尿液、血清和蚊虫样本中寨卡病毒及看家基因的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测
2018年9月14日
本方案提供了一种高效且低成本的方法，通过反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）检测人尿液和血清样本或蚊虫中的寨卡病毒或对照目标。该方法无需RNA提取，可在30分钟内完成。
该方法可快速检测样本中是否含有寨卡病毒，适用于孕妇、备孕夫妇或对存在寨卡病毒感染风险的本地蚊虫种群进行监测。该技术的主要优势在于快速、简便，无需昂贵设备，且无需进行RNA提取步骤。
该技术的应用意义延伸至寨卡病毒感染的诊断，因为孕期感染与流产、死产以及其他严重的先天性神经出生缺陷相关。尽管该方法可为寨卡病毒研究提供洞见，但通过使用病毒特异性的引物，也可将其应用于登革热、基孔肯雅热或西尼罗病毒等其他传染病。首先，用分子级水重悬每种RT-LAMP引物，使其终浓度为100 µmol/L。
短暂涡旋混匀引物溶液，确保溶液均匀。以最大转速离心约五秒钟，收集引物溶液。然后按照技术手册中表二的说明配制10x RT-LAMP引物混合液。
涡旋振荡以确保溶液均匀。然后以最高速度短暂离心，避免任何损失。引物在使用期间应保存于零下20摄氏度，避免反复冻融。
对于人尿液样本，可使用新鲜尿液、冷冻尿液或含防腐剂的尿液。使用前需将任何冷冻样本置于冰上解冻。人血清样本应为新鲜或冷冻样本，而寨卡病毒（ZIKV）感染的细胞系则应包含条件培养基或细胞裂解物。
最后，对于埃及伊蚊，使用完整的尸体，可以是新鲜的或冷冻的。将任何冷冻的蚊虫尸体在冰上解冻。将一只蚊虫放入 100 µL 的 PBS 中。
使用 P10 移液器枪头将蚊子碾压 10 次，并进行匀浆以制备粗制蚊子裂解液。短暂离心粗制裂解液，使残渣沉淀，取上清液用于后续 RT-LAMP 分析。实验开始时，根据技术手册中表三的说明，为每种待用引物组在冰上配制 RT-LAMP 预混液反应体系。
涡旋混匀每个样品，确保充分混合，然后短暂离心以防止液体损失。对于每个反应，用移液器将23.0 µL的RT-LAMP预混液加入到200 µL的PCR管中。
然后加入 2 微升样品，使总体积达到 25.0 微升。阴性对照使用分子生物学级水，并确保包含阳性对照。可选地，根据技术方案中的说明，加入相关虫媒病毒（如登革病毒）的特异性对照反应。
使用加热块、水浴或热循环仪，将样品在 61 摄氏度下加热 30 分钟。随后，将温度升至 80 摄氏度，持续 10 分钟，以热失活聚合酶。在独立的封闭空间内进行 RT-LAMP 分析。
将荧光核酸染料用TAE缓冲液按1:10稀释。取2 µL稀释后的荧光核酸染料溶液加入12 µL的RT-LAMP反应体系中。通过观察是否发生颜色变化，目视评估RT-LAMP反应结果。
可选地，使用相机在白色背景下拍摄RT-LAMP反应的照片。随后，将样品置于302纳米紫外光下，通过荧光确认RT-LAMP产物的存在。使用相机拍摄结果照片。
开始进行电泳时，用含有核酸染料以供观察的1x TAE缓冲液配制2%琼脂糖凝胶。在第一泳道中加入5微升DNA Marker，用于比较分子量。对于每个RT-LAMP反应，将13微升RT-LAMP反应混合液与2微升DNA上样染料混合。
加入15微升该混合物。以90伏电压电泳90分钟，或直至条带分离。使用302纳米紫外光成像。
实验结束后，将RT-LAMP反应产物置于双层密封袋中处理。本研究采用三种不同方法分析RT-LAMP反应结果。使用荧光核酸染料时，阳性反应呈黄绿色，而阴性反应呈橙色。
当样品被紫外光激发时，该染料也会产生荧光信号。最后，可将RT-LAMP反应产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分析。阳性RT-LAMP反应会出现条带模式，而阴性反应则无DNA条带。
这些方法用于验证寨卡病毒（ZIKV）RT-LAMP反应的特异性。仅寨卡病毒（ZIKV）分子对照呈现阳性RT-LAMP反应。此外，在已知感染寨卡病毒（ZIKV）的患者中，尿液和血清样本均可检测到寨卡病毒（ZIKV），而在无寨卡病毒感染的无症状对照患者中则未检测到该病毒。
随后对样本进行人源18S rRNA检测。只有来自患者的样本显示18S rRNA阳性。蚊虫样本同样可被检测是否存在寨卡病毒（ZIKV）或RT-LAMP质量控制AEDAE。
仅观察到寨卡病毒（ZIKV）的阳性分子对照以及感染了ZIKV的蚊虫对ZIKV检测呈阳性。然而，所有蚊虫的RT-LAMP检测中AEDAE均为阳性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在30分钟内完成。
需要牢记的是，RT-LAMP 反应容易出现假阳性结果。预防措施包括在反应中使用热不稳定尿嘧啶 DNA 糖基化酶、采用单向工作流程、在独立空间内进行分析，以及减少扩增后打开管盖的时间。完成本操作后，可进一步采用其他方法（如定量 PCR）来回答更多问题，例如病毒或其他靶标在样本中的拷贝数。
观看本视频后，您应充分了解如何使用 RT-LAMP 在人类尿液、血清以及蚊虫样本中检测寨卡病毒及靶标对照。请注意，操作寨卡病毒和核酸染料具有极高危险性，进行该实验时必须采取防护措施，例如佩戴手套。鉴于寨卡病毒感染与先天性异常存在关联，孕妇、备孕女性及其伴侣应尽可能减少在实验室中接触寨卡病毒。
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概述
本方案提供了一种快速且经济高效的方法，利用反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）检测人尿液、血清样本或蚊子中的寨卡病毒。该技术的优势在于无需进行RNA提取，可在约30分钟内完成检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 传染病
- 诊断技术
背景
- 寨卡病毒在孕期具有显著的健康风险。
- 感染可能导致严重的先天性和神经系统缺陷。
- 现有的诊断方法可能耗时且成本较高。
- RT-LAMP 为寨卡病毒检测提供了一种快速的替代方法。
研究目的
- 提供一种快速诊断工具，用于检测寨卡病毒。
- 通过监测存在寨卡病毒风险的蚊虫种群，助力疾病防控。
- 通过辅助诊断寨卡病毒感染，支持生殖健康。
使用的方法
- 反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）。
- 来自人类尿液、血清及蚊子的样本分析。
- 使用病毒特异性引物进行检测。
- 快速处理时间，约30分钟。
主要结果
- 可在多种样本类型中高效检测寨卡病毒。
- 该方法已被证明操作简便且成本效益高。
- 无需进行RNA提取，简化了操作流程。
- 有望适用于登革病毒和基孔肯雅病毒等其他病毒的检测。
结论
- RT-LAMP 是一种用于快速诊断寨卡病毒的有前景工具。
- 该方法可加强针对寨卡病毒及相关病毒的监测工作。
- 未来研究可能会将其应用扩展至其他传染病。
常见问题
行业高管相关性
在临床样本和媒介样本中快速、无需设备的寨卡病毒检测，有助于在生殖健康和疫情监测方面实现早期干预。RT-LAMP 技术无需RNA提取即可实现分散化检测，缩短了检测时间并减轻了基础设施负担。该方法可提高抗病毒药物研发和媒介控制策略中靶点验证的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可对人源体液和蚊虫组织中的病毒存在进行功能性检测，以确认靶点结合情况。
- 操作价值：省去RNA提取步骤，简化了临床样本高通量筛查的工作流程。
- 预测价值：提供定性结果，用于对样本进行分类，以进行后续的定量分析或测序。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：采用病毒特异性引物检测寨卡病毒（ZIKV），已证实对无症状对照样本及相关虫媒病毒具有特异性。
- 操作价值：可通过颜色变化或紫外荧光进行可视化检测，适用于资源有限条件下的检测模式。
- 可扩展性：支持蚊虫匀浆样本的混合检测，适用于监测应用。
转化与临床前研究
- 科学价值：可检测感染患者尿液和血清中的寨卡病毒（ZIKV），为垂直传播风险评估提供临床相关性依据。
- 操作价值：利用看家基因（人类中的18S rRNA，蚊子中的actin）作为内参对照，以验证样本完整性。
- 预测价值：可在无需侵入性取样的情况下，对模型系统中的病毒载量动态进行纵向监测。
流程与工作流整合
RT-LAMP 可应用于从媒介生物学中的初步假设验证到抗病毒候选物的临床前评估这一系列研究过程中，尤其适用于需要快速样本分检的场景。
- 发现生物学：通过检测尿液、血清和蚊子样本中的病毒存在，验证病毒传播途径，支持靶点验证。
- 筛选：可制备适用于高通量检测的即用型样本，支持可视化或荧光信号读出。
- 分析：通过凝胶电泳生成二元（阳性/阴性）和半定量数据，用于不同条件间的比较分析。
- 转化研究：将人体样本中的病毒检测结果与临床前模型中先天性风险的机制研究相衔接。
- 企业级复用：引物设计框架允许使用相同的核心实验流程，快速适配于新发虫媒病毒（如登革病毒、基孔肯雅病毒）的检测。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供特异性强、无需仪器的读数，减少病毒检测中的机制模糊性。
- 操作价值：仅需加热块或水浴等最少设备，即可实现分散式检测。
- 战略价值：通过快速确认靶标调控，加速抗病毒筛选中的决策进程。
- 组合影响：基于在临床相关基质中对靶标的结合情况，支持对化合物进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备引物设计和核酸操作方面的分子生物学专业知识。
- 需要配备可进行温控孵育的设备（61°C 孵育 30 分钟，80°C 孵育 10 分钟）以及用于验证的紫外透射仪。
- 要求工作流程严格分区，以防止扩增产物污染和假阳性结果。
- 需针对不同样本类型（尿液、血清、蚊虫裂解液）进行优化，以克服抑制物的影响。
- 若无定量 PCR（qPCR）配合进行病毒载量定量，该方法仅限于定性或半定量结果。
