阴离子交换剂 (二乙基氨基乙基纤维素柱) 纯化包括非洲在内的细胞外锥虫体
April 6th, 2019
这种从血液中分离锥虫的方法取决于它们的表面电荷比哺乳动物的血细胞更少阴性。受感染的血液被放置在阴离子交换器柱上并进行治疗。这种方法是非洲锥虫病最适合的诊断方法, 为免疫、生物、生化、药物和分子生物学研究提供纯化寄生虫。
非洲锥虫体是造成人类非洲锥虫病，或昏睡病和非洲动物锥虫病的责任人。引起昏睡病的锥虫体是采采蝇，这些寄生虫在撒哈拉以南非洲的许多地理病区存在。寄生虫的检测对于诊断、治疗和随从至关重要。
血清学可以给出假阳性和不幸的阴性结果。为了帮助血液的检测，必须集中锥体。各种寄生虫浓缩技术已被使用。
最敏感的方法是通过一列心安的血管交换器、DEAE纤维素分离出血液中的寄生虫，然后进行离心和微观观察。因此，DEAE纤维素法是最好的，并且至今是一种将寄生虫从血液中可视化和隔离的参考方法，用于人类非洲锥虫病的诊断，特别是在野外条件下。这种方法是非洲锥虫病的最合适诊断方法，也为免疫学、生物、生化、制药和分子生物学研究提供了纯化寄生虫。
所有调查均符合实验室动物护理和使用指南，并已获得法国当局的同意，使用的所有协议均已获得我们当地道德委员会的批准。根据书面协议称出每种物质。加入蒸馏水，用磷酸二氢钾精确调节至pH 8，制成以下缓冲溶液，浓缩磷酸盐缓冲液盐水2X。
加入蒸馏水和葡萄糖，用于磷酸盐缓冲盐水葡萄糖。对于100毫升的洗脱缓冲液，每毫升青霉素加入100个单位，每毫升链霉素100微克，向磷酸盐缓冲盐水葡萄糖添加5微克毫克的酚红色。100克DEAE纤维素首先用三升蒸馏水洗净，然后离开沉淀。
细颗粒被丢弃。洗涤重复，直到上清液是明确的。添加浓缩磷酸盐缓冲盐水2X，搅拌DEAE纤维素。
pH值调整为8，含磷酸钾。然后用蒸馏水洗两次纤维素，用磷酸盐缓冲盐水葡萄糖洗两次。DEAE纤维素和磷酸盐缓冲盐水葡萄糖以相等的体积混合。
合金在室温或四摄氏度或零下 20 摄氏度下四分之一分，以进行长时间储存。锥体感染的血液储存在液氮中。一毫升的合金夸脱在室温下解冻。
使用针头和一毫升注射器从冷冻管中仔细收集寄生虫。解冻寄生虫的可行性由感染前光显微镜观察所可视化的活力评估。寄生虫被注射到两只小鼠的内侧腔中，每只小鼠500微升。
感染后的每一天，寄生虫病都通过用针头从尾巴上收集一滴血，然后通过显微镜检查进行评估。当寄生虫病处于适当水平时，会采集受感染的血液。夹子或支架中支持 10 毫升注射器，并添加预切的滤纸。
准备好的DEAE纤维素倒入注射器，高达8或9毫升的水平。用洗脱缓冲器清洗列。两毫升受感染的血液被小心地放置在柱上，在50毫升离心管中收集在柱状水液中。
根据锥体体传递情况定期添加洗脱缓冲液。通过定期服用一滴列水化，并使用光显微镜观察锥形体，检查锥形体通过柱的传递。当不再在伊卢酸盐中观察到锥形体时，锥形管在1，800次G下离心，在4摄氏度下10分钟。
上清液被丢弃，托盘中的锥体用血细胞计计数。收集的锥体随后被稀释在计划调查所需的介质中。这种方法是非洲锥虫病最合适的诊断方法，为免疫学、生物、生化、制药和分子生物学研究提供了纯化寄生虫。
这些研究之所以得到发展，是因为DEAE纤维素纯化寄生虫很容易从自然或实验感染的宿主，特别是啮齿动物获得大量。通过微观观察评估药物制剂存在的锥度体生存能力。寄生虫的生存能力与运动性相关，因此，可以在光学显微镜下以 40 倍或更高的放大倍率进行眼睛检查。
寄生虫的生存能力通过测量动体形式的百分比进行评估。在模拟处理控制井时，将测试化合物的稀释添加到 96 孔组织培养板的每个孔中。每个浓度以三钙评估。
每次稀释的可行寄生虫数量与控制井中的寄生虫数量进行比较。本图显示了在非洲人类锥虫病治疗中使用的参考药物五溴二胺的影响。锥体巨噬细胞共培养允许在细胞水平上研究宿主寄生虫的相互作用。
在巨噬细胞寄生虫共培养中，额外的细胞锥体会诱导产生巨噬细胞精氨酸酶，水解精氨酸到食肉素。苯胺是多胺和苯丙酮的前体，对寄生虫的存活和生长至关重要。此外，精氨酸的耗竭减少了一氧化氮的产生。
随后，加入一种阿金酶抑制剂S-L-半胱氨酸，以联合培养，显著减少巨噬细胞诱导寄生虫的生长。阿吉娜斯诱导由锥体排泄和/或分泌因子进行调解。这种精氨酸诱导因子已被确定为奥辛基宁。
激酶结合到C型莱金曼尼诺斯结合受体。精氨酸酶被诱导并产生有利于寄生虫生长的食肉素。在巨噬细胞中，用12.5毫摩尔人或巨噬细胞培养的金氨酸不会诱发阿吉娜斯，而巨噬细胞的人类受体已被删除。
使用DAEA纤维素纯化锥体细胞生物学和生化实验的进一步实例在已识别出新的细胞骨骼蛋白（如BILBO1）的研究中得到证明。BILBO1 是重要细胞骨骼结构和寄生虫生存的生物发生所需的。因此，BILBO1 是致病性锥体干预的重要目标。
图中显示了一个显示血液培养形式的免疫浮游标记，用抗BILBO1抗体探测的锥形瘤布鲁西细胞。此外，葡萄糖和曲氨酸代谢已描述使用DEAE纤维素纯化锥体和参与这些过程的酶已经通过实验验证。图中显示了血液形成锥形体中葡萄糖和三元代谢的示意图。
通过心安的核酸交换从血液中纯化非洲锥虫体，DEAE纤维素柱最近有所改进，仍然是锥体检测的黄金标准，不仅在流行地区寄生虫病含量低的自然宿主，而且大量需要寄生虫进行实验研究。研究已经能够识别锥体分子在寄生虫的生存和生长中起着至关重要的作用。已确定的目标可能是未来疫苗的基础，这种疫苗具有对人类和动物的潜在抗原，采用一种健康方法。
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概述
非洲锥虫是人类和动物非洲锥虫病的致病原，由蠅傳染。在血液中准确检测这些寄生虫对诊断和治疗至关重要，需要浓缩技术才能有效识别。
关键研究组成部分
科学领域
- 寄生虫学
- 传染病
- 诊断方法
背景
- 非洲锥虫病，也称为昏睡病，是撒哈拉以南非洲的一个重大健康问题。
- 血清学测试可能会产生假阳性和假阴性结果，使诊断复杂化。
- 血液中锥虫的浓缩对于准确检测至关重要。
- 存在各种浓缩这些寄生虫的技术。
研究目的
- 改进血液样本中检测非洲锥虫的诊断方法。
- 提供纯化的寄生虫用于进一步的生物学和医学研究。
- 增强对锥虫病及其对健康影响的理解。
使用的方法
- 利用阴离子交换柱根据表面电荷分离锥虫。
- 应用浓缩技术以促进寄生虫检测。
- 评估该方法在提供纯化样本方面的有效性。
- 评估该方法对各种生物学研究的适用性。
主要结果
- 阴离子交换柱有效地将锥虫与哺乳动物血细胞分离。
- 该方法产生适合免疫学和生化研究的纯化寄生虫。
- 结果表明诊断非洲锥虫病的准确性得到提高。
- 该技术适用于各种研究领域，包括分子生物学。
结论
- 该开发的方法是非洲锥虫病的可靠诊断工具。
- 它为进一步研究锥虫的生物学奠定了基础。
- 未来的研究可以在此方法的基础上提高诊断准确性和治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate detection of African trypanosomes in blood is essential for diagnosis and treatment of human African trypanosomiasis, particularly in field conditions where parasitemia is low. The DEAE cellulose anion-exchange method provides a sensitive, rapid purification technique that enables reliable parasite isolation for downstream immunological, biochemical, and pharmaceutical investigations. This supports target validation and mechanistic de-risking in antiparasitic drug discovery by supplying viable parasites for in vitro screening and mechanism-of-action studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing purified, viable trypanosomes for assessing drug effects on parasite motility and survival.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized parasite preparation for consistent in vitro assays.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by allowing quantitative assessment of compound effects on parasite viability in dose-response formats.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows, including drug testing in 96-well plate formats with triplicate assessments.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through consistent parasite purification and viability measurement via motility.
- Scalability: Enables production of large parasite quantities from infected hosts, supporting high-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by maintaining parasite infectivity and enabling co-culture studies with host cells to investigate mechanisms like macrophage arginase induction.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by providing parasites for mechanism studies involving cytoskeletal proteins (e.g., BILBO1) and metabolic pathways.
- Mechanistic De-risking: Allows investigation of gene deletion, mutation, or overexpression effects on parasite survival, supporting target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical mechanistic studies, enabling parasite supply for assays that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing parasites for studying host-parasite interactions, such as arginase-mediated survival mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible parasite purification compatible with microscopic viability readouts.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., percentage of motile parasites) enabling comparison across test compound dilutions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via studies on cytoskeletal biogenesis and metabolic pathways essential for parasite survival.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for generating parasites across multiple investigative contexts, from immunology to molecular biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in parasite survival pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of parasite supply for multi-assay platforms.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antiparasitic programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable preclinical efficacy data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in parasitology and column chromatography techniques for proper DEAE cellulose preparation and pH adjustment.
- Depends on instrumentation including centrifuges, hemocytometers, and light microscopes for parasite collection and viability assessment.
- Necessitates cross-team standardization of buffer preparation, elution protocols, and infection models to ensure consistency.
- Involves adaptation considerations across host species and trypanosome strains, as chromatography conditions must be optimized per system.
- Practical limitations include dependency on infected host availability and the need for timely processing to maintain parasite viability.
