Name: 脂多糖注射液致大鼠亚急性脑 Microhemorrhages (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 了解利用脂多糖注射在Sprague-Dawley大鼠中诱导脑微出血的方法。该技术通过炎症机制研究神经病理学，为帕金森病和阿尔茨海默病等脑部疾病研究提供可靠模型。

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感谢首都医科大学雷建锋老师及其同事在磁共振成像方面的指导。同时感谢宜昌市第二人民医院神经内科曾静提供的技术支持。

本文所述所有方法均已获得中国人民解放军陆军总医院动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。
1. 材料
<ol>
	<li>脂多糖（LPS）注射液的制备
	<ol>
		<li>将25 mg来源于S. typhimurium的LPS粉末溶于25 mL蒸馏水中，配制成终浓度为1 mg/mL的溶液。将注射液置于无菌管中，4 °C保存。 
		注意：LPS具有毒性。</li>
		<li>用0.9%生理盐水配制2%伊文思蓝（EB）溶液，使EB注射液保持工作浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物
<ol>
	<li>通过腹腔注射的方式，向10周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（平均体重：280 ± 20 g）给予LPS。 
	注意：若大鼠从其他机构购买，则适应期不应少于7天。</li>
</ol>
3. LPS 注射
<ol>
	<li>向每只大鼠腹腔注射1 mg/kg的LPS，然后将大鼠放回原笼具中。 
	注意：无需麻醉。</li>
	<li>6小时后，向大鼠注射相同剂量的LPS。</li>
	<li>16小时后，向大鼠注射相同剂量的LPS。 
	警告：以1 mg/kg剂量向SD大鼠注射LPS可能导致5%的死亡率。在幼龄、老龄或妊娠雌性大鼠中，死亡率可能进一步升高。</li>
	<li>将大鼠注射LPS后放回笼中，并提供 随意摄取 饮食获取 
	注意：大鼠将表现出明显的全身性炎症反应，因此在整个实验过程中必须保持笼具清洁。&#160;大鼠在首次注射LPS后应每天监测两次体重、一般外观和精神状态。如果大鼠开始出现弓背姿势、不愿移动、明显体重减轻（&#62;20%），需对卟啉染色阳性小鼠在7天EB实验终点前实施人道安乐死。</li>
</ol>
4. 样本采集
<ol>
	<li>EB 注射
	<ol>
		<li>首次注射后第 7 天，根据已批准的 IACUC 方案，通过腹腔注射麻醉大鼠。&#160;</li>
		<li>等待 1–2 分钟，直至大鼠角膜反射消失。对每只大鼠进行 5–8 mm 深的心脏穿刺；穿刺点应位于胸骨左缘第 3 与第 4 肋间间隙，距离胸骨左缘约 5 mm。</li>
		<li>待血液回流出现后，将伊文思蓝（EB）以 0.2 mL/100 g 体重的剂量注入左心室。 
		警告：心脏穿刺和 EB 注射操作需谨慎。EB 可能误注入胸腔或心包腔而非左心室。
		<ol>
			<li>注射前，先用空管回抽，再更换为含 EB 的注射管，有助于降低操作失败率（例如，误将 EB 注入肋骨）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将大鼠保持仰卧位 10 分钟。 
		注意：若样本不用于免疫荧光成像中 EB 渗漏的检测，则此步骤可省略。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肉眼观察
	<ol>
		<li>使用冰冻的 1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）进行心脏灌注，以清除脑血管及脑组织中的血液。
		<ol>
			<li>使用手术刀沿膈肌全长做腹部切口。</li>
			<li>在肋骨中线左侧稍偏处剪开肋骨。</li>
			<li>打开胸腔，使用止血钳暴露心脏并促进血液及其他液体的排出。</li>
			<li>用镊子稳定夹持心脏（此时心脏应仍在跳动），将针头直接插入左心室突出部位，插入深度约 5 mm，并在穿刺入口附近夹紧固定针头。 
			警告：切勿过度插入针头，以免刺穿心室内壁，影响灌注液的循环。</li>
			<li>打开阀门，使用灌注泵以约 20 mL/min 的缓慢稳定流速灌注冰冻 PBS 溶液（200–300 mL）。若动物需固定而非仅进行肉眼观察，则改用相同体积的冰冻 0.9% 生理盐水溶液。</li>
			<li>使用锐利剪刀剪开心房，确保灌注液持续流动。若液体流动不畅或从动物鼻孔或口腔流出，应重新调整针头位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过肉眼观察筛查脑微出血灶（CMHs）。 
		注意：若样本不用于通过肉眼观察计数 CMHs 数量，则此步骤可省略。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>使用冰冻的 0.9% 生理盐水溶液（200–300 mL）进行心脏灌注，以清除脑血管及脑组织中的血液。</li>
		<li>使用冰冻的 4% 多聚甲醛溶液进行心脏灌注，用于组织固定。</li>
		<li>断头取脑，分离脑组织，并将脑浸入 20% 蔗糖溶液中，至少固定 6 小时。</li>
		<li>更换为 30% 蔗糖溶液，继续固定 6 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用冷冻切片机制备 10 mm 厚的脑组织切片。</li>
</ol>
5. 苏木精-伊红染色（HE染色）
注意：本实验使用苏木精-伊红（HE）染色试剂盒进行。
<ol>
	<li>用蒸馏水清洗载玻片。</li>
	<li>用苏木精溶液染色 8 分钟。用流动的自来水冲洗 5 分钟。</li>
	<li>用 1% 酸性乙醇分化 30 秒。用流动的自来水冲洗 1 分钟。</li>
	<li>用 0.2% 氨水（蓝化）或饱和碳酸锂溶液染色 30 秒至 1 分钟。用流动的自来水冲洗 5 分钟。</li>
	<li>在 95% 乙醇中漂洗（10 次浸洗）。</li>
	<li>用伊红溶液复染 30 秒至 1 分钟。</li>
	<li>依次通过 95% 乙醇、两次更换无水乙醇脱水，每次 5 分钟。</li>
	<li>用二甲苯透明 30 秒。</li>
	<li>采用刘氏法封片9。</li>
	<li>使用明场荧光显微镜观察。 
	注意：从血管中释放的红细胞是 CMHs 的组成部分，在 HE 染色下呈红橙色。</li>
</ol>
6. Perl 普鲁士蓝染色
注意：本实验使用Perls染色试剂盒进行。
<ol>
	<li>用蒸馏水清洗载玻片。</li>
	<li>将载玻片置于反应液中染色，反应液由等量的亚铁氰化钾与盐酸混合而成，染色时间为10分钟。</li>
	<li>脱水、透明、封片，并按照步骤5.7–5.10所述方法进行分析。</li>
</ol>
7. EB 双重染色
注意：本步骤接续步骤 4.1.3。
<ol>
	<li>用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。</li>
	<li>将载玻片在 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液中室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 溶液洗涤载玻片三次，每次 5 分钟，然后用 PBS-甘油溶液封片。</li>
	<li>在荧光显微镜下分析图像。EB 沉积表现为红色荧光；细胞核表现为蓝色荧光。</li>
</ol>
8. MRI-SWI
<ol>
	<li>在配备有源屏蔽梯度系统（16 cm 内径）的 7-T 磁体上进行 MRI 扫描。</li>
	<li>治疗后 7 天，使用异氟烷麻醉系统通过面罩吸入 1.5–2.0% 异氟烷对大鼠进行麻醉。</li>
	<li>在大鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间眼睛干涩。</li>
	<li>将大鼠保持俯卧位，并进行 MRI-SWI 扫描。</li>
	<li>采用快速自旋回波序列获取 SWI 加权图像，参数如下：回波时间（TE）8 ms，重复时间（TR）40 ms，翻转角=12°，视野（FOV）35 mm × 35 mm，采集矩阵 384 × 384，以获取厚度为 1 mm 的切片。</li>
	<li>根据 Greenberg et al.11 的标准在 MRI-SWI 中识别脑微出血灶（CMHs），包括以下标准：(1) 直径 ≤10 mm；(2) 圆形、孤立且信号强度低的病灶。</li>
	<li>实验结束时，采用过量二氧化碳（流速 6 L/min 或容器体积的 30%）的方法处死大鼠。</li>
</ol>

<ol><li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+inflammation-induced+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).</li>
<li>Vernooij, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+cerebral+microbleeds+the+Rotterdam+Scan+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study.</a> Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).</li>
<li>Pettersen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbleed+topography%2C+leukoaraiosis%2C+and+cognition+in+probable+Alzheimer+disease+from+the+Sunnybrook+dementia+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study.</a> Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds+and+neuropsychiatric+symptoms+in+an+elderly+Asian+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+iron+quantification+in+collagenase-induced+microbleeds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).</li>
<li>Reuter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+microbleeds+in+the+APP23-transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloid+angiopathy-a+9.4+tesla+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).</li>
<li>Scott, L. L., Downing, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neonatal+exposure+to+BMAA+in+a+rat+model+produces+neuropathology+consistent+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases.</a> Toxins. 10 (1), E22(2018).</li>
<li>Toth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+hypertension-induced+cerebral+microhemorrhages+in+mice%3A+role+of+resveratrol+treatment+in+vasoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection.</a> Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H%26E+and+Prussian+blue+staining+in+a+mouse+model+of+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+subacute+cerebral+microhemorrhages+with+involvement+of+Nitric+Oxide+Synthase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stroke+and+Cerebrovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).</li>
<li>Greenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds%3A+A+guide+to+detection+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation.</a> Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Field+MRI+reveals+a+drastic+increase+of+hypoxia-induced+microhemorrhages+upon+tissue+reoxygenation+in+the+mouse+brain+with+strong+predominance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb.</a> Plos One. 11 (2), e0148441(2016).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphodiesterase+3A+modulation+on+murine+cerebral+microhemorrhages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+development+of+cerebral+microbleeds+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).</li>
<li>Mello, B. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+in+behavior+and+brain+inflammatory+and+oxidative+alterations+in+mice+submitted+to+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression.</a> Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).</li>
<li>Souza, D. F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+astroglial+markers+in+a+maternal+immune+activation+model+of+schizophrenia+in+Wistar+rats+are+dependent+on+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).</li>
<li>Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipopolysaccharide+Parkinson%27s+disease+animal+model%3A+mechanistic+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Bayan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+resveratrol+targeting+estradiol+and+neprilysin+pathways+in+lipopolysaccharide+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).</li>
<li>Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+infection+evokes+exaggerated+sickness+behaviour+in+pre-clinical+murine+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease.</a> Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Rosand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+clustering+of+hemorrhages+in+probable+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy.</a> Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Kraft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+induced+cerebral+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease.</a> Plos One. 12 (8), e0182822(2017).</li>
<li>Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+the+starting+point+of+cerebral+small+vessel+disease%3F+-+New+insights+from+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Translational+Stroke+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model.</a> Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，关于脑微出血（CMHs）的研究逐渐增多。然而，CMHs的发病机制仍不明确，促使科学家建立模拟该特定状况的动物模型。例如，Hoffmann et al. 建立了一种由缺氧诱导的CMHs小鼠模型，表明CMHs由缺氧及脑血管自身调节功能障碍所致12。Reuter et al.5在APP23转基因小鼠中建立了CMHs模型，结果显示脑淀粉样血管病（CAA）在CMHs的病因学中起主要作用。Fisher et al.报道了一种通过注射LPS诱导的CMHs小鼠模型9，揭示了炎症是导致CMHs的原因之一2,13,14。类似地，我们已成功利用LPS注射在SD大鼠中建立了一种亚急性CMHs模型，并发现一氧化氮合酶（NOS），特别是神经元型NOS和内皮型NOS，参与了CMH...

经典脑微出血（CMHs）是指脑内红细胞中的血红蛋白降解产物（如含铁血黄素）在血管周围形成的微小沉积1。根据鹿特丹扫描研究，约17.8%的60至69岁人群和38.3%的80岁以上人群中可发现CMHs2。老年人群中CMHs的患病率相对较高，且已有研究证实CMHs的累积与认知功能障碍及神经精神功能障碍之间存在相关性3,4。近年来已报道多种CMHs的动物模型，包括通过IV型胶原酶立体定位注射诱导的啮齿类动物模型5、APP转基因模型6、β-N-甲基氨基-L-丙氨酸暴露模型7以及高血压模型8，其中由系统性炎症诱导的CMHs模型是目前最受认可的选择之一。Fisher et al.9首次使用来自Salmonella typhimurium的脂多糖（LPS）建立急性CMHs小鼠模型。随后，该研究团队采用相同方法进一步建立了亚急性CMHs小鼠模型2。
脂多糖（LPS）被认为是通过腹腔注射诱导炎症反应的标准刺激物。via 腹腔注射。先前的研究已证实，LPS 注射可导致神经炎症，表现为动物模型中大量小胶质细胞和星形胶质细胞的活化2,10。此外，神经炎症活化程度与脑微出血（CMHs）数量之间存在正相关关系已得到证实2,10。基于这些前期研究，我们拟通过腹腔注射 LPS 建立 CMHs 大鼠模型。
检测技术的进步使得关于脑微出血（CMHs）的研究日益增多。目前公认的CMHs检测方法包括苏木精和伊红（HE）染色检测红细胞、普鲁士蓝染色法检测三价铁离子9、免疫荧光成像检测伊文思蓝（EB）沉积，以及7.0特斯拉磁共振成像-磁敏感加权成像（MRI-SWI）10。本研究旨在建立一种CMHs的筛查方法。

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2630</td><td>用于诱导炎症</td></tr><tr><td>EB</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E2129</td><td>用于检测EB渗漏</td></tr><tr><td>DAPI染色液</td><td>Servicbio</td><td>G1012</td><td>免疫荧光计数用介质</td></tr><tr><td>Perl&amp;rsquo;s普鲁士蓝染色试剂</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td>普鲁士蓝染色试剂盒</td></tr><tr><td>苏木精-伊红（HE）染色</td><td>Solarbio</td><td>G1120</td><td>HE染色试剂盒</td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47335U</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>实验中常用的缓冲溶液</td></tr><tr><td>0.9%生理盐水溶液</td><td>Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., 中国</td><td></td><td>灌注用溶液</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>常用于固定的溶液</td></tr><tr><td>20%蔗糖溶液</td><td>Solarbio</td><td>G2461</td><td>常用于固定的溶液</td></tr><tr><td>30%蔗糖溶液</td><td>Solarbio</td><td>G2460</td><td>常用于固定的溶液</td></tr><tr><td>兽用眼膏</td><td>Solcoseryl眼用凝胶，Bacel，瑞士</td><td></td><td>用于大鼠眼部保护</td></tr></tbody></table>

大鼠注射脂多糖诱导的亚急性脑微出血

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

脑微出血（CMHs）在老年患者中较为常见，且与多种神经精神疾病相关。CMHs的病因复杂，常伴随神经炎症的发生。本文介绍了一种通过脂多糖（LPS）注射诱导的亚急性CMH大鼠模型，以及检测CMHs的方法。全身性LPS注射操作相对简便、经济且成本较低。LPS注射的一个主要优势在于其诱导炎症反应的稳定性。通过LPS注射引起的CMHs可通过肉眼观察、苏木精-伊红（HE）染色、普鲁士蓝染色、伊文思蓝（EB）双标法以及磁共振成像-磁敏感加权成像（MRI-SWI）技术进行检测。最后，本文还讨论了其他建立CMH动物模型的方法及其各自的优点和/或局限性。

CMH 可通过多种方法进行检测。目前最广泛接受的方法包括：（1）肉眼观察和评估表面 CMH（见图1，上图）；（2）通过苏木精-伊红（HE）染色检测红细胞（见图2A，上图），或通过普鲁士蓝染色检测红细胞裂解释放的三价铁（图2A，下图）；（3）伊文思蓝（EB）双染法检测血脑屏障渗漏所致的 EB 沉积（图3，左图）；（4）磁共振成像 SWI 序列检测 CMH 的低信号表现（图4，左图）。
<img alt="大鼠脑解剖，解剖学研究；多角度展示脑区，箭头指示结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58423/58423...

我们提出了一种通过向Sprague-Dawley大鼠注射脂多糖（LPS）来诱导并检测慢性微出血（CMHs）的实验方案，该方法可用于未来关于CMHs发病机制的研究。

脑微出血（CMHs）在老年患者中较为常见，且与多种神经精神障碍相关。CMHs的病因复杂，……

该方法有助于回答脑微出血领域的一些关键问题，例如脑微出血的病因、分布和检测等。该技术的主要优势在于脂多糖（LPS）注射能够稳定地诱导炎症反应。此外，LPS注射操作简便、经济且成本效益高。尽管该方法可用于研究脑出血的诱导，也可应用于其他脑部疾病，如抑郁症、精神分裂症、帕金森病、阿尔茨海默病和朊病毒病。对10周龄雄性Sprague Dawley大鼠按每公斤体重1毫克的剂量通过腹腔注射给予LPS，然后将每只大鼠放回其饲养笼中。分别在6小时和16小时后重复给予LPS注射。请注意，以每公斤1毫克的剂量向SD大鼠注射LPS可能导致5%的死亡率。在幼龄、老龄或妊娠期雌性大鼠中，死亡率可能进一步升高。LPS注射后将大鼠放回笼中，并自由提供食物和饮水。在终末麻醉下，对每只大鼠进行深 5 至 8 毫米的心脏穿刺。穿刺点应位于胸骨左缘第 3 和第 4 肋间，距胸骨左缘 5 毫米处。固定针头位置，将空管更换为含有伊文思蓝的试管。待观察到血液回收后，将伊文思蓝以每100克体重0.2毫升的剂量注入左心室。若通过免疫荧光成像评估伊文思蓝通过血脑屏障的渗漏情况，则将大鼠保持仰卧位10分钟。使用冰冻的0.9%生理盐水溶液200至300毫升进行心脏灌注，以清除脑血管和脑组织。更换为预冷的4%多聚甲醛进行固定。随后，取出脑组织，将其浸入含20%蔗糖的PBS溶液中，至少六小时或直至脑组织沉入管底。更换为30%蔗糖溶液，继续固定六小时。最后，使用冷冻切片机制备10毫米厚的脑组织切片。将载玻片用PBS洗涤三次，每次五分钟，然后在室温下用4,6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液孵育15分钟。按照之前的方法用PBS再次洗涤载玻片，随后用PBS-甘油溶液封片。在荧光显微镜下采集图像。EB 沉积表现为红色荧光，细胞核表现为蓝色荧光。用蒸馏水洗涤玻片，开始进行 H&E 染色。然后将样本浸入苏木精溶液中染色8分钟。或者，对于普鲁士蓝染色，使用等体积混合的亚铁氰化钾与盐酸配制的反应液染色10分钟。染色后，用流动的自来水冲洗5分钟。用1%酸性酒精分化30秒。用流动自来水冲洗1分钟后，用0.2%氨水或饱和碳酸锂溶液染色30秒至1分钟。接着，用流动自来水冲洗5分钟。用伊红溶液复染30秒至1分钟。依次经90%酒精、95%酒精和无水酒精脱水，每步0.5至2分钟。脱水后，二甲苯透明30秒。封片后，使用明场荧光显微镜分析H&E染色结果。由血管释放的红细胞是CMHs的组成部分，在H&E染色下呈红橙色。通过肉眼观察可检测到表面CMHs，如红色箭头所示。伊文思蓝染色可显示伊文思蓝分子从受损的血脑屏障渗漏所产生的可见红色荧光。H&E 染色显示毛细血管外出现的红细胞，普鲁士蓝染色则揭示由红细胞裂解释放的铁离子沉积位点。在进行该操作时，需注意用于诱导脑微出血的脂多糖（LPS）剂量大于帕金森病或精神分裂症模型所使用的剂量。因此，应保持动物生活环境的清洁，以降低死亡率。在此步骤之后，可采用其他方法，如电子显微镜、磁共振成像和免疫荧光成像，以评估脑微出血时血脑屏障外层结构的损伤、脑实质内脑微出血的分布情况，以及胶质细胞的活化状态。

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脂多糖注射液致大鼠亚急性脑 Microhemorrhages

动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）是指动脉瘤破裂后血液流入蛛网膜下腔所引起的出血。尽管由于治疗手段的不断改进，该疾病的发病率和死亡率已呈下降趋势，但蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的风险仍与数年前持平。自1979年Barry et al. 首次在实验性脑血管痉挛模型中使用大鼠以来，建立一种全面且可重复的动物模型以识别脑血管痉挛的启动事件，一直是研究的重点。早期在大鼠中的研究表明，向小脑延髓池单次注射自体血可导致急性（数分钟内发生）但不会引起迟发性脑血管痉挛3, 6,...

一种低死亡率的大鼠模型用于评估实验性蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛

为了进一步了解出血性卒中并研究新的治疗策略，需要建立具有临床相关性的脑出血（ICH）动物模型。在本研究中，我们描述并评估了两种ICH模型，这两种模型通过向小鼠基底节（纹状体）单侧注射自体全血或细菌胶原酶来实施。...

小鼠脑内出血模型的建立：自体血或细菌胶原酶注射法

本视频展示了在大鼠模型中使用脂多糖（LPS）诱导血脑屏障（BBB）破坏及脑微出血的过程。重点阐述了导致血脑屏障通透性增加及继发性脑组织损伤的免疫反应序列。...

利用脂多糖在大鼠模型中诱导脑微出血

本视频展示了一种在大鼠模型中检测脑微出血（CMHs）的实验方法。CMHs 是由于血脑屏障破坏导致的脑内出血，通过外渗的红细胞（RBCs）进行识别。在大鼠模型中，固定后的脑组织经冷冻保护、切片，并用苏木精-伊红染色以标记红细胞，从而可在显微镜下观察...

在大鼠模型中检测脑微出血

脑出血的临床前模型用于模拟临床疾病的某些方面，从而可研究损伤机制及潜在的治疗策略。本方案中描述了两种脑出血模型，即自体血或胶原酶注入纹状体（基底节）。...

纹状体内注射自体血或梭状芽胞杆菌胶原酶作为脑内出血的小鼠模型

早产儿脑病包含与早产所致脑损伤相关的中枢神经系统异常. 本报告描述了一种具有临床相关性的大鼠模型 在子宫内...

利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

本文所述方案可在成年雄性Dark...

通过脑内注射促炎性细胞因子诱导广泛性大脑皮层脱髓鞘的大鼠模型

我们提出了一种通过两次注射自体血在大鼠中建立大规模脑桥出血模型的方案。...

双侧注射自体血所致的大面积脑桥出血

蛛网膜下腔出血在人类中仍具有较高的死亡率和致残率。为了促进对该疾病及其病理生理机制的进一步研究，本文介绍了一种视交叉前单次注射模型。...

在大鼠模型中通过视交叉前单次注射自体血诱导实验性蛛网膜下腔出血

早产儿脑出血后脑积水（PHHP）可通过在新生大鼠中联合建立绒毛膜羊膜炎和脑室内出血模型来模拟。这种产前与产后事件的结合能够终生准确再现PHHP的临床特征，包括巨头畸形、脑室扩大和颅内压升高。...

建立早产儿脑出血后脑积水的大鼠模型

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。...

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

了解利用脂多糖注射在Sprague-Dawley大鼠中诱导脑微出血的方法。该技术通过炎症机制研究神经病理学，为帕金森病和阿尔茨海默病等脑部疾病研究提供可靠模型。

大鼠注射脂多糖诱导的亚急性脑微出血

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