预组装塑料微流体芯片在原生小鼠神经元分割中的应用

用于分体神经元的微流体设备已成为神经科学的标准工具，使研究人员能够物理和化学地操纵神经元的亚细胞区域，包括索马塔、轴突、树突和突触。这些分门别类的培养设备可以帮助回答神经科学领域的许多问题，例如，轴突在开发过程中如何延伸形成突触，突触在轴突损伤后如何重塑和改造，以及病理状况如何在阿尔茨海默氏症等疾病中跨突触传播。该协议描述了使用预组装塑料多部门芯片来划分培养初级大鼠神经元。

使用这些芯片的主要优点是，它们提供了一种易于使用和高度可重复的方法来划分神经元。另一个优点是，这些芯片产生更健康，长期生长的神经元和孤立的轴突比比以前的硅基分立器件，并同样兼容高分辨率显微镜。其他模型系统，包括人类干细胞，也可以在预组装的分型芯片内培养。

首先，将无菌的多部门芯片放入培养皿中。在芯片的左上角井中添加 100 微升预编码解决方案，并允许其通过主通道流入相邻的井。接下来，用 100 微升的预编码解决方案填充芯片左下井。

这一次，等待五分钟，让溶液流过微槽。现在，在右上井中添加 100 微升的预编码解决方案，并允许它通过主通道流入相邻的井。90 秒后，用 100 微升预编码溶液填充右下井，并孵育芯片 10 分钟。

小心地倾斜移液器尖端，远离主通道，从每一个井中吸出溶液。然后，立即在左上角井中添加 150 微升 PBS，等待一分半钟。接下来，在左下井中加入150微升PBS，等待5分钟，让液体流过微槽。

然后，按此顺序在右上角和右下角的井中添加 150 微升 PBS。10 分钟后，再次吸气 PBS 并再次重复洗涤步骤。第二次洗涤后，将 PBS 与之前一样从井中吸出，将移液器尖端从通道开口中吸走。

然后，将每密耳聚-D-Lysine 溶液的 100 微升 0.5 混合添加到芯片的左上部井中。等待一个半分钟，然后用 100 微升的 Poly-D-Lysine 溶液填充左下井。在芯片的右半部分重复此过程。

关闭培养皿。然后，将芯片在37摄氏度的孵化器中放置一小时。孵育后，使用PBS冲洗芯片两次，如前所述。

接下来，从设备中吸出 PBS。立即在芯片的左上角井中添加 100 微升的细胞培养介质。一分半钟后，将介质添加到左下井。

等待五分钟，让介质流过微槽，然后在芯片右侧重复灌装过程。根据既定协议，准备分离大鼠海马神经元的细胞悬浮。卸下芯片每个井中的大部分介质，但保持通道填充。

接下来，立即将5微升的细胞悬浮液加载到右上井中，并在右下井中再将5微升的细胞悬浮液加载。加载电池时，将移液器的尖端指向主通道。加载细胞后，将芯片转移到显微镜阶段，并确保神经元在主通道中。

等待五分钟后，细胞附着，将大约150微升的神经元培养培养剂添加到每个上部和右下井中。然后，将 150 微升介质添加到每个上部和左下部井中。盖住培养皿，将芯片放在加湿盘中，放在 5% 的二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中。

首先，从气动舱左下井中取出 20 微升，并将其放入体形隔间右上井中。等待两分钟，让每个通道内的流量平衡。接下来，从气管室中取出 50 微升介质，并在此介质上添加 0.3 微升的 1 毫摩尔 Alexa Fluor 488 hydrazide。

上下移液混合溶液，然后将含有荧光染料的介质放回气管室。此时，根据需要将芯片放在显微镜和图像上。要在芯片内进行气解剖，首先，从气管室中取出介质，使移液器尖端远离主通道的入口。

将拆下的介质现在存放在离心管中。接下来，将吸气移液器放在斧弓室主通道的任一入口附近，并完全吸气。继续吸气区域一到两分钟。

用存储的介质更换斧弓室。确保溶液完全从隔间中取出，并在显微镜下观察样品，将轴子拆下。然后，盖住芯片并返回到培养箱。

要开始荧光免疫污，请从芯片中取出大部分介质，保持内部隔间水合。立即在气管和躯体隔间的顶部井中添加 100 微升固定溶液。一分钟后，在底部井中加入100微升固定溶液，并在室温下固定细胞30分钟。

从油井中取出大部分溶液，并立即在气动和躯体隔间的每个顶部井中加入 150 微升 PBS。等待两分钟，让 PBS 流入底部井，然后，取出 PBS，然后使用相同的工艺再冲洗两次水井。最后一次冲洗后，从芯片的孔中取出大部分PBS，并立即将150微升PBS和0.25%三吨x-100添加到气管和体形隔间的每个顶部孔中。

等待15分钟，然后，从井中去除大部分液体。立即，在气动和躯体隔间的每个顶部井中添加 150 微升的阻尼溶液。15分钟后，从井中取出大部分液体，并立即将原抗体溶液的100微升添加到气管和体膜隔间的每个顶部孔中。

覆盖芯片以尽量减少蒸发，并在室温下孵育原抗体中的细胞一小时。接下来，通过去除大部分溶液来冲洗芯片，并立即将 150 微升 PBS 添加到斧头和体形隔间的每个顶部孔中。五分钟后，从两口井中取出 PBS，再重复冲洗两次。

现在，从井中取出大部分液体，并立即在PBS中加入100微升的二次抗体，进入气管和体液室的每个顶部孔中。盖住芯片以尽量减少蒸发，并在室温下孵育芯片一小时。如前所述，使用 PBS 冲洗芯片三次，然后安装并成像随附的文本协议中描述的芯片。

此处显示，是塑料芯片和 PDMS 设备上生长的神经元的并排比较。神经生长在培养的两个平台上可比较，在培养时间长达15天，但在较长的培养年龄下，塑料芯片内的分离轴子看起来更健康，跳动更少。为了进一步可视化轴孔室内的轴子，这些样品还对β图布林III进行免疫污染，该三者显示出在培养22天的塑料芯片中健康的轴孔生长。

用24天样本进一步染色显示塑料芯片中生长的神经元，以表达兴奋和抑制性突触标记物vGlut1和vGat。这里是两个突触标记结合逆行标记mCherry神经元。为了证明这种芯片是否适合轴突损伤和再生研究，逆行标记的神经元在轴管切除术前和24小时后被成像。

回缩球和再生轴孔在轴管切除术后都很明显。这些结果等效于使用基于 PDMS 的设备发布的数据。经典的多部门芯片提供了一个易于使用的选项，用于隔离神经元提供长期神经元培养，这些神经元仍然存活超过三周。

在尝试此过程时，请务必记住播种适当数量的神经元，并确保培养箱在培养过程中被很好地加湿。