗糖缓冲液均质下，注意不要产生破坏密度层的气泡。在3200倍G下离心管，在4摄氏度下离心20分钟。

离心完成后，立即在轻拂运动中释放上经剂。在尝试此过程时，必须记住立即从离心机中取出橡树岭管，并快速释放上清液。使用100微升至1毫升的再悬浮液，我们挂起留在墙上的核。

避免留在洗涤剂为基础的制剂的梅林皱眉。如果不能快速完成这些步骤，可能导致细胞碎片过多或核素的核制剂，从而阻碍下游单核RNA测序。通过 30 至 35 微米孔径滤滤器过滤核，并收集在预冷却管中。

确定核产量，使用血细胞计在10倍目标下计算核，然后进行单核RNA测序，如文本协议中所述。使用洗涤剂机械解解协议分离的核的亮场和荧光图像以10 x显示。这些核以公正的方式被分离，允许在单个细胞的水平上研究内源性基因表达特征。

这里展示的是一个代表性的单核RNA测序的 tSNE 图，来自小鼠腰椎，使用大规模平行液滴封装平台。从新鲜或冷冻组织分离的核可用于在商业和学术平台上进行测序。这项技术使研究人员能够利用难以分离的组织（如脊髓）甚至冷冻组织（如生物库材料）在单细胞水平上探索转录特征。

在尝试此程序时，减少安乐死和细胞解血之间的时间非常重要。此外，重要的是要尽量减少从细胞裂解到再扩张的解决方案中引入的气泡，并小心购买宠物核。按照此过程，核可用于替代应用，如筋膜排序，以便隔离特定的细胞类型。