Name: 反向转录-环介导的等温放大 (RT 灯) 测定尿液、血清和蚊子标本中的 Zika 病毒和管家基因 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学习使用RT-LAMP技术快速检测尿液、血清和蚊子样本中的寨卡病毒，无需RNA提取步骤，约30分钟即可完成。该方法成本低、操作简便，适用于孕妇筛查和蚊媒监测。

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本工作由 Maureen 和 Ronald Hirsch 家族的慈善捐助以及密歇根圣玛丽医院的 Field 神经科学研究所资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。我们还要感谢 Bernadette Zwaans 博士和 Elijah Ward 对稿件提出的宝贵审稿意见。

本文所述所有方法均经博蒙特健康机构审查委员会（IRB）批准。所有实验均遵循相关指南和法规进行。
注意：所有潜在传染性材料均应按照生物安全二级标准进行操作，包括使用个人防护装备。任何可能产生气溶胶的操作均应在生物安全柜内进行。此外，活体蚊虫的操作应在适当的节肢动物防护等级1-3级设施中进行。鉴于寨卡病毒（ZIKV）感染与先天性异常相关，孕妇、正在备孕的女性或其伴侣应尽量减少在实验室接触ZIKV。在美国，ZIKV样本的运输被归类为B类生物物质，须符合美国交通部危险品法规（49 CFR 第171-180部分）的要求，因此样本运输应遵守相关指南。将ZIKV生物样本进口至美国需获得美国疾病控制与预防中心（CDC）的进口许可证。任何可能作为ZIKV传播媒介的节肢动物（即使未被感染）的进口，均需获得美国农业部（USDA）的许可。本信息截至发布时有效。最新建议可参见 https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html。
注意：RT-LAMP 反应容易出现较高比例的假阳性结果，因此在实验设计时应采取预防措施。所有 RT-LAMP 反应的设置和操作均应使用专用的移液器和滤芯吸头。理想情况下，应建立单向工作流程。若条件允许，分析与成像（第5节）应在独立的封闭房间内进行，以防止污染。应尽量减少打开含有 RT-LAMP 产物的试管。
1. RT-LAMP 引物制备
<ol>
	<li>用分子级水将每种冻干的RT-LAMP引物重悬，配制成终浓度为100 µM的溶液（表1）。短暂涡旋混匀引物溶液以确保均匀，并在台式离心机中以最大转速短暂离心，收集管壁上的全部引物溶液。</li>
	<li>根据表2中的体积，配制包含FIP、BIP、F3、B3、LF和LB引物的10倍浓度RT-LAMP引物混合液。短暂涡旋混匀引物溶液以确保均匀，并在台式离心机中以最大转速短暂离心，避免任何损失。 
	注意：Ae. aegypti 肌动蛋白（AEDAE）的RT-LAMP引物组不包含LB引物（环引物并非在所有RT-LAMP反应中均必需）。在此情况下，用分子级水替代LB引物的体积。</li>
	<li>引物使用期间应储存于-20 °C，避免反复冻融。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>对于人尿液样本：可使用新鲜尿液、冷冻尿液或含防腐剂的尿液。对于新鲜或冷冻样本：采集后立即以 700 × g 离心 10 分钟，取上清液用于分析，或于 -80 °C 冷冻保存以备后续使用。使用前将冷冻样本置于冰上解冻。</li>
	<li>对于人血清样本：可使用新鲜或冷冻的血清样本。</li>
	<li>对于寨卡病毒（ZIKV）感染的细胞系：可使用条件培养基或细胞裂解液。 
	注：感染后第 8 天的白纹伊蚊（Ae. albopictus）C6/36 细胞的无细胞条件培养基，可用于 ZIKV RT-LAMP 反应的阳性对照。</li>
	<li>对于埃及伊蚊（Ae. aegypti）蚊虫：可使用完整的、新鲜或冷冻的蚊虫尸体。将冷冻蚊虫置于冰上解冻。通过将单只蚊虫放入 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用 P10 移液器枪头碾压 10 次，制备粗制蚊虫裂解液（图 1）。短暂离心裂解液以沉淀残渣。取上清液用于后续 RT-LAMP 分析。 
	注：可通过在实验室条件下，以约 103 拷贝基因组当量的病毒在 200 nL 体积中对雌性蚊虫进行胸腔微量注射感染，并于感染后第 5 天采集蚊虫，从而制备阳性对照。</li>
</ol>
3. 准备 RT-LAMP 反应主混合液
<ol>
	<li>根据表3中的体积指南，在冰上为每种待用引物组配制RT-LAMP预混液。 
	注意：使用热不稳定的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）有助于防止假阳性结果。</li>
	<li>短暂涡旋振荡以确保所有样品充分混匀，然后短暂离心以防止液体损失。</li>
</ol>
4. RT-LAMP 检测
<ol>
	<li>每反应向200 µL PCR管中加入23.0 µL RT-LAMP预混液。加入2.0 µL样本（尿液、血清或步骤2中所述的粗制蚊虫裂解物上清液），使每个RT-LAMP反应总体积达到25.0 µL。阴性对照使用分子级水，并设置阳性对照。 
	&#8203;注意：可使用PCR标准品或感染细胞系上清液中的病毒储备液作为阳性对照。
	<ol>
		<li>可选：可增设一个相关虫媒病毒（如登革病毒，DENV）的特异性对照反应。根据样本类型，按照步骤2所述方法制备样本，将2.0 µL特异性对照加入23.0 µL RT-LAMP预混液中，置于200 µL PCR管内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用加热块、水浴或热循环仪，在61 °C下加热样本30分钟。</li>
	<li>在80 °C下加热10分钟，使聚合酶失活。</li>
</ol>
5. RT-LAMP 分析
注意：在独立的封闭空间内进行RT-LAMP分析。
<ol>
	<li>孵育结束后，通过观察颜色变化来目视判断RT-LAMP反应结果。
	<ol>
		<li>将荧光核酸染料用TAE缓冲液（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA）按1:10比例稀释。 
		警告：所有核酸染料均可与核酸结合，因此具有致癌性。操作时需佩戴手套。</li>
		<li>向12 µL RT-LAMP反应产物中加入2 µL稀释后的荧光核酸染料。 
		注意：阴性反应呈橙色，阳性反应呈黄绿色。</li>
		<li>可选：使用相机在白色背景下拍摄RT-LAMP反应结果的照片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品置于302 nm紫外光下，通过荧光信号确认RT-LAMP产物的存在，并用相机拍摄结果。 
	注意：阳性RT-LAMP反应会产生荧光信号。 
	警告：使用紫外光时需佩戴防紫外线护目镜或面罩。</li>
	<li>可选：通过凝胶电泳进一步确认RT-LAMP产物的存在。
	<ol>
		<li>用含核酸染料的1x TAE缓冲液制备2%琼脂糖凝胶，以便观察。 
		警告：所有核酸染料均可与核酸结合，因此具有致癌性。操作时需佩戴手套。</li>
		<li>在第一泳道加入5 µL DNA Marker，用于比较分子量。</li>
		<li>对每个RT-LAMP反应样品，取13 µL反应混合物与2 µL DNA上样染料混合，然后上样15 µL含上样染料的混合液。</li>
		<li>以90 V电压电泳90分钟，或直至条带分离清晰，再用302 nm紫外光成像。 
		注意：阳性RT-LAMP反应呈现梯状条带（阶梯型条带），阴性RT-LAMP反应应无任何条带。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 废弃处理
<ol>
	<li>将RT-LAMP反应产物放入双层密封袋中处理。请勿进行高压灭菌，因为这可能导致RT-LAMP产物气溶胶化，从而引起未来检测中的假阳性反应。</li>
</ol>

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</ol>

LEL 和 MBC 在寨卡病毒诊断方法方面拥有知识产权。其余作者无竞争利益。

本文所述的ZIKV RT-LAMP检测方法适用于人源和蚊源样本6。其检测下限约为1个基因组当量6，这已足够灵敏，因为有症状的ZIKV感染患者的典型病毒载量为103 至&#160;106 PFU/mL7。此外，该方法可在无需预先提取RNA且无需通过细胞培养扩增病毒的情况下检测样本中的ZIKV。与qRT-PCR相比，该方法显著缩短了检测时间，降低了成本和生物安全风险。
按照本方案中指定的体积比例使用的尿液样本，应可在无需进行RNA提取的情况下进行RT-LAMP反应。尽管理论上可以增加RT-LAMP反应中样本的用量，但在使用尿液时应格外谨慎。尿液含有多种可能抑制PCR反应的化学物质；其中尿素已被证实可降解聚合酶8，若尿液与RT-LAMP反应体系的比例过高，将导致RT-LAMP反应无法进行。如果预期病毒含量较低，则建议使用专用于尿液的试...

2015年，寨卡病毒（ZIKV）因与妊娠期感染相关的严重后果而受到全球广泛关注，包括流产、死产、严重的神经系统出生缺陷（如小头畸形）以及其他先天性出生缺陷1。在极少数情况下，ZIKV感染还与吉兰-巴雷综合征相关。ZIKV主要通过伊蚊属（Aedes）蚊子传播，但也可通过性接触传播1。由于大多数ZIKV感染者无症状，或仅表现为轻微的流感样症状，且这些症状与其他虫媒病毒感染的症状重叠1，因此亟需改进快速、经济高效的ZIKV检测方法，以对人群和当地蚊虫种群进行筛查。
定量逆转录PCR（qRT-PCR）是检测寨卡病毒（ZIKV）的可靠方法；然而，该技术需要昂贵的专业设备、经过培训的技术人员，以及从待测样本中提取RNA。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）是一种基于PCR技术的单步核酸扩增方法，由于使用了具有链置换特性的嗜热DNA聚合酶，仅需一个恒定的孵育温度即可完成反应。这避免了对热循环仪的需求，并缩短了检测所需的时间。RT-LAMP的其他优势还包括高特异性和高灵敏度、在不同pH值和温度条件下均具有良好的稳定性，以及对多种PCR抑制物具有较强的耐受性2。该方法成本相对较低，且试剂在室温下稳定。鉴于这些特点，RT-LAMP既可在实验室中应用，也可用于现场检测。因此，目前已开发出多种LAMP反应，用于检测多种病原体及其他类型的感染3,4,5。本文所述RT-LAMP方案的目标是在30分钟内，无需RNA提取步骤，直接在人血清、尿液样本以及单只感染蚊虫中检测ZIKV。该方法可作为qRT-PCR的替代方案，是一种灵敏、快速的诊断工具，适用于实验室以外的多种环境，且检测速度快。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Bst&lt;/em&gt; 2.0 WarmStart DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td><td></td></tr><tr><td>等温扩增缓冲液&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx 逆转录酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>Antarctic 热不稳定 UDG</td><td>New England Biolabs</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP 溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0440S</td><td>脱氧核苷酸混合物 N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dCTP 溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0441S</td><td>脱氧核苷酸混合物 N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dTTP 溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0443S</td><td>脱氧核苷酸混合物 N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dGTP 溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td>脱氧核苷酸混合物 N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dUTP 溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I 核酸凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>低分子量 DNA 标准 Marker</td><td>Invitrogen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>寨卡病毒阳性对照</td><td>德国罗伯特·科赫研究所</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice 凝胶上样缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>10816015</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制寡核苷酸</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Ambion</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>尿液保存剂</td><td>Norgen Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV PCR 标准品</td><td>罗伯特·科赫研究所</td><td>N/A</td><td>Vero E6 细胞上清液</td></tr><tr><td>DENV2 New Guinea C 对照</td><td>康涅狄格州农业实验站</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

尿液、血清和蚊虫样本中寨卡病毒及看家基因的逆转录-环介导等温扩增（rt-lamp）检测

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

成人在感染寨卡病毒（ZIKV）后可能无明显症状，但在妊娠期间感染则可能导致流产及严重的神经系统出生缺陷。本实验方案的目标是快速检测人源和蚊源样本中的ZIKV。目前ZIKV检测的金标准是定量逆转录PCR（qRT-PCR）；而逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术则可能实现更高效、低成本的检测，且无需昂贵的仪器设备。本研究在30分钟内直接对多种生物样本进行RT-LAMP检测ZIKV，无需预先从样本中提取RNA。该技术已应用于ZIKV感染患者的尿液、血清以及感染蚊虫样本的检测。在人源样本中以18S核糖体核糖核酸作为对照，在蚊源样本中则以肌动蛋白（actin）作为对照。

RT-LAMP 反应可通过三种不同方法进行分析。首先，加入荧光核酸染料后，阳性反应肉眼可见呈黄绿色，而阴性反应呈橙色。其次，在紫外光激发下，含有荧光核酸染料的 RT-LAMP 反应会产生荧光信号；阴性反应则不会产生可检测的荧光信号，即使阴性对照中可能存在微量背景荧光。最后，可将 RT-LAMP 反应产物在琼脂糖凝胶上电泳分析。阳性 RT-LAMP 反应呈现条带模式，而阴性反应无 DNA 条带。这三种分析方法的示例如图 2和3所示。这些样本在进行 RT-LAMP 前均未提取 RNA。图 1展示了将整只蚊子在 PBS 中研磨，该处理足以用于 RT-LAMP 反应。在图 2中，展示了 ZIKV RT-LAMP 反应的特异性：仅 ZIKV 分子对照呈阳性反应，而 DENV 分子对照和阴性对照均无阳性反应。此外，在已知感染 ZIKV 患者的尿液和血清中均检测到 ZIKV，...

本方案提供了一种高效且低成本的方法，通过反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）检测人尿液和血清样本或蚊虫中的寨卡病毒或对照目标。该方法无需RNA提取，可在30分钟内完成。

尿液、血清和蚊虫样本中寨卡病毒及看家基因的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测

寨卡病毒（ZIKV）感染在成人中可能无症状，但在孕期感染可导致流产和严重的神经系统出生缺陷……

该方法可快速检测样本中是否含有寨卡病毒，适用于孕妇、备孕夫妇或对存在寨卡病毒感染风险的本地蚊虫种群进行监测。该技术的主要优势在于快速、简便，无需昂贵设备，且无需进行RNA提取步骤。该技术的应用意义延伸至寨卡病毒感染的诊断，因为孕期感染与流产、死产以及其他严重的先天性神经出生缺陷相关。尽管该方法可为寨卡病毒研究提供洞见，但通过使用病毒特异性的引物，也可将其应用于登革热、基孔肯雅热或西尼罗病毒等其他传染病。首先，用分子级水重悬每种RT-LAMP引物，使其终浓度为100 µmol/L。短暂涡旋混匀引物溶液，确保溶液均匀。以最大转速离心约五秒钟，收集引物溶液。然后按照技术手册中表二的说明配制10x RT-LAMP引物混合液。涡旋振荡以确保溶液均匀。然后以最高速度短暂离心，避免任何损失。引物在使用期间应保存于零下20摄氏度，避免反复冻融。对于人尿液样本，可使用新鲜尿液、冷冻尿液或含防腐剂的尿液。使用前需将任何冷冻样本置于冰上解冻。人血清样本应为新鲜或冷冻样本，而寨卡病毒（ZIKV）感染的细胞系则应包含条件培养基或细胞裂解物。最后，对于埃及伊蚊，使用完整的尸体，可以是新鲜的或冷冻的。将任何冷冻的蚊虫尸体在冰上解冻。将一只蚊虫放入 100 µL 的 PBS 中。使用 P10 移液器枪头将蚊子碾压 10 次，并进行匀浆以制备粗制蚊子裂解液。短暂离心粗制裂解液，使残渣沉淀，取上清液用于后续 RT-LAMP 分析。实验开始时，根据技术手册中表三的说明，为每种待用引物组在冰上配制 RT-LAMP 预混液反应体系。涡旋混匀每个样品，确保充分混合，然后短暂离心以防止液体损失。对于每个反应，用移液器将23.0 µL的RT-LAMP预混液加入到200 µL的PCR管中。然后加入 2 微升样品，使总体积达到 25.0 微升。阴性对照使用分子生物学级水，并确保包含阳性对照。可选地，根据技术方案中的说明，加入相关虫媒病毒（如登革病毒）的特异性对照反应。使用加热块、水浴或热循环仪，将样品在 61 摄氏度下加热 30 分钟。随后，将温度升至 80 摄氏度，持续 10 分钟，以热失活聚合酶。在独立的封闭空间内进行 RT-LAMP 分析。将荧光核酸染料用TAE缓冲液按1:10稀释。取2 µL稀释后的荧光核酸染料溶液加入12 µL的RT-LAMP反应体系中。通过观察是否发生颜色变化，目视评估RT-LAMP反应结果。可选地，使用相机在白色背景下拍摄RT-LAMP反应的照片。随后，将样品置于302纳米紫外光下，通过荧光确认RT-LAMP产物的存在。使用相机拍摄结果照片。开始进行电泳时，用含有核酸染料以供观察的1x TAE缓冲液配制2%琼脂糖凝胶。在第一泳道中加入5微升DNA Marker，用于比较分子量。对于每个RT-LAMP反应，将13微升RT-LAMP反应混合液与2微升DNA上样染料混合。加入15微升该混合物。以90伏电压电泳90分钟，或直至条带分离。使用302纳米紫外光成像。实验结束后，将RT-LAMP反应产物置于双层密封袋中处理。本研究采用三种不同方法分析RT-LAMP反应结果。使用荧光核酸染料时，阳性反应呈黄绿色，而阴性反应呈橙色。当样品被紫外光激发时，该染料也会产生荧光信号。最后，可将RT-LAMP反应产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分析。阳性RT-LAMP反应会出现条带模式，而阴性反应则无DNA条带。这些方法用于验证寨卡病毒（ZIKV）RT-LAMP反应的特异性。仅寨卡病毒（ZIKV）分子对照呈现阳性RT-LAMP反应。此外，在已知感染寨卡病毒（ZIKV）的患者中，尿液和血清样本均可检测到寨卡病毒（ZIKV），而在无寨卡病毒感染的无症状对照患者中则未检测到该病毒。随后对样本进行人源18S rRNA检测。只有来自患者的样本显示18S rRNA阳性。蚊虫样本同样可被检测是否存在寨卡病毒（ZIKV）或RT-LAMP质量控制AEDAE。仅观察到寨卡病毒（ZIKV）的阳性分子对照以及感染了ZIKV的蚊虫对ZIKV检测呈阳性。然而，所有蚊虫的RT-LAMP检测中AEDAE均为阳性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在30分钟内完成。需要牢记的是，RT-LAMP 反应容易出现假阳性结果。预防措施包括在反应中使用热不稳定尿嘧啶 DNA 糖基化酶、采用单向工作流程、在独立空间内进行分析，以及减少扩增后打开管盖的时间。完成本操作后，可进一步采用其他方法（如定量 PCR）来回答更多问题，例如病毒或其他靶标在样本中的拷贝数。 观看本视频后，您应充分了解如何使用 RT-LAMP 在人类尿液、血清以及蚊虫样本中检测寨卡病毒及靶标对照。请注意，操作寨卡病毒和核酸染料具有极高危险性，进行该实验时必须采取防护措施，例如佩戴手套。鉴于寨卡病毒感染与先天性异常存在关联，孕妇、备孕女性及其伴侣应尽可能减少在实验室中接触寨卡病毒。

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科研

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遗传学

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