Name: 用于疾病建模的人三维肺组织培养 (3D-LTCs) 的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学习使用低熔点琼脂糖灌注和振动切片技术制备人三维肺组织培养物，用于离体模拟肺部疾病并分析早期病理机制。该方法支持基因表达检测和药理学研究。

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作者感谢Marisa Neumann提供的专业技术支持。所有肺组织均由CPC-M生物样本库慷慨提供。本研究工作得到了德国肺研究中心（DZL）、亥姆霍兹协会以及CPC研究学院资助项目的支持。

本研究使用的人体组织已获得路德维希-马克西米利安大学伦理委员会批准［德国慕尼黑（项目编号 455-12）］。无肿瘤的人肺组织切除样本由阿斯克勒庇俄斯肺部疾病生物样本库（德国高廷，项目编号 333-10）提供。
注意： 所有人类PCLS制备步骤（图1）均在无菌超净工作台中进行。
1. 仪器与材料的准备
<ol>
	<li>按以下所述准备用于肺组织琼脂糖灌注的所有材料。
	<ol>
		<li>制备培养基：在DMEM/F-12培养基中添加L-谷氨酰胺、HEPES、10,000 IE青霉素、10,000 IE链霉素和0.1%（v/v）胎牛血清。 
		注意：培养基使用温度为37 °C。</li>
		<li>准备一个覆盖有滤纸的无菌金属托盘，并在托盘上放置一个无菌的15 cm细胞培养皿。</li>
		<li>向细胞培养皿中加入15 mL培养基。</li>
		<li>通过将适量低熔点琼脂糖溶解于至少30 mL培养基中，配制3%（w/v）的琼脂糖溶液。</li>
		<li>将溶液放入微波炉加热至沸腾，随后在水浴中冷却至42 °C，并将液态琼脂糖溶液保持在水浴中备用。</li>
		<li>准备多个装有液态琼脂糖的50 mL锥形管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 切除的肺组织
<ol>
	<li>肺叶切除标本切除后，立即将新鲜无肿瘤的肺组织置于DMEM F-12培养基中，4 °C保存，直至进行第3步操作。</li>
	<li>处理前的冷缺血时间不得超过4–8小时。</li>
</ol>
3. 琼脂糖灌注前切除组织的检查与选择
<ol>
	<li>用镊子将组织从培养基中提起。为避免对组织（尤其是胸膜）造成任何损伤，仅可在气道处用镊子夹取组织。</li>
	<li>根据表1中定义的肺部琼脂糖填充评分标准对组织质量进行评分。</li>
	<li>若组织质量评分大于或等于72，则继续进行第4步。若组织质量评分低于60，则不应继续进行琼脂糖填充。 
	注意：若组织评分为60至68之间，仍有可能获得较为理想的琼脂糖填充和组织切片结果，是否继续实验需根据具体情况个案决定。然而，未达到上述要求的肺组织在琼脂糖填充过程中通常会失败。</li>
</ol>
4. 通过琼脂糖填充使肺组织膨胀
<ol>
	<li>将组织从保存液中取出，并沥干多余的液体。将肺组织转移至步骤1.1.2中准备好的15 cm培养皿中。</li>
	<li>用30 mL注射器吸取步骤1.1.3中的低熔点琼脂糖。</li>
	<li>通过移除穿刺针芯准备一个外周静脉导管，并将其连接到30 mL注射器上。</li>
	<li>在组织中识别一个直径为0.5–3 mm的支气管，该支气管应通向组织中结构完整的区域（见图2）。</li>
	<li>将套管插入选定的支气管（直径0.5–3 mm）。</li>
	<li>轻柔地向前推进套管，尽可能深入。</li>
	<li>用镊子夹紧套管周围的支气管壁，以密封套管与支气管之间的间隙，理想情况下同时夹闭邻近的肺动脉。</li>
	<li>使用外科夹闭器封闭其他额外的气道，防止琼脂糖从这些气道泄漏。</li>
	<li>用镊子将组织从培养皿中提起。</li>
	<li>手动通过注射器注入琼脂糖，速度不得超过0.3 mL/s。由于气道阻力不均和/或肺不张的存在，琼脂糖填充速度可能在约0.05至0.3 mL/s之间变化。</li>
	<li>若在填充过程中观察到高阻力或琼脂糖从组织中泄漏，请从步骤4.4开始更换不同的支气管重试整个操作。按以下所述进行故障排除。 
	注意：琼脂糖填充程度高度依赖于导管在组织中的位置，导管深入插入会导致琼脂糖仅填充肺组织中较小的圆锥状区域（*）（图2C）。
	<ol>
		<li>若遇到高阻力，尝试调整导管位置，以实现组织大部分区域（#）的充分填充（图2D）。</li>
		<li>若近端支气管内出现早期凝固的琼脂糖栓子或其他气道阻塞（箭头），可能导致组织填充不完全（图2E），此时不应强行推进琼脂糖填充，因为这可能造成已填充区域的损伤，而无法填充受阻部分的组织。</li>
		<li>若在切除过程中，由插管支气管引出的呼吸道结构受损，导致液态琼脂糖持续泄漏（图2F中箭头），应将导管插入气道系统的更远端部位，以至少填充组织的一小部分（*）（图2G）。此外，使用外科夹闭器封闭受损的远端气道（箭头）（图2H）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续注入琼脂糖，直至肺组织完全填充。切勿过度膨胀组织，以免对组织结构及其细胞造成不可逆损伤。</li>
	<li>立即夹闭用于填充的支气管。在夹闭前先移除套管。</li>
	<li>将组织置于4 °C的培养液中孵育30分钟，以确保琼脂糖充分凝固。</li>
	<li>若切除的组织具有多个支气管入口，则重复步骤4.2至4.13，直至所有组织部分均被琼脂糖填充。</li>
	<li>将填充了琼脂糖的肺组织切片保存于4 °C的冷培养液中，直至进行切片处理。</li>
</ol>
5. 精密切割肺组织切片
<ol>
	<li>确定肺组织中被琼脂糖完全填充的区域。当用镊子轻轻按压细胞培养皿底部时，完全填充的区域不会塌陷。
	<ol>
		<li>切取第5.1步所述区域的1-1.5 cm3组织块，其中一侧仍应保留胸膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用氰基丙烯酸酯胶水将每个组织块的胸膜面朝下固定在振动切片机的持样器上。 
	注意：胸膜具有轻微弹性，因此会妨碍振动切片刀的切割。将胸膜面朝下放置在持样器上可避免干扰切割过程，更重要的是，可在氰基丙烯酸酯胶水与肺实质组织之间形成天然屏障，从而最大限度减少胶水向组织内的扩散。</li>
	<li>使用振动切片机对肺组织进行切片，设置参数如下：切片厚度：500 µm，振动频率：100 Hz，刀片振幅：1.2 mm，刀片前进速度：3-12 µm/s（根据组织硬度调整）。若切片未能完整切下，或组织块本身开始振动，应降低刀片的进刀速度。</li>
	<li>用镊子轻轻将切片从振动切片机托盘中提起，转移至盛有培养基的12孔板中的一个孔内。最后，将肺组织切片置于培养箱中，在标准细胞培养条件下进行孵育。</li>
	<li>当组织块剩余未切部分为2-3 mm时，停止切片，因为氰基丙烯酸酯胶水可能已影响该区域组织的完整性。</li>
</ol>
6. PCLS 穿孔的制备
<ol>
	<li>将单个孔中的肺组织切片转移至一个空的10 cm培养皿中。</li>
	<li>将4 mm活检打孔器垂直置于PCLS的上表面，开始顺时针和逆时针旋转打孔器。</li>
	<li>向96孔板的各孔中加入细胞培养基。用镊子夹起组织穿孔样本，并将其转移至96孔板的孔中。最后，在细胞培养箱中，于标准条件下（21% (v/v) 氧气、5% (v/v) 二氧化碳、95%湿度，37 °C），将肺组织穿孔样本浸没于步骤1.1.1中制备的培养基中进行培养。</li>
</ol>
7. 组织培养与样品收获
<ol>
	<li>将PCLS及组织穿刺样本在标准细胞培养条件下于培养箱中培养过夜。</li>
	<li>在PCLS及穿刺样本制备后最多培养120小时，以确保细胞活力和功能，培养条件应符合前述规定。</li>
	<li>如需收获蛋白质和RNA，用磷酸盐缓冲液（PBS）将PCLS及穿刺样本清洗三次，转移至冻存管中，并在液氮中速冻。</li>
	<li>收集培养后的PCLS穿刺样本的培养基上清，用于分泌蛋白的分析。
	<ol>
		<li>进行组织学分析时，用PBS清洗PCLS及穿刺样本三次，随后加入4%多聚甲醛，在37 °C孵育30分钟进行固定。最后将PCLS置于4 °C的PBS中保存，以备后续染色分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均声明不存在竞争性财务利益。

本论文所述方案涵盖了通过将液体琼脂糖注入人肺组织切除样本并随后使用振动切片机切片来制备肺组织切片（PCLS）的方法。此前已有报道在肝脏和脑等若干器官中成功制备组织切片，这些器官本身较坚硬，因此无需对组织进行任何处理即可直接切片。值得注意的是，肺组织的初始正确处理是制备PCLS最关键的步骤。琼脂糖灌注是稳定肺组织柔软且富有弹性特性的首选方法，可确保PCLS制备的均一性和可重复性。需对切除肺组织的主气道进行插管，以通达小气道及完整的肺实质。由于缺乏完整的胸膜会导致琼脂糖灌注几乎无法进行，这是肺组织大多不适用于切片的主要原因。未来，一种最初为去细胞化支架上功能实验设计的合成胸膜，可能被用于实现缺乏完整胸膜的肺移植物的成功琼脂糖灌注31。具有完整胸膜的人肺组织切除样本是制备可用于切片的组织块的必要条件。相较于接受肺移植患者的完整肺叶或全肺移植物，因肿瘤切除而获得的无瘤肺组织更为易得，因此可用于实验的切除组织更为充足。
通常有两种系统用于制备PCLS：Krumdieck组织切片器15和振动切片机（vibratomes）。组织切片器通过将组织块穿过一个金属腔室，在腔室末端以90°角度切割产生PCLS。振动切片机则通过在固定并浸没于冷却介质浴中的组织块上水平移动振动刀片来制备PCLS，与Krumdieck切片器相比，其对组织施加的剪切力更小，从而在培养前对组织的损伤更轻。然而，振动切片过程更耗时且劳动强度更高。在我们的操作中，使用振动切片机每天最多可制备100个PCLS或500个PCLS打孔样本，这已足以满足大多数实验研究的需求。PCLS可通过多种方式培养：（a）贴附于Trans-well上，从而形成气液界面（ALI）系统；（b）采用动态器官培养（DOC）方式；或（c）在标准细胞培养条件下浸没于细胞培养基中。PCLS的具体培养方法已有文献报道22,23,25；然而，目前全球各实验室在PCLS培养条件方面仍缺乏统一标准。特别是培养时间可能尤为关键：在小鼠PCLS中，144小时后可观察到SFTPC阳性的肺泡II型细胞减少，而120小时后尚未出现此现象22。此外，代谢活性在小鼠22和人源PCLS25中似乎均可维持稳定达120小时。
PCLS 制备存在一些技术局限性：切除组织的数量和大小随时间变化较大；琼脂糖填充效率取决于所获取组织中胸膜是否完整，这将直接影响 PCLS 制备的最终成功率；此外，所获取的病变肺组织中因病理改变导致的组织破坏也可能干扰 PCLS 的制备。气道阻塞以及缺乏完整肺泡结构的纤维化组织会阻碍琼脂糖的填充，从而使纤维化组织的切片变得困难。在慢性阻塞性肺疾病（COPD）或α-1抗胰蛋白酶缺乏症等疾病中常见的肺气肿组织可能无法承受琼脂糖填充时的压力，导致肺泡破裂并产生结构伪影。在此类情况下，使用较低浓度的琼脂糖，例如, 1%（w/v）的琼脂糖浓度可能有助于在填充琼脂糖时降低压力和速度。总体而言，组织的疾病状态会显著限制其用于肺组织片（PCLS）的制备。上述所有参数共同决定了从肺组织中可生成的PCLS数量以及制备所需的时间。PCLS的其他局限性还包括不同肺切片之间在大小或组织成分上的不一致性，这需要在实验中进行额外的归一化处理。为克服这一问题，可从同一组织切片的相似区域打取活检穿孔样本。该方法能够有效减少组织间的变异性，并且额外优势在于可增加可用于实验的PCLS样本数量。
综上所述，由琼脂糖填充的PCLS构建的人类三维肺组织培养模型为研究肺生理学和肺部疾病提供了一个复杂的人源模型。本方案详细描述了从切除的肺组织制备PCLS及其培养的具体步骤，此外还探讨了在人类肺组织切除标本中进行琼脂糖填充时面临的技术挑战及相应的解决方案。

慢性与急性肺部疾病是全球范围内导致发病和死亡的主要原因1。对于患有慢性阻塞性肺疾病（COPD）2、重度哮喘3、肺癌4以及弥漫性肺实质疾病5等慢性肺病的患者，目前尚无根治性疗法。尽管动物模型在肺部疾病研究中加深了人们对疾病病理机制的理解6，并有助于识别潜在的新型治疗靶点7,8,9，但这些模型与人类相比存在显著的生物学和生理学差异10。为了克服小鼠与人类在生物学及解剖结构上的差异，人类离体三维肺组织培养（3D-LTC）系统已被广泛应用于生物医学研究的多个领域。这些3D-LTC培养系统基于精密切割肺组织片（PCLS）。体外生成PCLS可实现对第三空间维度的分析，从而能够研究整个肺泡、气道11以及间质、血管系统和间皮层中细胞的空间与功能关系。值得注意的是，PCLS体外模型为多细胞体系，包含原位肺组织中的大多数功能性细胞，因而能更真实地模拟细胞的天然生物学环境，克服了大多数二维细胞培养方法中细胞间及细胞-基质相互作用受限的问题。迄今为止，体外小鼠PCLS已被用于模拟多种肺部疾病，如COPD12、肺纤维化13、肺癌14、病毒感染15,16、支气管肺发育不良17和哮喘18。然而，在临床试验中研究的许多针对人类肺部疾病的新药疗法，由于疗效不足或安全性问题而未能成功转化至临床应用，这可能归因于人类与小鼠在生物学和疾病特征方面仍存在较大差异19,20,21。
多年来，人肺组织切片（PCLS）已广泛用于评估化学物质和药物的肺毒性。直到最近，才开始采用慢性阻塞性肺疾病（COPD）22，23、哮喘24和肺纤维化25患者来源的人肺组织，开展病理生理学和药理学研究。通过利用手术切除的患者器官组织并制备相应的PCLS，可以在复杂的三维组织环境中重现主要的疾病特征22，同时保留器官中大部分天然的细胞多样性。此外，已有研究表明，在多种实验体系中应用病变组织可模拟肝脏、肠道和肾脏中的疾病样改变26，27，28，29。
然而，肺组织的处理因多种原因仍具挑战性。与实体组织不同，天然肺实质在无通气情况下容易塌陷，且组织硬度较低。这些特性阻碍了组织的切片。因此，使用低熔点琼脂糖填充气道和肺泡腔，可维持天然肺结构，并为小鼠和人肺组织的精密切片提供所需的硬度30。用于研究的人肺切除组织在本质上具有高度的解剖学、遗传学和生理学异质性，因此在实验中常表现出较高的个体间差异25。与整叶或整肺外植体不同，通过胸外科手术切除的肺组织样本不一定遵循解剖分段，因此需要特殊的制备方法。本文提供了一种详细且优化的实验方案，用于从切除的肺组织制备人肺组织切片（PCLS），并对其进行后续培养和实验应用，以建立肺部疾病模型。

<table><tbody><tr><td>振动切片机 Hyrax V50</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Hyrax CU 65</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Vasofix Braun&amp;uuml;le 18 G</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>4268130B</td><td></td></tr><tr><td>30 mL NORM-INJECT</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4830001000</td><td></td></tr><tr><td>带保护刃的 disposable 手术刀，无菌</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loctite 406</td><td>Henkel</td><td>LOCTITE 406</td><td></td></tr><tr><td>合成单晶蓝宝石刀片</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F-12 营养混合物（Ham）+ L-谷氨酰胺 + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>特殊工艺胎牛血清（Sera Plus）</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3702</td><td></td></tr><tr><td>一次性活检打孔器</td><td>pfm medical</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑色/透明，组织培养处理板，平底带盖，无菌</td><td>Falcon / Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

用于疾病建模的人源三维肺组织培养物（3d-ltcs）的构建

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

将新发现转化为人类疾病研究的应用受到基于人体组织的疾病模型可及性的限制。用作三维肺组织培养物（3D-LTCs）的精密切割肺切片（PCLS）是一种精巧且生物学高度相关的三维细胞培养模型，其高度模拟 由于其复杂的结构、生物力学特性和分子组成，原位组织的研究具有挑战性。组织切片技术已广泛应用于多种动物模型。源自人肺组织切片（PCLS）的三维肺组织培养物（3D-LTCs）可用于分析新型药物的反应，有助于更深入理解药物在人体组织中的作用机制及功能效应。通过手术切除肺癌患者肺叶所获取的肺组织样本制备PCLS，可提高获取病变组织及瘤周组织的可及性。本文介绍了一种从手术切除的软弹性人肺组织样本制备PCLS的详细实验方案。将琼脂糖注入切除组织的支气管肺泡腔内，以维持肺组织结构并增加组织硬度，这对后续切片至关重要。使用振动切片机从组织块中制备厚度为500 µm的切片。从PCLS上打取组织活检穿孔样本，可确保组织样本尺寸一致，并进一步增加可用样本数量。所获得的肺组织培养物可广泛应用于人类肺生物学的多种研究，包括不同疾病的病理生理学机制，尤其适用于在（亚）细胞水平上研究纤维化等病理过程。3D-LTC的最大优势在于 离体 该模型能够高度模拟人体肺部的三维组织结构、细胞类型多样性及肺部解剖特征，并具备对个体患者组织进行评估的潜力，这对于进一步开发精准医疗新策略具有重要意义。

肺组织切片（PCLS）制备 
肺组织切片（PCLS）的制备可分为四个关键步骤：肺组织手术切除、琼脂糖灌注、基于振动切片机的PCLS制备以及PCLS的培养。切除的肺组织需灌注低熔点琼脂糖，以增加组织硬度便于切片，同时维持肺组织的天然结构与构架。值得注意的是，PCLS制备过程耗时较长，因此常可将灌注琼脂糖后的肺组织在DMEM F-12培养基中过夜保存，次日再继续进行切片操作。根据后续实验设计的不同，制备所得的PCLS可在含0.1%（w/v）胎牛血清的标准细胞培养基中孵育过夜，之后再施加实验处理条件。在本方案所述的培养条件下，三维肺组织培养物（3D-LTCs）可保持活力长达120小时22，并表现出细胞功能活性（如表面活性蛋白分泌）（图1），若进一步优化培养条件，其存活时间与功能可能进一步提升。
琼脂糖灌注 
为向组织内灌注琼脂糖，将连接在盛有琼脂糖溶液的注射器上的外周静脉导管套管（直径1.3 mm）插入切割组织表面的支气管内（图2A）。支气管通常位于肺动脉附近。动脉管壁较薄且易于塌陷，而支气管则具有清晰可见的管腔。根据组织的完整性，导管可沿呼吸道树逐级深入至肺外周区域。使用镊子在套管周围封闭已穿刺的支气管（图2B），同时可用镊子夹闭肺动脉。随后将组织抬起，缓慢将液态琼脂糖灌注至气道中。
根据导管的位置，大部分组织可能被液体琼脂糖填充（图2D）。可选地，肺实质中呈圆锥形的部分——即由插入的支气管所通气的区域——也可能被琼脂糖填充（图2C）。在这两种情况下，均可观察到组织区域被牢固填充的特征性模式：第一种情况是组织的大部分以楔形方式被填充（图2D）；第二种情况是出现较小的、突出的圆形区域，其组织被充分填充（图2C）。如果由于琼脂糖凝块或其他原因导致气道部分阻塞，则部分组织可能无法被琼脂糖充分填充，因此仅有部分组织适用于切片。在琼脂糖灌注过程中若发生泄漏，已灌注的呼吸道部分可能被穿孔，从而使肺组织的灌注几乎无法进行。可能的应对方法包括通过更外周的支气管进行灌注、将套管更深地插入远端气道（图2G），或对泄漏区域进行潜在的夹闭处理（图2H）。
精密切割肺组织切片 
从完全充满凝固琼脂糖的组织区域中切取大小为 1-1.5 cm 的组织块 (图 3A-3B)。随后，将各个组织块粘附于振动切片机的组织固定装置上（图 3C）。以 3–12 µm/s 的推进速度在振动切片机上切割生成厚度为 500 µm 的肺组织切片（PCLS）（图 3D-3F）。最后，将 PCLS 浸没于含有 0.1% (w/v) 胎牛血清的细胞培养基中，并按照步骤 7 所述的标准细胞培养条件进行培养。
人源3D-LTC培养48小时后的实验检测结果 
代表性免疫荧光染色结果如Alsafadi等25先前所述，见图4A-4C。纤维连接蛋白（红色）和细胞核（DAPI，蓝色）的免疫标记可用于体外人源3D-LTC中肺泡结构的成像观察。将人源PCLS组织块用促纤维化细胞因子混合物（包括转化生长因子β1、血小板源性生长因子AB、脂磷脂酸和肿瘤坏死因子α）处理48小时后，人源3D-LTC中出现类似纤维化的改变。通过qPCR检测发现，经促纤维化混合物处理后，3D-LTC组织块中与纤维化相关的细胞外基质成分——I型胶原和纤维连接蛋白基因——表达显著上调（图4D）。此外，在4名患者中的3名，3D-LTC组织块经处理后，间充质标志物波形蛋白的蛋白水平也呈现上调（图4E）。
<img alt="PCLS 制备流程示意图，包括组织切除、琼脂糖填充及培养时间线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：PCLS 制备工作流程。 对肺组织切除样本中无肿瘤区域进行彻底检查，以评估其组织完整性。若组织经评分判定适合后续使用（评分标准详见材料与方法部分），则进一步注入液态琼脂糖。待琼脂糖凝固后，将组织块使用振动切片机进行切片。所得三维肺组织切片（3D-LTC）置于细胞培养基中，自制备起可培养长达 120 小时。对 3D-LTC 的后续分析包括蛋白质或 RNA 表达检测、活体组织荧光成像，以及组织固定后的免疫荧光染色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="肺解剖实验示意图，显示通过注射器向动脉和支气管注射以进行分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：用低熔点琼脂糖填充肺组织。 肺组织通过外周静脉导管插管，该导管插入邻近肺动脉的支气管中图2A）。使用镊子将套管固定在支气管中，并夹闭肺动脉以防止液态琼脂糖泄漏。液态琼脂糖在 42 °C 用30 mL注射器将液体注入肺组织（图2B）。灌注过程中若导管位置偏远端，则会导致灌注组织区域较小（图 2C），而近端放置则可确保更大组织体积的灌注图 2D）。气道的任何阻塞都会减少可充气的组织容积（图2E若出现琼脂糖泄漏，可通过远端套管定位和/或夹闭泄漏侧，以实现琼脂糖对肺组织的充分灌注。 (图 2F-2H. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织切片：A-D 组织修整；E 切片机设置；F 所得组织切片；组织学制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：精密切割肺组织切片。 使用手术刀从成功灌注琼脂糖的肺组织中切取一块组织（1 cm × 1.5 cm × 1 cm）（图 3A）。随后将切下的组织块粘附于组织固定夹上，比例尺表示 1 cm（图 3B）。理想情况下，应将组织的胸膜面朝下粘附于组织固定夹表面，如 图 3C 所示。使用振动切片机配合蓝宝石刀片，以相对于组织 10°–15° 的角度切割出厚度为 500 µm 的切片（图 3D 和 3E）。该切片过程可获得大小约为 2–3 cm3 的完整肺组织切片，比例尺 = 5 mm（图 3F）。此外，通过使用活检打孔器，还可制备直径为 4 mm 的小型、可重复的组织圆片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，蛋白质表达分析，纤维化效应，比较图表，Western印迹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：人源3D-LTC培养48小时后的实验结果。 对直径为4 mm的人源3D-LTC组织芯进行纤维连接蛋白（红色）和DAPI（蓝色）免疫染色 (图4A-4C)。比例尺 = 1,000 µm。图4C 显示合并图像。通过定量RT-PCR对PCLS进行RNA分析，结果显示促纤维化混合物处理显著上调了COL1A1和FN1基因的表达25。图4E 显示了经纤维化混合物处理后PCLS全蛋白裂解液的免疫印迹结果25。使用波形蛋白（Vimentin）和β-肌动蛋白（β-Actin）进行检测，表明在患者样本1、3和4中，经促纤维化因子处理后，间充质标志物（波形蛋白）的蛋白质表达水平升高。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标准</td>
			<td>分值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本具有完整的胸膜表面。</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本肉眼观察完整，无切口、挤压、破裂或变形。</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本包含至少一个直径 >1mm 的支气管。</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本无或仅有少量血液。</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本完全保存在培养基中，且无明显肺不张迹象。</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本在最近四小时内切除。</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>组织样本最大直径大于 5cm。</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总分：</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：肺组织琼脂糖填充评分。 肺组织琼脂糖填充评分（LAFS）与利用琼脂糖填充组织切除样本以进行后续振动切片机辅助PCLS制备的成功率相关。该评分汇总了组织样本所满足的各项标准的得分。LAFS等于或高于72分提示琼脂糖填充性能良好，低于60分则提示组织琼脂糖填充极有可能失败。

本文介绍一种利用患者切除组织制备琼脂糖填充的人源精准切割肺片的实验方案，该肺片适用于构建三维肺组织培养模型，以用于生物学和生物医学研究中人类肺部疾病的研究。

用于疾病建模的人源三维肺组织培养物（3D-LTCs）的构建

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