Name: 预组装塑料微流体芯片在原生小鼠神经元分割中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 了解预组装塑料微流控芯片技术，用于原代大鼠海马神经元的分区培养与高分辨率成像。该方法支持轴突发育、突触重塑及神经损伤后再生研究，为神经科学提供稳定可靠的实验平台。

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作者感谢 Taylor Wilt（Xona）、Smita Paranjape（UNC-Chapel Hill）、Joyce Ciechanowski（Xona）和 Brad Taylor（Xona）提供的技术或编辑协助。本研究得到 Xona Microfluidics, LLC 和美国国家心理健康研究所（R42 MH097377）的资助。成像工作部分由美国国家神经疾病与卒中研究所中心资助项目 P30 NS045892 和美国国家儿童健康与人类发育研究所中心资助项目（U54 HD079124）的共聚焦与多光子成像核心设施支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

注意：塑料多室芯片的示意图见图1A、B。该芯片大小与标准显微镜载玻片相同（75 mm × 25 mm）。芯片的结构特征，包括主通道或室、孔穴以及微沟槽均已标注，以供后续参考。图1C 为芯片照片，展示了各室之间的流体隔离效果。
1. 多区室芯片的制备与包被
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将芯片放入培养皿或其他合适的无菌容器内。</li>
	<li>向芯片的左上孔加入 100 µL 预包被液，使其流经主通道进入相邻孔。 
	注意：预包被液用于预先包被微流控通道，以避免芯片内产生气泡。</li>
	<li>向左下孔加入 100 µL 预包被液。静置 5 分钟，使溶液流经微沟槽。</li>
	<li>向右上孔加入 100 µL 预包被液，使其流经主通道进入相邻孔。向右下孔加入 100 µL 预包被液。</li>
	<li>从各孔中吸除溶液。吸液时将移液器吸头朝向远离主通道的方向，以避免吸走主通道中的液体（图 2A）。立即向左上孔加入 150 µL 磷酸盐缓冲液（PBS），静置 1.5 分钟。 
	注意：切勿将封闭的主通道中的液体完全吸除。</li>
	<li>向左下孔加入 150 µL PBS。静置 5 分钟，使液体流经微沟槽。向右上孔加入 150 µL PBS。向右下孔加入 150 µL PBS。静置 10 分钟。</li>
	<li>重复步骤 1.5–1.6，进行第二次 PBS 洗涤。</li>
	<li>在组织培养显微镜下检查芯片主通道中是否存在气泡。若存在气泡，则执行以下操作；若无气泡，则跳至步骤 1.9。
	<ol>
		<li>吸除各孔中的 PBS，移液器吸头应朝向远离通道开口的方向（图 2A）。</li>
		<li>将 100 µL 预包被液加入上孔，移液器吸头应靠近通道开口方向倾斜加入（图 2B）。气泡应随液体移动至下孔。静置 1.5 分钟。</li>
		<li>重复步骤 1.3–1.8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除各孔中的 PBS，移液器吸头朝向远离通道开口的方向（图 2A）。</li>
	<li>向芯片左上孔加入 100 µL 浓度为 0.5 mg/mL 的多聚左旋赖氨酸（PDL）。静置 1.5 分钟。向左下孔加入 100 µL PDL。</li>
	<li>向芯片右上孔加入 100 µL PDL。静置 1.5 分钟。向右下孔加入 100 µL PDL。</li>
	<li>盖上培养皿&#160;，并将芯片置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>重复 PBS 洗涤步骤 1.5–1.6 两次，以去除多余的 PDL。</li>
	<li>从装置中吸除 PBS。</li>
	<li>立即向芯片左上孔加入 100 µL 细胞培养基。静置 1.5 分钟。向左下孔加入培养基。向右上孔加入培养基。静置 1.5 分钟。向右下孔加入 100 µL 培养基。</li>
	<li>将芯片置于 37°C 培养箱中，待细胞接种时取出使用。</li>
</ol>
2. 将神经元接种至多区室芯片中
<ol>
	<li>根据已建立的方案21,22制备解离的大鼠海马神经元细胞悬液，使细胞密度约为 ~12 × 106 个/mL。 
	注意：可使用细胞悬液密度在 3 至 12 × 106 个/mL 范围内的条件。若使用较低密度，可增加加入芯片的细胞悬液体积（见下文）。下述步骤适用于小鼠解离的皮层或海马神经元。其他类型神经元的最佳细胞密度可能有所不同。</li>
	<li>移除芯片各孔中的大部分培养基，每孔保留约 5 µL。抽吸时应远离主通道，以避免抽走主通道中的液体（图 2A）。 
	警告：切勿从封闭的主通道中抽吸液体。若从主通道抽吸，可能导致气泡滞留在芯片内。</li>
	<li>在右上孔中加入 5 µL 细胞悬液，同时在右下孔中加入另外 5 µL 细胞悬液（总计约 120,000 个细胞）。加样时应靠近主通道进行滴加（图 2B）。在显微镜下检查，确保神经元已进入主通道。静置 5 分钟，使细胞贴附。 
	注意：神经元可被加载至任一腔室。为便于说明，本实验将右侧主通道定义为胞体腔室，但任一腔室均可作为胞体腔室使用。每芯片使用低至 60,000 个细胞的较低细胞密度亦可行。可向胞体腔室的每个孔中最多加入 10 µL 细胞悬液，同时使用比上述描述细胞数更少的细胞悬液。</li>
	<li>向右上和右下孔各加入约 150 µL 神经元培养基，随后向左上和左下孔各加入 150 µL 培养基。将芯片置于加湿托盘中，放入 5% CO2、37 °C 的培养箱内。</li>
	<li>24 小时后，通过从各孔中移除培养基进行换液。确保主通道始终保持充满状态。先向每个上孔加入 150 µL 新鲜培养基，再填充下孔。</li>
	<li>将芯片放回培养箱中继续培养所需天数。 
	注意：每隔几天应观察一次培养基颜色，确保其保持浅粉红色。若培养基变为黄褐色，应更换 50% 的新鲜培养基。若液体量减少，需确保环境具有足够的湿度，并对芯片采取适当的二次封闭措施以防止蒸发。通过使用二次封闭装置和/或用聚四氟乙烯（PTFE）-FEP 膜覆盖含芯片的培养皿，可减少甚至完全避免换液操作。</li>
</ol>
3. 芯片内神经元的逆行标记
注意：逆行标记可通过多种技术实现，包括使用修饰的霍乱毒素和狂犬病毒。以下为使用G基因缺失型狂犬病毒-mCherry或-eGFP标记神经元的操作步骤。请根据当地机构的指南处理潜在感染性材料。可能需要接受额外培训。
<ol>
	<li>将新鲜的神经元培养基预热至 37 °C。每个芯片大约需要 400 µL 培养基。</li>
	<li>使用来自轴突室任一孔中的培养基，将 100,000 个病毒单位的改造狂犬病毒稀释至总体积为 50 µL。 
	注意：与病毒接触过的枪头和离心管应按照机构批准的规程进行处理。</li>
	<li>轻柔地用移液器吸出轴突室孔中剩余的培养基，并将其储存在离心管中，置于 37 °C 环境下。</li>
	<li>向轴突室中加入 150 µL 新鲜预热的培养基和 50 µL 稀释后的病毒。在 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。</li>
	<li>移除含有病毒的培养基，并妥善处理。 
	注意：若从主通道中抽吸液体，芯片内可能滞留气泡。</li>
	<li>向其中一个轴突孔中轻柔加入 75 µL 新鲜培养基，使其自然流至另一轴突孔。</li>
	<li>从第二个轴突孔中移除流出液，并妥善处理。</li>
	<li>重复步骤 3.6 和 3.7 一次。</li>
	<li>将之前储存的培养基重新加回轴突室。如有必要，额外补充约 50 µL 新鲜培养基以维持足够的液体体积，并将细胞放回培养箱。 
	注意：荧光蛋白表达在 48 小时内可见，并可持续长达 8 天。神经元可在神经元培养基中于室温下成像长达 30 分钟。也可将培养基替换为含 B27 的预温、不含 CO2 的 Hibernate E 培养基，以支持更长时间的成像。此外，神经元也可在 37 °C、5% CO2 的高湿度环境培养室中进行成像。在此情况下，充分的加湿至关重要，可最大限度减少芯片内的蒸发损失，而蒸发在加热条件下会加剧，并可能影响神经元的健康状态。</li>
</ol>
4. 芯片内轴突区室的流体隔离
<ol>
	<li>从轴突区的左下孔中移除 20 µL 培养基，并转移至胞体区的右上孔中。等待 2 分钟，使每个通道内的液体流动达到平衡。</li>
	<li>从轴突区中移除 50 µL 培养基。向该培养基中加入 0.3 µL 的 1 mM Alexa Fluor 488 肼，通过移液器混匀后，再将混合液返回至轴突区。芯片现已准备好用于成像。 
	注意：可添加其他感兴趣的化合物。建议添加与目标化合物分子量相近的荧光染料，以便随时间监测流体隔离情况。</li>
</ol>
5. 在芯片内进行轴突切断
<ol>
	<li>从轴突室中移除培养基，移液时将移液管尖远离主通道的入口（图2A），并将培养基储存于离心管中。</li>
	<li>完全吸除轴突室中的液体，将吸液管置于轴突室主通道的任一入口附近（图2B），持续抽吸1-2分钟，确保室内溶液被彻底清除。 
	注意：轴切断操作中，抽吸的真空压力必须至少达到18英寸汞柱（inch-Hg），以确保操作有效。</li>
	<li>用之前储存的培养基重新填充轴突室，并在显微镜下观察芯片，确认轴突已被&#160;切断。 
	注意：若更换培养基时轴突室内产生气泡，请重复步骤5.1-5.2。</li>
	<li>将芯片放回培养箱中。</li>
</ol>
6. 芯片内的荧光免疫染色
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 4% 多聚甲醛固定液（4% 多聚甲醛，1 µM MgCl2，0.1 µm CaCl2，120 mM 蔗糖）</li>
	<li>吸除芯片孔中大部分培养基（切勿使内部隔室干燥）。</li>
	<li>立即向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 100 µL 固定液。</li>
	<li>1 分钟后，向底部孔中加入 100 µL 固定液。室温下固定 30 分钟。</li>
	<li>吸除芯片孔中大部分液体（切勿使内部隔室干燥）。立即向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 150 µL PBS。静置 2 分钟，使 PBS 流入底部孔中。</li>
	<li>重复步骤 6.5 两次。</li>
	<li>吸除芯片孔中大部分 PBS，立即向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 150 µL 含 0.25% TritonX-100 的 PBS。静置 15 分钟。</li>
	<li>吸除芯片孔中大部分液体，立即向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 150 µL 封闭液（含 10% 正常山羊血清的 PBS）。静置 15 分钟。 
	注意：封闭液应根据二抗种类选择，e.g.，若使用驴抗绵羊二抗，则封闭液中应使用驴血清。</li>
	<li>吸除芯片孔中大部分液体，立即向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 100 µL 用含 1% 正常山羊血清的 PBS 稀释的一抗（或多种一抗）。覆盖以减少蒸发，室温孵育 1 小时或 4 °C 过夜。</li>
	<li>吸除芯片孔中大部分液体（切勿使内部隔室干燥）。立即向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 150 µL PBS。静置 5 分钟，使 PBS 流入底部孔中。</li>
	<li>重复步骤 6.10 两次。</li>
	<li>吸除芯片孔中大部分液体，立即向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 100 µL 用 PBS 稀释的二抗（或多种二抗）。覆盖以减少蒸发，室温孵育 1 小时。 
	注意：请参照二抗产品说明书推荐的稀释比例进行稀释。</li>
	<li>重复步骤 6.10–6.11。</li>
	<li>若在免疫染色后 1 天内进行成像，需保持芯片孔内充满 PBS。若芯片需保存超过 1 天再成像，应将含芯片的培养皿用封口膜包裹以防止蒸发，并于 4 °C 保存至成像前。</li>
	<li>如需长期保存样本，可使用封片剂（e.g.，Fluoromount-G）。
	<ol>
		<li>吸除芯片孔中大部分液体。使用 1 mL 一次性塑料移液管，向轴突和胞体隔室的上层孔中各加入 2 滴封片剂。</li>
		<li>倾斜芯片以促进封片剂流经通道。5 分钟后向底部孔中各加入 2 滴封片剂。静置 1 小时后即可成像。 
		注意：使用封片剂后，无法再次对其他靶标进行重新检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

A.M.T. 是微流控腔室/芯片（美国专利 7419822 B2）的发明人，并且是 Xona Microfluidics, LLC 的成员。V.P. 是 Xona Microfluidics, LLC 的员工。J.H. 是 Xona Microfluidics, LLC 的成员。T.N. 声明不存在竞争性财务利益。&#160;本文的开放获取出版由 Xona Microfluidics 资助。

塑料多室芯片为神经元的分隔培养提供了简便的方案，可实现长期神经元培养（&gt;3周）。本方案详细介绍了如何在这些芯片中培养小鼠皮层和海马神经元。同时讨论了可溶性微环境的建立、神经元逆行标记、轴突切断以及免疫细胞化学染色的操作方法。重要的是，这些芯片适用于高分辨率成像、荧光成像和活细胞成像。
塑料多室芯片提供了与基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的分隔装置相似的多种功能，但具有其独特的优缺点和特征。表1对塑料芯片和基于PDMS的装置的特性进行了比较。首先，这些芯片为预组装结构，并永久具有亲水性，有利于润湿，使其更易于使用。与PDMS不同，塑料材料不具有透气性，因此如果通道内意外形成气泡，气泡无法轻易逸出，必须手动清除。一种主要含有乙醇及其他一些专有成分的预包被溶液可有效消除气泡的形成。
在芯片内对转导荧光蛋白后的投射结构进行活体成像（图4），未检测到塑料材料的自发荧光。需要注意的是，芯片配合高数值孔径物镜使用时，浸油必须基于硅油，而不能使用矿物油；矿物油可能与环烯烃共聚物发生不良反应。进行明场成像时需注意，芯片中的微沟槽末端呈圆弧形，且主通道在Z方向朝微沟槽屏障处逐渐变细，导致明场成像过程中微沟槽两端出现一定程度的光线折射（图3）。由于芯片为预组装结构，抗体向微米级微沟槽内的渗透可能不均匀（类似于永久键合的PDMS器件），因此免疫染色后的定量分析应在通道或区室中进行。通过在不同区室之间建立体积差，促进抗体和荧光染料流入微沟槽，可改善微沟槽内神经元投射的免疫染色效果。

传统的神经元培养方法会导致轴突和树突随机生长，从而无法研究神经元独特的极性形态。在过去10至15年中，微加工多区室装置已成为神经科学家广泛认可和使用的研究工具（部分高影响力出版物已引用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17）。这些装置可将神经元进行区室化分离，并提供一种物理和化学手段，用于操控神经元的亚细胞区域，包括胞体、树突、轴突和突触18,19。此外，它们还实现了许多在随机培养体系中无法完成的实验范式，例如轴突运输、轴突内蛋白质合成、轴突损伤与再生以及轴突向胞体的信号传递研究。基本的双区室结构由两条平行的微流控通道组成，中间通过一系列较小的垂直微沟槽相连。将原代神经元或干细胞来源的神经元接种至其中一条微流控通道中，细胞会沉降并贴附在装置底部表面，并在数天内延伸出神经突。许多生长锥会进入微沟槽，而这些沟槽尺寸足够小，可阻止细胞体进入。由于生长锥在微沟槽内受到物理限制且无法调转方向，因此只能沿直线生长进入相邻的区室（即轴突区室），从而实现轴突的隔离。
传统上，这些装置是通过光刻法制备的母模，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇铸成型，可由研究人员在实验室自行制备，也可直接购买商用产品。使用PDMS的主要缺点之一是其疏水性20。虽然PDMS可暂时变为亲水性，但在非水环境中数小时内会迅速恢复疏水性20。因此，这些装置在使用时必须固定在玻璃盖玻片或其他合适的基底上。目前已有商用的预组装塑料多腔室芯片（例如，XonaChips），采用注塑成型塑料制造。这些芯片具有永久亲水性，简化了装置的润湿过程，并允许芯片在底部通过一层环烯烃共聚物（COC）薄膜预先封装微流控通道。这些芯片由光学透明塑料制成，适用于高分辨率荧光成像。
本实验方案旨在演示使用预组装的塑料微流控芯片进行多种实验范式，适用于小鼠海马或皮层神经元。本方案描述了如何在芯片内利用改良的狂犬病毒对神经元进行逆行标记。同时介绍了用于轴突损伤与再生研究的轴突切断操作。最后，本方案展示了如何利用该装置进行荧光免疫染色。

<table><tbody><tr><td>XonaChip</td><td>Xona Microfluidics, LLC</td><td>XC150</td><td>150 &amp;micro;微沟槽屏障，长度为 m</td></tr><tr><td></td><td>Xona Microfluidics, LLC</td><td>XC450</td><td>450 &amp;micro;微沟槽屏障，长度为 m</td></tr><tr><td></td><td>Xona Microfluidics, LLC</td><td>XC900</td><td>900 &amp;micro;微沟槽屏障，长度为 m</td></tr><tr><td>XC预包被&amp;nbsp;</td><td>Xona Microfluidics, LLC</td><td>XC预包被</td><td>随 XonaChips 提供</td></tr><tr><td>XonaPDL&amp;nbsp;</td><td>Xona Microfluidics, LLC</td><td>XonaPDL</td><td></td></tr><tr><td>E17/E18期定时妊娠的Sprague Dawley大鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>24100564</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;神经元培养基&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 神经基础培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus 增强补充剂（50倍）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>-谷氨酰胺补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>- 抗生素-抗真菌素（100倍浓度）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>氟化乙烯丙烯薄膜</td><td>American Durafilm</td><td>50A</td><td>0.5 mil 厚度</td></tr><tr><td>改良型狂犬病病毒</td><td>索尔克生物研究所</td><td>缺失G蛋白的狂犬病毒-eGFP</td><td>需要材料转让协议</td></tr><tr><td></td><td>索尔克生物研究所</td><td>缺失G蛋白的狂犬病毒-mCherry</td><td>需要材料转让协议</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 肼 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A10436</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095D5X SIGMA</td><td>5.75 英寸长度</td></tr><tr><td>hibernate-E 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% 甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>PBS（10倍浓缩液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>QVC0508</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28314</td><td></td></tr><tr><td>抗vGlut1抗体</td><td>NeuroMab</td><td>75-066</td><td>克隆 N28/9，1:100</td></tr><tr><td>抗vGAT抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 003</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>抗β-微管蛋白III</td><td>鸟纲</td><td>TUJ</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>1:1000</td></tr><tr><td>培养箱，5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 37 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>落射荧光成像系统</td><td>EVOS 荧光成像系统</td><td>AMF4300</td><td>10倍物镜</td></tr><tr><td>转盘共聚焦成像系统</td><td>Andor Technology</td><td>CSU-X1，iXon X3 EMCCD</td><td>60x 硅油 &amp;和 20倍物镜</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦成像系统</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>30x 硅油物镜</td></tr></tbody></table>

使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

用于神经元区室化培养的微加工技术已成为许多神经科学家必不可少的工具。本方案描述了如何使用一种 commercially available 的预组装塑料芯片，对培养的大鼠原代海马神经元进行区室化分离。这些塑料芯片的尺寸与标准显微镜载玻片一致，适用于高分辨率、活细胞及荧光成像。本方案演示了如何通过分离的轴突利用编码荧光蛋白的改良型狂犬病毒对神经元进行逆向标记，如何在一个区室内建立独立的微环境，以及如何在芯片上进行轴突切断（axotomy）和免疫细胞化学染色。神经元可在该塑料芯片中培养超过&gt;3周，表明此类芯片适用于长期神经元培养。

神经元在芯片内生长约 5-7 天后，可明显观察到轴突生长。如图 3所示，芯片适用于相差成像，该图展示了神经元在 24 天时的生长情况。芯片也适用于荧光成像（图 4、图 5、图 6 和 图 7）。通过轴突室感染狂犬病毒三天后，在芯片中对轴突延伸至轴突室的 mCherry 阳性神经元进行了成像（图 4）。为证明芯片可实现流体隔离各室的能力，将一种低分子量荧光染料（Alexa Fluor 488 hydrazide）加入轴突室。这些结果与基于 PDMS 的室装置17相当，表明该塑料芯片适用于相差成像和荧光成像。
为了展示在塑料芯片和PDMS装置中神经元的生长情况，我们在两种平台上培养了神经元，并随时间监测其生长过程。图5显示了培养3至22天期间的神经元生长，这些结果代表了3次独立实验。在培养15天内，两种平台中的神经元生长情况相似；但在更长的培养时间（>21天）下，塑料芯片中的孤立轴突表现出更健康的形态，串珠样变性更少（图5A）。为了进一步可视化轴突室内的轴突，我们对β-tubulin III进行了免疫染色，结果显示在培养22天时，塑料芯片内轴突生长状态良好（图5B）。
使用微流控分隔装置进行轴突损伤与再生研究十分常见。为验证芯片适用于此类研究，本实验对逆行标记的神经元在轴切前和轴切后24小时进行了成像（图6）。轴切后可见回缩膨大和再生轴突。这些结果与使用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置发表的数据相当14,17。
免疫细胞化学是一种在多室装置中常用的可视化蛋白定位的技术。培养24天后，对芯片中的神经元进行固定，并分别针对兴奋性和抑制性突触标志物vGlut1和vGat进行染色（图7）。同时对逆向标记的mCherry神经元进行了成像（图7C）。使用60×硅油浸没物镜的转盘共聚焦显微镜进行成像，证明了该系统可实现高分辨率成像。重要的是，在放大区域中可清晰观察到树突棘，表明芯片中培养的神经元形成了成熟的突触。
<img alt="用于细胞培养的微流控装置示意图，显示上下小室及微沟槽屏障。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：一种预组装的塑料双区微流控芯片，用于神经元的区室化培养。 (A) 多区室芯片的示意图，显示上、下小室的位置。 (B) 芯片的放大示意图，显示主通道（或区室）以及连接各区室的微沟槽。主通道尺寸约为 1.5 mm × 7 mm × 0.060 mm（宽 × 长 × 高）。微沟槽的宽度和高度分别约为 0.01 mm × 0.005 mm。微沟槽的长度根据配置不同而变化，范围为 0.15 mm 至 0.9 mm。 (C) 一个典型的多区室芯片照片，其中各主通道或区室内含有食用染料，用以展示各通道之间可实现流体隔离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于细胞培养分析的微流控装置示意图，展示注射方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用塑料多室芯片时所需的移液技术。（A）在添加或吸取洗涤液时，移液枪头应如图所示朝主通道入口相反方向倾斜。（B）在接种神经元或进行轴突切断操作时，移液枪头应朝向主通道入口方向倾斜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像中显示具有微沟槽的轴突和胞体神经元区室；比例尺 150 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：培养 24 天后芯片内典型神经元生长的相差显微图像。 将胚胎海马神经元接种至右侧胞体区室中。在接种后第 5–7 天，可在轴突区室中观察到轴突生长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微阵列中的神经元生长；荧光显微图像；红色神经元；100 µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：逆行标记的神经元表达 mCherry 荧光蛋白，并将轴突延伸至流体隔离的轴突区。(A) 融合荧光显微图像，显示通过改良的 mCherry 狂犬病毒短暂作用于轴突区后实现的活体逆行标记神经元。神经元在培养第21天、感染后第3天成像。通过施加低分子量染料 Alexa Fluor 488 肼，证明了在轴突区内创建隔离微环境的可行性。(B) (A) 的融合图像，包含微分干涉差（DIC）图像，用于观察芯片的微沟槽区域。图像使用30×/1.05 数值孔径硅油（ne = 1.406）物镜的激光扫描共聚焦显微镜采集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PDMS装置与塑料芯片比较；神经元随时间生长的显微镜图像，β-tubulin标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：多区室PDMS装置与塑料芯片内神经元生长的并列比较。（A）两种平台在培养第3、7、15和22天时拍摄的相差显微图像。在底部，展示了第22天图像中的高倍放大区域，以说明在此时间点两种平台上轴突的生长情况。在该时间点，芯片内的轴突连续性更好，且外观比PDMS装置中的更健康。（B） 培养第22天时，对PDMS装置和塑料芯片的轴突区中β-tubulin III染色的轴突进行倒置免疫荧光显微成像。图像使用20倍/0.45数值孔径物镜的转盘共聚焦成像系统采集。所有比例尺均为100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元极性示意图，带有微沟槽屏障；轴突生长分析，显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：塑料多区室芯片内海马神经元的轴突切断与再生。（上图）使用改良的mCherry狂犬病毒对神经元进行逆行标记，然后在培养第24天进行轴突切断前成像。图像使用“Fire”颜色查找表进行伪彩处理。（下图）上图中同一神经元在轴突切断后24小时的成像结果。白色虚线显示微沟槽屏障的边缘。轴突切断发生在左侧虚线位置。白色箭头指示回缩膨大（retraction bulb）。白色箭头指示正在再生的轴突。图像使用转盘共聚焦成像系统采集，物镜为20×/0.45 N.A。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞结构和蛋白质定位的神经元荧光显微图像，示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：海马神经元在塑料多区室芯片内培养后形成突触。 在培养24天后进行免疫染色，并使用60×硅油浸没镜头在胞体区室内成像。神经元表达 (A) 兴奋性突触标志物vGlut1（绿色）和 (B) 抑制性突触标志物vGAT（蓝色）。(C) 通过将改造的狂犬病毒施加于轴突区室，使逆行标记的mCherry神经元（红色）被感染。(D) vGlut1、vGAT和mCherry的合并荧光显微图像。(E) (D) 中白色框标示的放大区域，显示树突棘，即接收来自其他神经元突触输入的部位。图像使用配备60×/1.3 N.A. 硅油（ne = 1.406）物镜的转盘共聚焦成像系统采集。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>塑料多区室芯片</td>
			<td>PDMS多区室装置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分离轴突</td>
			<td>分离轴突</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>建立微环境</td>
			<td>建立微环境</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>轴突切断神经元</td>
			<td>轴突切断神经元</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光学透明</td>
			<td>光学透明</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>适用于高分辨率成像</td>
			<td>适用于高分辨率成像</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>兼容荧光显微镜</td>
			<td>兼容荧光显微镜</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>完全组装好</td>
			<td>需将装置组装至基底</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>健康轴突 >21 天</td>
			<td>健康轴突 >14 天</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>亲水性培养表面</td>
			<td>疏水性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>气体不透过</td>
			<td>气体可透过</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>圆形微沟槽和通道</td>
			<td>直线型微沟槽</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>制备步骤较少</td>
			<td>顶部可拆卸，便于在微沟槽内染色</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>不兼容激光消融</td>
			<td>吸收小分子和有机溶剂</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>不兼容矿物油基浸油（硅油基浸油无影响）</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于神经元培养的塑料与PDMS多区室平台的比较。

本方案描述了使用塑料芯片培养和分隔原代小鼠神经元的方法。这些芯片为预组装设计，操作简便，且适用于高分辨率、活细胞及荧光成像。本方案详细说明了如何在这些芯片中接种大鼠海马神经元，并进行流体隔离、轴突切断和免疫染色操作。

用于神经元区室化培养的微加工技术已成为众多神经科学家的重要工具。本方案描述了一种……的使用方法。

用于分离神经元的微流控装置已成为神经科学领域的标准工具，使研究人员能够对神经元的亚细胞区域（包括胞体、轴突、树突和突触）进行物理和化学操控。这些分区培养装置有助于回答神经科学领域的诸多问题，例如：在发育过程中轴突如何延伸以形成突触，轴突损伤后突触如何重塑和重建，以及在阿尔茨海默病等疾病中病理状态如何通过突触跨突触传播。本方案描述了使用预组装的塑料多腔芯片对原代大鼠神经元进行分区培养的方法。使用这些芯片的主要优势在于，它们提供了一种易于使用且高度可重复的神经元分区方法。另一优势是，与以往基于硅的分区装置相比，这些芯片能够实现更健康、更长期的神经元及分离轴突的生长，同时同样适用于高分辨率显微镜观察。其他模型系统，包括人源干细胞，也可在预组装的分区芯片中进行培养。首先，将一个无菌的多室芯片放入培养皿中。向芯片的左上孔加入100微升预编码溶液，并使其流经主通道进入相邻的孔。接着，向芯片的左下孔加入100微升预编码溶液。这一次，等待五分钟，使溶液流经微通道。现在，向右上方的孔中加入 100 微升预编码溶液，并使其流经主通道进入相邻的孔。90 秒后，用 100 微升预编码溶液填充右下方的孔，并将芯片孵育 10 分钟。将移液器吸头小心地倾斜，远离主通道，从每个孔中吸取溶液。然后，立即向左上方的孔中加入 150 µL PBS，并等待 1.5 分钟。接着，向左下方的孔中加入 150 µL PBS，并等待 5 分钟，使液体流经微沟槽。然后，按顺序向右上和右下孔中各加入 150 微升 PBS。10 分钟后，再次吸除 PBS，并重复洗涤步骤第二次。第二次洗涤后，如前所述，将移液枪头倾斜，避开通道开口，从孔中吸除 PBS。然后，向芯片的左上孔中加入 100 µL 的 0.5 混合每千分之一聚-D-赖氨酸溶液。等待一分半钟后，用 100 µL 聚-D-赖氨酸溶液填充左下孔。在芯片的右侧部分重复此操作。关闭培养皿，然后将芯片置于37摄氏度的培养箱中孵育1小时。孵育结束后，用PBS缓冲液冲洗芯片两次，方法同前。接下来，从装置中吸除 PBS。立即向芯片的左上孔加入 100 微升细胞培养基。1.5 分钟后，向左下孔加入培养基。等待五分钟，使培养基流经微沟槽，然后在芯片右侧重复加样过程。根据既定方案制备解离的大鼠海马神经元细胞悬液。吸除芯片各孔中的大部分培养基，但保留通道内的液体。接下来，立即将5 µL细胞悬液加入右上孔，另取5 µL细胞悬液加入右下孔。加样时，将移液器枪头对准主通道。加样完成后，将芯片转移至显微镜载物台上，确认神经元位于主通道内。等待细胞贴壁五分钟后，向每个右上和右下孔中各加入约 150 微升神经元培养基。然后，向每个左上和左下孔中各加入 150 微升培养基。盖上培养皿，将芯片置于加湿托盘中，放入含 5% 二氧化碳、37°C 的培养箱内。首先，从轴突区室的左下孔中移除 20 微升液体，并将其加入胞体区室的右上孔中。等待两分钟，使每个通道内的液体流动达到平衡。接着，从轴突区室中取出 50 微升培养基，并向其中加入 0.3 微升浓度为 1 毫摩尔的 Alexa Fluor 488 肼。用移液器反复吹打以混匀溶液，然后将含有荧光染料的培养基重新移回轴突室。此时，将芯片置于显微镜下，按需进行成像。若需在芯片内进行轴突切断（axotomy），首先从轴突室中移除培养基，移液时需使移液器尖端远离主通道的入口。暂时将移除的培养基存放在离心管中。接下来，将吸液毛细管靠近轴突室主通道的任一入口，彻底吸除轴突室中的液体。继续对该区域进行抽吸 1 至 2 分钟。更换轴突室中的储存培养基。在显微镜下观察样本，确保 compartment 中的溶液已完全移除且轴突已被切断。然后盖上芯片并放回培养箱中。开始荧光免疫染色时，移除芯片中的大部分培养基，同时保持内部腔室湿润。立即向轴突和胞体腔室的上部孔中加入 100 µL 固定液。一分钟后，向底部孔中加入 100 µL 固定液，并在室温下固定细胞 30 分钟。吸除小室中大部分溶液，立即向轴突和胞体区室的上部小室中各加入150 µL PBS。等待2分钟，使PBS流入下部小室，然后吸除PBS，并重复此步骤再冲洗两次。最后一次冲洗后，吸除芯片小室中大部分PBS，立即向轴突和胞体区室的上部小室中各加入含0.25% Triton X-100的150 µL PBS。等待15分钟，然后吸出孔中大部分液体。立即向轴突和胞体区室的每个上孔中加入150微升封闭液。15分钟后，吸出孔中大部分液体，并立即向轴突和胞体区室的每个上孔中加入100微升一抗溶液。覆盖芯片以尽量减少蒸发，并在室温下用一抗孵育细胞1小时。随后，通过吸除大部分溶液，并立即向轴突室和胞体室的每个上层小孔中加入150 µL PBS，清洗芯片。5分钟后，吸去两个小孔中的PBS，并重复该清洗步骤两次。现在，吸出各孔中的大部分液体，并立即向轴突和胞体区室的上层孔中分别加入 100 µL 用 PBS 配制的二抗。盖上芯片以减少蒸发，并在室温下孵育 1 小时。如前所述，用 PBS 洗涤芯片三次，然后按照随附的文字版实验方案所述进行封片和成像。此处展示的是在塑料芯片和PDMS装置上培养的神经元的并列比较。在培养的前15天内，两种平台上的神经元生长情况相当；但在更长时间的培养后，塑料芯片中的孤立轴突表现出更少的搏动，形态更健康。为了进一步可视化轴突区室内的轴突，这些样品还进行了β-tubulin III免疫染色，结果显示在培养22天时，塑料芯片内存在健康的轴突生长。对培养24天的样品进行进一步染色显示，在塑料芯片中生长的神经元表达兴奋性和抑制性突触标志物vGlut1和vGat。图中为两种突触标志物与逆行标记的mCherry神经元的共定位结果。为验证该芯片适用于轴突损伤与再生研究，我们在轴突切断前及切断后24小时对逆行标记的神经元进行了成像观察。轴突切断后，回缩球和再生轴突均清晰可见。这些结果与使用基于PDMS的装置发表的数据相当。经典的多室芯片为神经元的区室化提供了一种易于使用的方案，可建立长期神经元培养，细胞活力可持续超过三周。进行该操作时，重要的是要记住接种适当数量的神经元，并确保培养过程中培养箱具有良好的湿度。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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关键词：微流控芯片，大鼠海马神经元，荧光免疫染色，神经元培养，细胞分隔，轴突，树突，免疫荧光，神经生物学

本文描述了用于单神经元微流控阵列化以及芯片内生物材料涂层等离子体图案化水掩模技术的实验方案。利用极少的细胞输入即可制备高度互连的共培养体系。...

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本文描述了一种培养 体外 由空间上受限、功能上相互连接的神经元回路组成的模块化网络。使用聚合物掩模在培养基底上构图蛋白层，以促进细胞在特定区域的黏附。接种的神经元在包被区域生长，形成自发连接并表现出电生理活性.

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本方案展示了使用环状烯烃共聚物注塑成型的分区化微流控芯片培养由人类干细胞分化而来的神经元。这些芯片为预组装设计，相较于传统的聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane)）分区装置更易于使用。文中描述了多种常见的实验范式，包括病毒标记、流体隔离、轴突切断以及免疫染色。...

人干细胞来源神经元在预组装塑料微流控芯片内的区室化培养

本实验方案描述了在微流控腔室中对神经元线粒体进行接种和染色的方法。这些腔室中的流体压力梯度可实现对轴突内线粒体的选择性处理，从而在不干扰胞体区室的情况下，分析其对药物干预的响应特性。...

微流控辅助选择性去极化轴突线粒体

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。...

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

了解预组装塑料微流控芯片技术，用于原代大鼠海马神经元的分区培养与高分辨率成像。该方法支持轴突发育、突触重塑及神经损伤后再生研究，为神经科学提供稳定可靠的实验平台。

使用预组装塑料微流控芯片对原代小鼠神经元进行区室化培养

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