利用基于荧光素酶的大型肿瘤抑制因子（LATS）生物传感器监测Hippo信号通路活性

我们的实验室一直在研究Hippo信号通路在乳腺癌和肺癌中的作用，最近我们开发了一种新型生物传感器，用于监测Hippo信号活性。该方法可用于解答有关细胞信号网络的关键问题，例如Hippo通路如何响应外界因素，以及它如何与其他信号通路相互作用。与现有方法相比，该技术的主要优势在于其高度的灵敏性，同时能够快速、高通量地并行处理大量样本。

该技术在基础研究和转化研究中具有广泛的应用，可用于在体外和体内研究Hippo信号通路的调控因子。首先，从DH5-Alpha菌液培养物中新鲜制备LATS-BS质粒的小量提取物。转染前一小时，吸去培养板中的培养基，每孔加入500微升生长培养基。

一个重要的注意事项是，LATS 生物传感器必须新鲜配制，以获得最大表达量和活性。此外，在进行荧光素酶检测时，建议始终使用 Hippo 通路的上游调节因子（如 MSD）作为阳性对照。此后，将细胞放回培养箱中继续培养。

接下来，按照文本方案中的说明，配制溶液A（DNA溶液）和溶液B（稀释的聚合物转染试剂）。随后立即将溶液B加入溶液A中，并轻轻吹打混匀。室温孵育样品15分钟，以使转染复合物形成。

然后将转染复合物的总体积逐滴加入至培养板的每孔中，同时轻轻摇晃。将细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，移除含有转染复合物的培养基，并更换为新鲜的完全培养基。

然后将细胞在 37 摄氏度下继续培养一天。用蒸馏水将适量的 5 倍被动裂解缓冲液稀释。接着，彻底吸除培养板中的培养基。

向每个孔中加入1毫升PBS，轻轻摇晃培养板以去除脱落的细胞和残留的生长培养基。然后完全吸除PBS。接着，向每个孔中加入250微升1xPLB。

将培养板置于摇床上，摇动15分钟，以确保裂解缓冲液（PLB）均匀覆盖细胞单层。随后，将裂解液转移至1.5毫升微量离心管中。从-80摄氏度保存条件下取出LAR-2，并将其平衡至室温。

然后，根据所需检测的数量配制适量的海肾荧光素酶检测试剂。将海肾荧光素酶检测试剂加入50倍底物及其缓冲液中。接着，将每种细胞裂解液各10微升分装至1.5毫升离心管中。

然后，设置化学发光仪执行2秒的预测量延迟，随后进行10秒的测量周期。小心地将20微升LAR-2试剂转移至一个试管中，并迅速上下吹打混匀。随后立即把试管放入化学发光仪中并启动读数。

读数后，从发光仪中取出样品管，加入20微升Renilla试剂，用移液器吹打混匀。然后将样品放入发光仪中，开始下一次读数。首先，按照文本方案中所述的方法培养、消化、计数并接种HEK293 Ad-细胞。

然后，在转染前一小时，吸去培养板中的培养基，并加入五毫升新鲜的完全生长培养基。最后，将稀释后的溶液B加入溶液A中，用移液器吹打混匀。随后，将样品在室温下孵育15分钟，再将转染复合物的总体积加入培养板中，轻轻摇晃混匀。

将细胞在37摄氏度下孵育过夜。次日，用胰蛋白酶消化并计数细胞。每孔加入10,000至20,000个细胞至96孔板中，每孔培养基总体积为100微升。

此后，将细胞再培养一天。在进行荧光素酶检测前1至4小时，加入可能调控Hippo通路的试剂，每孔终浓度为10微摩尔。接着，完全吸除细胞中的培养基，并用100微升PBS洗涤每孔细胞。

然后，向每孔加入 20 µL PLB。将培养板置于摇床上，振荡 15 分钟。接着，向板的每孔转移 20 µL LAR-2 试剂，并用移液器吹打混匀。

此后立即把培养板放入酶标仪中并开始检测。在本方案的第一部分，LATS-BS 与不同基因共转染，以评估这些基因对 LATS 激酶活性的影响。在第二部分方案中，将 LATS-BS 转染至 HEK293-Ad 细胞，并将细胞接种于 96 孔板中。

转染40小时后，用不同的已知Hippo信号通路小分子调节剂处理细胞，随后进行荧光素酶检测。在解读这些检测结果时应注意，蛋白质和药物处理可能激活影响生物传感器活性的反馈通路。需要进一步实验来验证候选分子与Hippo信号通路之间的关系。

在完成该实验步骤后，可采用其他方法（如定量实时 PCR 或蛋白质印迹）来进一步探究 LATS 激酶活性的相关问题。该技术建立后，为癌症生物学领域的研究人员探索 LATS 激酶及 Hippo 信号通路在多种生物与生化过程中的动态变化和活性提供了重要途径。请注意，用于筛选的药物可能具有极高危险性，在执行本实验时务必始终采取适当的防护措施。