Name: palt1 副酶活性对髓系先天信号通路的调控 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 探索MALT1副酶活性在髓系细胞先天免疫信号通路中的选择性调控机制。本研究利用人外周血单核细胞和小鼠脾细胞，结合特异性抑制剂MLT-827，揭示C型凝集素样受体下游细胞因子产生的独特调节方式。

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感谢Elsevier授权（许可证号4334770630127），允许在此重印Unterreiner et al. (2017)的图2A。

实验按照诺华人类研究伦理委员会的指南和标准进行。
1. 从人血沉棕黄层制备外周血单个核细胞（PBMCs）
注意： 我们在采集后一天收到健康志愿者的血沉棕黄层，置于50 mL袋中。样本经知情同意提供，并通过Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz采集。除特别说明外，所有操作均在室温下按以下程序进行处理。
<ol>
	<li>在超净工作台中准备一把无菌且洁净的剪刀和一个装有塑料袋的1 L烧杯。</li>
	<li>将血沉棕黄层转移至烧杯中，并用剪刀小心打开。</li>
	<li>使用25 mL移液管加入100 mL磷酸盐缓冲液/乙二胺四乙酸（PBS/EDTA：1× PBS，pH 7.4，不含CaCl2和MgCl2，添加2 mM EDTA，pH 8.0）。 
	注意：使用同一支移液管，缓慢吹打混匀后，将稀释后的血沉棕黄层溶液25 mL分装至6个已预先加入15 mL多糖基密度梯度液的50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>以800 × g离心20分钟，采用中等加速度（设为9档中的4档），不启用刹车，以便根据细胞密度实现分离。 
	注意：离心后可见三层结构：底部为含有红细胞和粒细胞的沉淀，上层为血浆，中间为含有外周血单个核细胞（PBMCs）的白色环状层。</li>
	<li>使用10 mL移液管收集PBMC白色环层，并转移至新的50 mL离心管中。 
	注意：通常每个血沉棕黄层需要2至3个50 mL离心管。此阶段收集的PBMC中可能含有少量血浆污染，但不会影响后续富集步骤。</li>
	<li>用PBS/EDTA将每管体积补至50 mL，并进行三次连续洗涤，离心时间和速度逐步降低（分别为520 × g离心15分钟、330 × g离心10分钟、150 × g离心8分钟）。 
	注意：每步操作中，将上清液倾入液体废弃物容器，并将细胞沉淀重悬于50 mL PBS/EDTA中（第一次洗涤后可合并细胞沉淀）。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将沉淀重悬于25 mL冰浴裂解缓冲液中（见材料表），通过渗透压裂解红细胞。</li>
	<li>孵育至溶液变澄清（室温下≤5分钟）。</li>
	<li>加入25 mL分离缓冲液（1× PBS，pH 7.4，不含CaCl2和MgCl2，添加2%热灭活胎牛血清（FBS）和1 mM EDTA，pH 8.0）以终止反应。</li>
	<li>以150 × g离心8分钟，再洗涤一次。 
	注意：此时PBMC可用于整体细胞群体实验（参见步骤3：PBMCs和单核细胞处理及刺激条件），或进行单核细胞富集（参见步骤2：从PBMCs中制备单核细胞），或冻存以备后续使用（参见步骤5：单核细胞和PBMCs的冻存与复苏程序）。</li>
</ol>
2. 从外周血单个核细胞制备单核细胞
<ol>
	<li>将步骤 1.10 中获得的 PBMCs 用分离缓冲液重悬，并计数至 5 x 107 个细胞/mL。</li>
	<li>将细胞悬液转移至带盖的 14 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>每毫升细胞悬液中加入 50 µL 单核细胞富集抗体混合液，涡旋混匀，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。</li>
	<li>每毫升细胞中加入 50 µL 单核细胞富集磁珠。 
	注意： 必须充分涡旋磁珠，以确保悬液均匀。</li>
	<li>加入磁珠后，短暂涡旋细胞悬液，并在 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>用分离缓冲液冲洗管子上部，直至总体积达到 10 mL。</li>
	<li>通过上下吹打轻轻混匀溶液。</li>
	<li>将离心管去盖后放入分离磁铁中。</li>
	<li>在室温下孵育 2.5 分钟。</li>
	<li>缓慢倾倒至 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>在此阶段，可直接使用单核细胞（参见步骤 3：PBMCs 和单核细胞的处理与刺激条件），或将它们分化为未成熟单核细胞来源树突状细胞（immature Monocyte-derived Dendritic Cells，iMoDCs）（参见步骤 4），或将其冻存以备后续使用（参见步骤 5）。</li>
</ol>
3. PBMC 和单核细胞处理及刺激条件
<ol>
	<li>计数细胞，并用培养基（RPMI 1640 培养基，含 10% 胎牛血清、1 mM 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素-链霉素和 5 µM β-巯基乙醇）稀释至每孔 1.25 × 104 个细胞。</li>
	<li>将 30 µL 细胞悬液加入 384 孔板的每个孔中。</li>
	<li>每孔加入 15 µL 4 倍浓缩的化合物溶液，在 37 °C、5% CO2 条件下预孵育 1 小时。</li>
	<li>加入脂多糖（LPS）至终浓度为 10 ng/mL，或加入去甘露糖基化酵母多糖（DZ）至终浓度为 100 µg/mL，或仅维持在基础培养基中。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。</li>
	<li>取 10 µL 上清液用于检测分泌的 TNF-α 水平（参见步骤 7：细胞因子与细胞活力检测）。</li>
</ol>
4. 单核细胞向iMoDCs的分化及刺激条件
<ol>
	<li>计数单核细胞（在步骤2中富集），并将细胞悬液在520 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，加入培养基（RPMI + 10% FBS），调整细胞浓度至最终0.4 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>加入80 ng/mL重组人IL-4和100 ng/mL GM-CSF。</li>
	<li>将5 mL细胞悬液分装至6孔板的每个孔中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2 条件下培养7天。</li>
	<li>第7天时，轻轻吹打吸液以收获细胞，避免细胞活化。</li>
	<li>在520 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>用真空抽吸去除上清液，并将细胞重悬于50 mL不含生长因子的培养基中。</li>
	<li>在520 × g 条件下离心5分钟，然后将细胞重悬于培养基中，调整浓度至1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>每孔加入100 µL细胞悬液（含105 个细胞）至96孔平底板中。</li>
	<li>加入50 µL按步骤8“化合物制备”所述配制的4倍浓缩化合物溶液后，在37 °C预孵育1小时。</li>
	<li>加入50 µL按步骤9所述配制的刺激物（4倍浓缩）。</li>
	<li>在37 °C继续孵育24小时。</li>
	<li>混匀各孔，将细胞及上清液（SN）转移至96孔V型底板中。</li>
	<li>在475 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的96孔平底板中，密封后于-20 °C冻存，待后续使用。</li>
</ol>
5. 单核细胞和外周血单个核细胞的冻存与复苏操作
<ol>
	<li>冻存
	<ol>
		<li>将PBMC或单核细胞制备物在520 × g 条件下离心5分钟。</li>
		<li>用真空泵吸除上清液，并将细胞重悬于冻存液中，浓度为1 × 107 个细胞/mL。</li>
		<li>将1 mL细胞悬液分装至冻存管中，将冻存管放入特定的程序降温盒（见材料表），然后置于-80 °C环境中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>复苏
	<ol>
		<li>将冻存管融化，并迅速将其内容物转移至含有9 mL培养基的15 mL锥形离心管中。</li>
		<li>在520 × g 条件下离心5分钟。</li>
		<li>用真空泵吸除上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL培养基中。细胞现在可用于后续实验操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 小鼠脾细胞的制备与处理
注意： 我们根据诺华动物福利组织的指南和标准进行动物安乐死。研究已获地区政府主管部门伦理委员会（Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel）批准。动物通过异氟烷过量暴露实施安乐死，全程尽一切努力减轻动物痛苦。
<ol>
	<li>取出脾脏，使用配备机械组织研磨器并装有 5 mL 冷 RPMI 培养基的试管进行组织解离。</li>
	<li>使用解离仪的脾脏程序研磨组织。</li>
	<li>通过 100 µm 尼龙细胞滤网过滤细胞。</li>
	<li>将悬液转移至 50 mL 离心管中，在 4 °C、320 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>用真空泵吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 3 mL 冰冷裂解缓冲液中，在冰上孵育 ≤2 分钟。</li>
	<li>加入 7 mL RPMI 培养基终止裂解反应。</li>
	<li>再次通过 100 µm 尼龙细胞滤网过滤。</li>
	<li>在 4 °C、330 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀细胞悬液。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于完全培养基（RPMI 添加 10% FBS、100 U/mL 青霉素/链霉素和 5 µM β-巯基乙醇）中，浓度为 11 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>在 96 孔板（平底）中每孔接种 1 × 106 个细胞（90 µL）。</li>
	<li>加入 5 µL 已用 RPMI 培养基稀释的 20 倍浓缩化合物溶液，稀释方法见步骤 8.3：小鼠脾细胞的系列稀释。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入 5 µL 20 倍浓缩的 DZ（终浓度为 30 µg/mL）或 20 倍浓缩的 LPS + IFN-γ（TLR-4）（终浓度为 1 µM LPS 和 10 ng/mL IFN-γ）。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。</li>
	<li>在 330 × g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新板中，密封后于 -20 °C 冻存，待后续使用。</li>
</ol>
7. 细胞因子与活力测定
<ol>
	<li>采用HTRF（均相时间分辨荧光）法检测人TNF-α 
	注意： 本方案遵循试剂供应商的建议，简要总结如下：
	<ol>
		<li>将1体积的复溶试剂（抗TNF-α-荧光素抗体和抗TNF-α-XL665抗体）与19体积的复溶缓冲液（50 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0，含0.8 M氟化钾（KF）和0.2%牛血清白蛋白（BSA））混合。</li>
		<li>在加样前，将两种即用型抗体溶液按1:1比例混合。</li>
		<li>取步骤3.6中的上清液10 µL，加入白色384孔板中。</li>
		<li>每孔加入10 µL抗体混合液。</li>
		<li>用封板膜封板，于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>使用酶标仪读板（50–200次闪光）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用HTRF（均相时间分辨荧光）法检测人IL-23 
	注意：&#160;本方案遵循试剂供应商的建议，简要总结如下：
	<ol>
		<li>将1体积的复溶试剂（抗IL-23-荧光素抗体和抗IL-23 D2-抗体）与19体积的检测缓冲液#3混合。</li>
		<li>在加样前，将两种即用型抗体溶液按1:1比例混合。</li>
		<li>取步骤3.6中的上清液10 µL，加入白色384孔板中。</li>
		<li>每孔加入10 µL抗体混合液。</li>
		<li>用封板膜封板，于4 °C孵育过夜。</li>
		<li>使用酶标仪读板（50–200 nm闪光）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用电化学发光法检测人IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α 
	注意： 所有样本均用稀释液2进行1/150稀释（第一次稀释：10 µL加入150 µL，然后取20 µL加入180 µL）。本方案遵循试剂供应商的建议：
	<ol>
		<li>用稀释液2对样本和标准品进行稀释。</li>
		<li>使用稀释液2对标准品进行1/4倍比连续稀释。</li>
		<li>用洗涤缓冲液洗涤板孔三次。</li>
		<li>每孔加入50 µL样本或标准品。</li>
		<li>在室温下震荡孵育2小时。</li>
		<li>用PBS + 0.05%吐温20洗涤板孔四次。</li>
		<li>将检测抗体（每3 mL终体积中加入每种抗体60 µL）用稀释液3稀释后，每孔加入25 µL。</li>
		<li>在室温下震荡孵育2小时。</li>
		<li>用PBS + 0.05%吐温20洗涤板孔四次。</li>
		<li>避免产生气泡，每孔加入150 µL读板缓冲液（含三丙胺的Tris缓冲液，用ddH2O稀释2倍），作为电化学发光免疫分析中光信号产生的共反应物。</li>
		<li>立即在多重检测酶标仪上读取结果（避免延迟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照供应商方案采用ELISA法检测小鼠TNF-α
	<ol>
		<li>用检测稀释液（含蛋白的即用型缓冲液）将上清液按1:1稀释。
		<ol>
			<li>按照试剂盒说明配制试剂、样本和标准品稀释液。每孔加入50 μL检测稀释液。</li>
			<li>每孔加入50 μL标准品、对照品或样本。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>轻轻敲击板框1分钟，充分混匀。</li>
		<li>用提供的自粘封板膜封板，在室温下孵育2小时。</li>
		<li>吸去每孔液体，每孔用400 μL洗涤液洗涤（共重复5次）。</li>
		<li>最后一次洗涤后，吸尽残留洗涤液。</li>
		<li>将板倒置，轻拍于洁净的纸巾上以去除残余液体。</li>
		<li>每孔加入100 μL小鼠TNF-α偶联物，用新的自粘封板膜封板。</li>
		<li>在室温下孵育2小时。</li>
		<li>重复步骤7.4.4中的吸液/洗涤操作。</li>
		<li>每孔加入100 μL底物溶液，在室温下避光孵育30分钟。</li>
		<li>每孔加入100 μL稀释的盐酸溶液（终止液），轻轻敲击板面以确保充分混匀。</li>
		<li>使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（校正波长设为560 nm），需在30分钟内完成读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞活力检测
	<ol>
		<li>在去除PBMC或单核细胞培养的上清液后，向细胞悬液中直接加入终浓度为10%的即用型刃天青溶液（氧化还原指示剂），用于评估细胞活力。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育1至2小时。</li>
		<li>使用酶标仪在590 nm发射波长（激发波长540 nm）下检测荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 化合物制备
<ol>
	<li>iMoDCs 的系列稀释
	<ol>
		<li>将 MLT-827 储存液（10 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO））一次性稀释至培养基中，使其终浓度为 8 µM（4 倍浓缩液）。</li>
		<li>使用含 0.08% DMSO 的培养基进行六步 1:5 系列稀释。对照组（无化合物）使用相同的含 0.08% DMSO 的培养基溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iMoDCs 的单剂量测试
	<ol>
		<li>将 MLT-827、AFN700 和 Cpd11 的储存液一次性稀释至培养基中，使其终浓度为 4 µM（4 倍浓缩液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠脾细胞的系列稀释
	<ol>
		<li>将 10 µM MLT-827 溶液（由 10 mM 储存液在培养基中一次性稀释获得）进一步稀释至 0.01 µM，终浓度 DMSO 为 0.1%。</li>
		<li>稀释过程中，每步取 2 µL 稀释液，加入 38 µL RPMI，然后用移液器将 5 µL 加入孔中。 
		注意：所有处理均设三个重复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 刺激材料准备
<ol>
	<li>去甘露聚糖（DZ）
	<ol>
		<li>向10 mg DZ中加入2 mL无菌无内毒素水。</li>
		<li>涡旋振荡以混匀储备液，每次使用前也需涡旋振荡。</li>
		<li>分装溶液，并将分装样品储存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>海藻糖-6,6-二硬脂酸（TDB）
	<ol>
		<li>向1 mg TDB中加入100 µL DMSO，在60 °C水浴中加热15–30秒。</li>
		<li>涡旋振荡后立即加入900 µL无菌PBS，再次涡旋振荡。</li>
		<li>在60 °C加热10–15分钟，每次使用前通过涡旋振荡充分混匀。</li>
		<li>将溶液保存于4 °C。</li>
		<li>按MLT-827化合物的方法进行系列稀释和单次剂量配制。 
		注意：由于TDB需用DMSO配制，细胞刺激时终浓度含有1% DMSO。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HemITAM%3A+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li>
<li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1001259">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li>
<li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6(2011).</li>
<li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , In press (2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们采用简单的实验条件来研究人和小鼠天然免疫细胞中的信号通路，并探究这些通路对MALT1蛋白水解功能的依赖性。在先前研究11的基础上，本研究发现MALT1副半胱天冬酶活性调控C型凝集素样受体诱导的细胞因子产生，包括TNF-α。相比之下，在两个物种中，TLR-4诱导的TNF-α产生均不依赖于MALT1。总体而言，这些数据进一步证实了早期研究6,12,18所揭示的MALT1/CBM信号体在C型凝集素样受体下游发挥的关键且选择性作用。
TLR-4 信号通路在髓系细胞中对 MALT1 的明确独立性是否适用于其他细胞类型，仍有待进一步研究。例如，在 B 淋巴细胞中，先前的研究表明 TLR 信号通路可参与 B 细胞受体下游的 B 细胞活化过程19。事实上，我们已有未发表的数据表明，经 TLR-4 刺激的...

2008年发现了MALT1（黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1）的副半胱天冬酶活性1,2此后，多项研究报道了其在淋巴细胞抗原受体反应中的关键作用。小鼠遗传模型及药理学数据均支持其在T细胞、T细胞依赖性自身免疫以及B细胞淋巴瘤中的重要作用。3,4在淋巴细胞中，MALT1副半胱天冬酶的活化发生在CARD11-BCL10-MALT1复合物组装之后5，该过程由T细胞或B细胞受体下游的抗原受体近端信号转导所触发。也有充分证据表明，类似的CARD9-BCL10-MALT1复合物在C型凝集素样受体（CLLR）下游信号传导中发挥重要作用，例如, 髓系细胞中的 Dectin-1、Dectin-2 和 MINCLE6,7Dectin-1 通路在宿主抵御真菌感染中具有关键作用，因此得到了深入研究8,9然而，MALT1 在 Toll 样受体（TLR）通路中的作用仍存在争议10最近在人类髓系细胞中的证据排除了MALT1副半胱天冬酶活性在TLR-4下游调控TNF-产生中的直接作用11.
在本研究中，我们采用多种实验条件和刺激条件，利用人和小鼠髓系细胞探究先天性信号通路，依赖特异性药理学工具抑制剂并检测细胞因子的产生。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;m 尼龙细胞滤网</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Falcon 管</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Falcon</td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底板，带低蒸发盖</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96 孔V型底板</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵 - NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 检测稀释液 RD1-W</td><td>R&amp;D</td><td>895038</td><td>检测稀释液</td></tr><tr><td>细胞培养微孔板，384 孔，黑色</td><td>Greiner</td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>去活化酵母多糖</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>现为：tlrl-zyd</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td></tr><tr><td>ELISA 小鼠 TNF-&amp;alpha;</td><td>R&amp;D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 管</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS 组织解离仪</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF 人 IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF 人 TNF-&amp;alpha;</td><td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF 复溶缓冲液</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0，0.8 M KF，0.2% BSA</td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>R&amp;D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖 (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>用于人源样本的 LPS</td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td>用于小鼠样本的 LPS</td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>155 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，1 mM EDTA，pH 7.4</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>微孔板，384 孔，白色</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>单核细胞富集试剂盒</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&amp;deg;C 冷冻容器</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>冷却装置（含异丙醇）</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; [-] MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td>磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Pen/Strep</td></tr><tr><td>碳酸氢钾 - KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>用于细胞活力评估的刃天青溶液</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>读板缓冲液</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>含三丙胺的 Tris 缓冲液</td></tr><tr><td>细胞培养复苏冻存液</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>冻存培养基</td></tr><tr><td>含 Glutamax 的 Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ 10% FBS 用于 iMoDCs&lt;br/&gt; + 10% FBS + 1 mM 丙酮酸钠 + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &amp;micro;M &amp;beta;-巯基乙醇用于人外周血单个核细胞和单核细胞&lt;br/&gt; + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &amp;micro;M &amp;beta;-巯基乙醇用于小鼠脾细胞</td></tr><tr><td>分离缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>海藻糖-6,6-二硬脂酸酯</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>聚山梨酯 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>乙二胺四乙酸</td></tr><tr><td>Viewseal 封板膜</td><td>Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX 炎症因子检测试剂盒（人源）1 号</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>电化学发光多重检测（IL-1&amp;beta;、TNF-&amp;alpha;、IL-6、IL-8）</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

malt1 副半胱天冬酶活性对髓系先天免疫信号通路的调控

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

除了在淋巴细胞中的功能（已有大量研究报道）之外，副半胱天冬酶MALT1还在模式识别受体下游的天然免疫细胞中发挥重要作用。其中研究最为清楚的是C型凝集素样受体家族中的Dectin-1和Dectin-2，它们可诱导依赖于SYK和CARD9的信号级联反应，进而以MALT1依赖的方式激活NF-κB。相比之下，Toll样受体（TLR）如TLR-4虽也能促进NF-κB的激活，但其信号传导依赖于MYD88/IRAK级联途径。然而，MALT1是否参与TLR-4信号传导仍不明确。近期使用MLT-827（一种高效且选择性的MALT1副半胱天冬酶活性抑制剂）的研究证据表明，在人类髓系细胞中，TLR-4下游的TNF-产生不依赖于MALT1，而Dectin-1下游的TNF-产生则依赖于MALT1。在此，我们进一步探讨了MALT1在模式识别感应中的选择性作用，采用了多种人源和鼠源细胞样本，并分别激活Dectin-1、MINCLE或TLR-4通路。此外，我们还通过检测除TNF-以外的其他细胞因子，并将MLT-827与SYK抑制剂（Cpd11）及IKK抑制剂（AFN700）进行比较，提供了更多深入见解。总体而言，这些数据进一步证明了C型凝集素样受体信号通路对MALT1的依赖性，而TLR信号通路则无此依赖性。

在髓系细胞中，MALT1 传递来自多种 C 型凝集素样受体（如 Dectin-1、Dectin-2 和 MINCLE）的活化信号6。这些通路依赖于含有（半）免疫受体酪氨酸活化基序（(hem)ITAM）的受体（例如, Dectin-1）或含有ITAM模体的共受体（例如, FcRγ（用于Dectin-2和MINCLE）招募并激活SYK激酶（图1)。这会激活一种蛋白激酶C同工型，即PKCδ，后者磷酸化CARD9，从而触发CARD9/BCL10/MALT1复合物的形成，并招募TRAF6，以启动下游NF-κB的活化12相比之下，TLR-4 信号通路以一种不依赖 MALT1 但依赖 MYD88/IRAK 的方式招募 TRAF6，从而激活 NF-κB（图1)。通过MALT1缺陷的遗传模型以及使用肽类活性位点抑制剂z-VRPR-fmk进行药...

MALT1 调控先天免疫，但其作用机制尚不明确。我们使用选择性 MALT1 副半胱天冬酶抑制剂 MLT-827，揭示了 MALT1 在 Toll 样受体或 C 型凝集素样受体下游的先天免疫信号通路中的作用，证明 MALT1 调控髓系细胞因子的产生，且该作用主要在 C 型凝集素样受体下游具有选择性。

MALT1 副半胱天冬酶活性对髓系先天免疫信号通路的调控

除了在淋巴细胞中的功能（已有大量研究报道）外，副半胱天冬酶MALT1在天然免疫细胞中也发挥着重要作用……

因此，我们论文中所述方法的目的是利用人和小鼠系统对髓系细胞中的信号通路进行比较分析。该方法有助于确定哪些信号通路参与了特定模式识别受体下游的信号转导过程。该方法易于实施。该方法依赖于原代细胞制备和经过验证的参考化合物，这对于阐明信号传导机制至关重要。实验操作将分别由本研究组的科学家 Ratiba Touil 和研究助理 Adeline Unterreiner 演示。在超净工作台内放置一把无菌剪刀、一个一升烧杯和一个塑料袋。将先前获得的血沉棕黄层放入烧杯中，用剪刀小心打开。使用25 mm移液管加入100 ml含2毫摩尔EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）。通过缓慢吹打混匀。然后将25 ml稀释后的血沉棕黄层转移至六个50 ml锥形离心管中，每管预先加入15 ml基于多糖的密度梯度液。以800 ×g中等加速度离心20分钟，不使用刹车，使细胞根据其密度实现分离。离心后可见三层：底部沉淀含有红细胞和粒细胞，上层为血浆，中间白色环状层含有外周血单个核细胞。使用 10 ml 移液管收集 PBMC 环状层，并将其转移至新的 50 ml 离心管中。用 PBS 和 EDTA 补充体积。按照文本方案中所述，进行三次连续洗涤，离心时间和速度依次降低。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于25 ml冰上预冷的裂解缓冲液中，通过渗透压裂解红细胞。将溶液在室温下孵育至澄清透明。然后加入25 ml分离缓冲液以终止反应。以150 ×g离心8分钟以洗涤溶液。弃去上清液，并用分离缓冲液重悬沉淀。计数细胞后，将其用培养基稀释至每孔12,500个细胞。将30 ml该细胞悬液加入384孔板的每个孔中。随后，向每孔加入15 µl浓度为四倍的化合物溶液，并将板在37°C、5% CO₂条件下预孵育1小时。如需要，可加入LPS至终浓度为1 ng/ml，或加入去除了Zymosan的成分至终浓度为100 µg/ml。然后将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。第二天取10微升上清液以测定分泌的TNFα水平。开始进行系列稀释时，将MLT-827储备液用培养基一次性稀释至8微摩尔的浓度。使用含 0.08% DMSO 的培养基进行六步 1:5 倍比稀释。为准备单剂量测试，将 MLT-827、AFN700 和化合物 11 的储备液一次性用培养基稀释至浓度为 4 微摩尔。首先，向 10 mg 去除内毒素的Zymosan中加入 2 ml 无菌无热原水。涡旋此储备液以使其混匀。分装溶液，然后将分装的样品储存在 20 摄氏度。本研究中，人外周血单个核细胞和小鼠脾细胞分别用去除了甘露聚糖的酵母聚糖（Dectin-1 激动剂）或脂多糖（TLR4 激动剂）进行刺激。20 小时后测定上清液中 TNF-α 的释放量。在人和小鼠的检测中，MLT-827 化合物选择性抑制由 Dectin-1 通路驱动的 TNF-α 产生，但不影响 TLR4 通路驱动的 TNF-α 产生。在 LPS 刺激的单核细胞中，AFN700 几乎完全阻断 TNF-α 的产生，而 Cpd11 无此效应，这与 TLR4 通路依赖于 NF-κB 活性且不依赖 SIC 活性的特性一致。相比之下，由 Dectin-1 和 MODC 介导的 TNF alpha 产生对 MLT-827、AFN700 和 Cpd11 敏感。这进一步证明了 SIC CBM 信号级联参与了 Dectin-1 通路。IL-1 beta、IL-6 和 IL-23 的产生也对这三种抑制剂敏感，表明其调控机制与 TNF alpha 相似。然而，IL-8 产生量的变化有限，表明该细胞因子具有独特的调控机制。当海藻糖二硬脂酸酯（Trehalose-dibehenate）浓度超过每毫升 50 mcg 时，会诱导 TNF alpha、IL-6 和 IL-1 beta 的产生，该过程依赖于 MALT1 副半胱天冬酶活性，这一点通过 MLT-827 的阻断效应得以证实。当使用浓度递增的去甘露聚糖（depleted Zymosan）刺激 MODC 以激活 Dectin-1 时，也观察到类似结果。该方法使得揭示副半胱天冬酶 MALT1 选择性调控 C 型凝集素样受体信号通路成为可能。必须使用经过充分表征的参考化合物。注意母液稀释的操作步骤。这对于溶解度有限的化合物至关重要。

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

palt1 副酶活性对髓系先天信号通路的调控

唾液酸酶检测是一种简便的技术方法，可用于阐明TLR感受器在活体巨噬细胞细胞表面受体水平上识别微生物感染的新型分子机制及其在炎症性疾病中的作用。...

检测Neu1唾液酸酶活性在调控TOLL样受体激活中的作用

利用 NucView 488 caspase-3 底物对永生化 N19-少突胶质细胞培养物中 caspase-3...

通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡

活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

本方案描述了半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）技术；这是一种基于成像的方法，可用于可视化诱导起始半胱天冬酶的邻近效应，这是其激活的第一步。...

利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

我们描述了在细胞水平上通过荧光显微镜检测NLRP3炎性小体活化的方法，该方法利用针对活化型caspase-1和接头蛋白ASC的染色技术。同时提供了一种乳酸脱氢酶释放实验，用于在群体水平上检测细胞焦亡性裂解。这些技术可被调整用于研究炎性小体生物学的多个方面。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测

我们报告了用于表征坏死性凋亡中由MLKL介导的质膜破裂的方法，包括常规和共聚焦活细胞显微成像、扫描电子显微镜以及基于核磁共振的脂质结合分析。...

坏死性凋亡中MLKL介导的质膜破裂的表征

本方案描述了从人血液样本中获取单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）的工作流程，一种在不损害细胞活力和行为的前提下，将炎症性半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）报告系统高效导入人MDM的简便方法，以及一种基于成像的技术，用于在活细胞中检测炎症性半胱天冬酶的激活。...

人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内...

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

本实验方案描述了两种通过荧光底物结合流式细胞术或荧光分光光度计来检测caspase活性的方法。...

使用荧光定量法或流式细胞术检测Caspase活性

本文描述了一种基于磷酸化流式细胞术的方法，用于分析移植到小鼠体内并从骨髓穿刺液中获取的人急性髓系白血病细胞中 mTORC1、JAK/STAT5 和 MAPK 信号通路下游的信号传导。利用新一代光谱流式细胞仪，可同时高灵敏度地检测 p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6 和 p-ERK1/2...

急性髓系白血病患者来源异种移植模型的细胞内磷酸流式细胞术

本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。...

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

探索MALT1副酶活性在髓系细胞先天免疫信号通路中的选择性调控机制。本研究利用人外周血单核细胞和小鼠脾细胞，结合特异性抑制剂MLT-827，揭示C型凝集素样受体下游细胞因子产生的独特调节方式。

MALT1 副半胱天冬酶活性对髓系先天免疫信号通路的调控

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