Name: 原生质体在叶绿体中导入蛋白质的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学习利用PEG介导转化法在原生质体中表达蛋白质，研究蛋白质向叶绿体输入的定位与动态过程。该方法可在活体条件下高效分析蛋白质输入机制，为植物细胞生物学研究提供重要技术支持。

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本工作得到了韩国农村振兴厅农业科学技术发展协同研究计划（项目编号：PJ010953012018）以及韩国国家研究基金会由科学技术信息通信部资助的项目（编号：2016R1E1A1A02922014）的支持。

1. 拟南芥植株的培养
<ol>
	<li>配制1 L Gamborg B5（B5）培养基：将3.2 g含维生素的B5培养基粉末、20 g蔗糖和0.5 g 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）加入约800 mL去离子水中，用氢氧化钾（KOH）调节pH至5.7。再加入去离子水定容至1 L。加入8 g植物琼脂，于121 °C高压灭菌15 min。</li>
	<li>待培养基冷却至55 °C后，在超净工作台中将20–25 mL B5培养基倒入培养皿（直径9 cm，高1.5 cm）。将平板干燥2–3天，用保鲜膜封好，置于冰箱中保存备用。</li>
	<li>在离心管（e-tube）中加入1 mL 70%（v/v）乙醇，持续振荡2–3 min，对Arabidopsis thaliana种子进行表面灭菌。去除上清液，加入1 mL 1%（v/v）次氯酸钠溶液，继续振荡2–3 min。每培养皿准备100–150粒种子。
	<ol>
		<li>弃去上清液，用1 mL蒸馏水清洗种子，重复此步骤4次。将灭菌后的种子置于4 °C环境中放置3天，以同步种子萌发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微量移液器将100–150粒种子播种于B5培养基平板上，并用医用胶带密封培养皿。</li>
	<li>将植株置于生长室中培养2周，培养条件为：16 h光照/8 h黑暗光周期，光照强度100 µmol·m-2·s-1，相对湿度70%，温度20 °C。</li>
</ol>
2. 质粒的制备
注意：转化应使用高纯度质粒；建议使用商品化的质粒提取试剂盒。
<ol>
	<li>使用DNA提取试剂盒纯化质粒（RbcS-nt:GFP）。为浓缩DNA，在1.5 mL离心管中进行乙醇沉淀，并将DNA沉淀溶解于100 µL蒸馏水中。使用分光光度计在260 nm处测定质粒浓度。将质粒稀释至终浓度约为2 µg/µL。将质粒保存于-20 °C，待用。</li>
</ol>
3. 原生质体的分离
<ol>
	<li>准备以下溶液。
	<ol>
		<li>制备酶溶液，其中包含 0.25% (w/v) 果胶酶（macerozyme）、1.0% (w/v) 纤维素酶（cellulase）、400 mM D-甘露醇、8 mM 氯化钙（CaCl2）、0.1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）和 5 mM MES。用 KOH 调节 pH 至 5.6。
		<ol>
			<li>使用孔径为 0.45 μm 的醋酸纤维素滤器过滤酶溶液。将 25 mL 酶溶液分装至 50 mL 锥形管中，于 -20 °C 保存。使用前在室温（RT）下解冻酶溶液，并充分混匀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将 21 g 蔗糖溶解于 100 mL 去离子水中制备 21% (w/v) 蔗糖溶液，并对溶液进行高压灭菌。</li>
		<li>制备 W5 溶液，其中包含 154 mM 氯化钠（NaCl）、125 mM CaCl2、5 mM 氯化钾（KCl）、5 mM 葡萄糖和 1.5 mM MES。用 KOH 调节 pH 至 5.6，并对溶液进行高压灭菌。</li>
		<li>制备 MaMg 溶液，其中包含 400 mM D-甘露醇、15 mM 氯化镁（MgCl2）和 5 mM MES。用 KOH 调节 pH 至 5.6，并对溶液进行高压灭菌。</li>
		<li>制备 1 M D-甘露醇和 1 M 硝酸钙储备液以配制 PEG 溶液。对这些溶液进行高压灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用手术刀从约 1–2 个 B5 培养板中收获生长约 2 周的完整叶片组织，并将收获的叶片放入含有 25 mL 酶溶液的 50 mL 锥形管中。将装有酶溶液和叶片组织的锥形管水平放置于旋转摇床上，在黑暗条件下轻轻振荡。完全消化叶片组织需要 8–12 小时。</li>
	<li>孵育 8–12 小时后，将酶溶液（含从叶片组织释放的原生质体）通过孔径为 140 µm 的滤网倒入新的培养皿中。小心地将含有原生质体的酶溶液叠加在 15 mL 21% (w/v) 蔗糖溶液上，然后在摆动桶转子中以 98 × g 离心 10 分钟，加速度和减速度设为最低。</li>
	<li>使用巴斯德吸管小心地将最上层（酶溶液层）以及酶溶液与蔗糖溶液界面处的原生质体转移至含有 30 mL W5 溶液的 50 mL 锥形管中。以 51 × g 离心 6 分钟。此时，原生质体将沉淀于锥形管底部。</li>
	<li>用移液器小心弃去上清液，避免扰动原生质体沉淀。加入 25 mL W5 溶液，轻轻重悬原生质体。将原生质体悬液置于 4 °C 冰箱中孵育至少 1 小时以使其稳定。</li>
</ol>
4. 使用聚乙二醇进行原生质体转化
<ol>
	<li>在50 mL锥形管中加入4 g PEG 8000、4 mL 1 M甘露醇溶液、1 mL 1 M Ca(NO3)2和1.8 mL蒸馏水，配制40% PEG溶液，并充分混匀。将溶液放入微波炉加热20–30秒以溶解PEG。将40% PEG溶液置于室温下冷却。
	 
	注意：40% PEG溶液应每次新鲜配制。若在冰箱中4 °C孵育期间原生质体未完全沉淀，可将样品在46 × g离心2分钟。</li>
	<li>小心但彻底地移除上清液，并向原生质体沉淀中加入MaMg溶液，使原生质体浓度达到5 × 106/mL。
	 
	注意：原生质体数量可通过显微镜下血细胞计数板测定。</li>
	<li>将10 µg质粒DNA加入一个空的13 mL圆底试管中，再用移液器加入300 µL原生质体溶液。
	 
	注意：移液器吸头末端应剪去。每次取原生质体样品前，均应先将含原生质体的溶液充分重悬，以确保每管加入相同数量的原生质体。</li>
	<li>轻轻旋转试管使质粒DNA与原生质体混合，立即用移液器加入300 µL 40% PEG溶液。继续轻轻但彻底地旋转试管混匀，室温孵育30分钟；将试管倾斜至接近水平位置并旋转数次。</li>
	<li>加入1 mL W5溶液，以类似方式手动轻轻但彻底地旋转混匀。室温孵育10分钟。</li>
	<li>分别使用1.5 mL和2 mL W5溶液，重复此步骤两次。最后一次加入W5溶液后，继续孵育30分钟。</li>
	<li>在46 × g离心4分钟。弃去上清液，加入2 mL W5溶液，轻轻但彻底混匀。在22 °C暗室中孵育。</li>
</ol>
5. 叶绿体蛋白质导入的分析
注意：原生质体经 PEG 介导转化后，孵育时间范围为 8 至 24 小时。
<ol>
	<li>荧光显微镜技术
	<ol>
		<li>使用剪裁过尖端的移液枪吸取10 µL原生质体溶液，滴加至载玻片上，小心加盖盖玻片，避免损伤原生质体。</li>
		<li>将载玻片置于配备有绿色荧光蛋白（GFP）和叶绿素自发荧光激发/发射滤光片组的荧光显微镜载物台上。</li>
		<li>使用冷却电荷耦合器件（CCD）相机采集图像，并利用图像编辑软件对图像进行处理，生成伪彩色图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>总蛋白提取与免疫印迹
	<ol>
		<li>配制含有2.5%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和2%（v/v）2-巯基乙醇的变性缓冲液。 
		注意：可通过测量转运肽加工程度来定量蛋白质向叶绿体的导入 通过 使用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。</li>
		<li>将原生质体转移至离心管中，在46 × g条件下离心4分钟。</li>
		<li>移去上清液，加入80 µL变性缓冲液，剧烈涡旋振荡5秒，然后加入5倍体积的SDS上样缓冲液（250 mM Tris-Cl（pH 6.8）、0.5 M DTT、10%（w/v）SDS、0.05%（w/v）溴酚蓝和50%（v/v）甘油）。充分混匀后，煮沸10分钟。</li>
		<li>将该蛋白质样品进行标准的SDS-PAGE电泳，随后使用抗GFP抗体进行免疫印迹检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15012188">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li>
<li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li>
<li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li>
<li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Transport+into+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li>
<li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li>
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<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li>
<li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dynamin-like+protein%2C+ADL6%2C+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li>
<li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li>
<li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li>
<li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们提供了一种利用拟南芥（Arabidopsis）原生质体研究蛋白质导入叶绿体的详细实验方案。该方法在研究蛋白质导入过程方面具有强大优势。这一简单且多功能的技术可用于检测目的货物蛋白向叶绿体的靶向运输。使用该方法时，原生质体可从拟南芥（Arabidopsis）的叶片组织中制备11,12，而植物材料可取自从早期到完全成熟的不同生长阶段的叶片。然而，在培养用于原生质体制备的植物时必须格外注意。应使用非常健康的植株，因为来自健康植株的原生质体更能耐受聚乙二醇（PEG）介导转化过程中的多个步骤。另一个重要的注意事项是使用新鲜配制的溶液。由于原生质体较为脆弱且对渗透压高度敏感，溶液浓度的微小变化都可能对其造成严重损伤。
我们一直利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入9,13,<sup class="xre...

叶绿体是植物中最重要的细胞器之一。叶绿体的主要功能之一是进行光合作用1。叶绿体还参与多种其他生化反应，用于合成脂肪酸、氨基酸、核苷酸以及大量次生代谢产物1,2。所有这些反应都需要大量不同类型的蛋白质。然而，叶绿体基因组仅包含约100个基因3,4。因此，叶绿体必须从细胞质中导入其所需的大部分蛋白质。事实上，已有研究表明，大多数叶绿体蛋白在翻译完成后从细胞质中被导入叶绿体4,5,6。植物细胞需要特定的机制将蛋白质从细胞质导入叶绿体。尽管过去几十年中对这些蛋白质导入机制已有研究，但我们仍未能在分子水平上完全理解这些过程。本文提供了一种制备原生质体及在外源体系中于原生质体中表达基因的详细方法。该方法可能有助于深入阐明叶绿体蛋白质导入的分子机制。
蛋白质导入可通过多种不同方法进行研究。其中一种方法涉及使用一种 体外 蛋白质输入系统7,8采用这种方法， 体外翻译后的蛋白质前体与纯化的叶绿体共同孵育 体外，通过SDS-PAGE分离后进行蛋白质印迹分析以检测蛋白质导入情况。该方法的优势在于可对蛋白质进入叶绿体的每一步骤进行详细研究。因此，该方法已被广泛用于鉴定叶绿体蛋白质导入分子机制的组成成分，并解析转运肽的序列信息。近年来，另一种利用叶片组织原生质体的方法被建立，并已广泛应用于叶绿体蛋白质导入的研究。9,10这种方法的优势在于，原生质体所提供的细胞环境比完整细胞更接近于天然状态 体外 因此，原生质体系统使我们能够研究该过程的许多其他方面，例如相关的胞质事件以及靶向信号特异性的决定机制。本文中，我们提供了一种利用原生质体研究蛋白质导入叶绿体的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>含维生素的GAMBORG B5培养基</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0210.0050</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td></td></tr><tr><td>MES一水合物</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td></td></tr><tr><td>琼脂，粉末</td><td>JUNSEI</td><td>24440S1201</td><td></td></tr><tr><td>微孔外科胶带</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢外科刀片 No.10</td><td>FEATHER</td><td>Unavailable</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>Unavailable</td><td></td></tr><tr><td>纤维素酶 ONOZUKA R-10</td><td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td><td>Unavailable</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-甘露醇</td><td>SIGMA</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>0219463505-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Twister</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-96TW</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 筛选杯</td><td>SIGMA</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 筛网</td><td>SIGMA</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>HILGENBERG</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>VISION SCIENTIFIC</td><td>VS-5500N</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>JUNSEI</td><td>19015S0350</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>SIGMA</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>无水D-葡萄糖</td><td>BIO BASIC</td><td>GB0219</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>DUKSAN</td><td>40</td><td></td></tr><tr><td>四水合硝酸钙</td><td>SIGMA</td><td>C2786-500G</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>SIGMA</td><td>P2139-2KG</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>SIGMA</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>13 ml 管，100×16 mm，聚丙烯材质</td><td>SARSTEDT</td><td>55.515</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>MARIENFELD</td><td>1000412</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>MARIENFELD</td><td>101030</td><td></td></tr><tr><td>计数板</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 2 成像显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Unavailable</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>SIGMA</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质组学级</td><td>VWR</td><td>M107-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS，超纯级</td><td>VWR</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>DTT（DL-二硫苏糖醇），生物技术级</td><td>VWR</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝钠盐 ACS级</td><td>VWR</td><td>0312-50G</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>JUNSEI</td><td>27210S0350</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. 单克隆抗体（JL-8）</td><td>TAKARA</td><td>632381</td><td></td></tr></tbody></table>

利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

叶绿体是植物中负责多种细胞过程（如光合作用以及多种次生代谢物和脂质的合成）的重要细胞器。叶绿体执行这些生理功能需要大量蛋白质。超过95%的叶绿体蛋白由细胞核编码，在细胞质核糖体上翻译后从细胞质导入叶绿体。因此，细胞核编码的叶绿体蛋白正确地靶向并导入叶绿体，对于叶绿体乃至整个植物细胞的正常功能至关重要。细胞核编码的叶绿体蛋白含有可特异性靶向叶绿体的信号序列。定位于叶绿体或细胞质中的分子机制可识别这些信号，并介导蛋白质的导入过程。为研究蛋白质向叶绿体导入或靶向的机制 体内我们开发了一种快速、高效的基于原生质体的方法，用于分析蛋白质向拟南芥叶绿体的导入。该方法利用从拟南芥叶片组织中分离的原生质体 拟南芥在此，我们提供了一种利用原生质体研究蛋白质导入叶绿体机制的详细实验方案。

可通过两种方法检测蛋白质向叶绿体的导入：荧光显微镜观察以及SDS-PAGE分离后的免疫印迹分析。本实验中，我们使用了RbcS-nt:GFP融合蛋白，该融合蛋白包含RbcS的前79个N端氨基酸残基（含转运肽）与GFP的融合序列。当目标蛋白RbcS-nt:GFP被成功导入叶绿体后，在荧光显微镜下观察，其绿色荧光信号应与叶绿素自发产生的红色荧光信号重叠（图1）。两种信号的高度共定位表明蛋白质已成功导入叶绿体。通常情况下，GFP信号在整个叶绿体内弥散分布，或集中于叶绿体中心区域，同时在整个叶绿体中呈现微弱的弥散信号，具体分布模式取决于特定蛋白的性质。此外，可通过抗GFP抗体进行免疫印迹分析以进一步验证蛋白质的导入情况。从原生质体中提取总蛋白，经SDS-PAGE分离后进行蛋白质印迹分析（图2）。大多数情况下，若蛋白质成功导入叶绿体，免疫印迹中应出现两条蛋白条带：上部条带代表全长前体蛋白，下部条带代表导入叶绿体后加工处理后的成熟形式。加工后蛋白的量应随时间推移而增加...

本文介绍了一种利用聚乙二醇（PEG）介导的转化方法在原生质体中表达蛋白质的实验方案。该方法可简便地表达目标蛋白，并高效地在活体条件下（in vivo）研究蛋白质的定位及其在不同实验条件下的导入过程。

叶绿体是植物中负责多种细胞过程（如光合作用以及许多...）的一种必需细胞器

这一方法有助于解答细胞生物学领域中的一些问题，例如蛋白质输入叶绿体的过程。该技术的主要优势在于能够在活体条件下研究蛋白质向叶绿体的输入。本次实验操作将由我实验室的两名博士后 Junho Lee 和 Hyangju Kang 演示。首先，从一到两个B5培养板中选取两周大的完整植株叶片组织。使用手术刀切割叶片，并将其放入含有25毫升酶解液的50毫升锥形管中。将锥形管水平置于旋转摇床上，在22°C避光条件下轻轻振荡孵育8至12小时，直至溶液中仅剩叶柄和茎组织。孵育结束后，将含有释放出的原生质体的酶溶液通过孔径为140微米的滤网过滤至新的培养皿中。然后，小心地将该溶液叠加在50毫升锥形管中15毫升21%蔗糖溶液的上层。将锥形管置于水平转子离心机中，以最低加速度和减速度设置，在98 ×g 条件下离心10分钟。随后，使用帕特拉移液器小心地移除最上层含有酶溶液的原生质体，以及酶溶液与蔗糖溶液界面处的原生质体。将此溶液转移至含有30毫升W5溶液的50毫升锥形管中，并倒置管子以混匀。在51 ×g条件下离心6分钟。使用移液器小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀中的原生质体。加入 25 毫升 W5 溶液，轻轻重悬原生质体。为确保稳定，需在 4 °C 冰箱中孵育至少一小时。在4摄氏度孵育后，以46 × g离心2分钟，彻底沉淀原生质体。小心完全去除上清液，并加入MANG溶液至原生质体沉淀中，使浓度达到每毫升5 × 10⁶。用移液器将10微克质粒DNA和300微升原生质体溶液加入一支新的13毫升圆底试管中。用手轻轻旋转离心管混匀，然后立即加入 300 µL 新鲜配制的 40% PEG 溶液。将离心管几乎水平倾斜，用手轻轻旋转数次，充分混匀。室温孵育 30 分钟。然后加入1毫升W5溶液，用手轻轻旋转试管，充分混匀，方法同前。将样品在室温下孵育10分钟。重复此步骤两次，第一次加入1.5毫升W5溶液，第二次加入2毫升W5溶液；每次加入后均需混匀，最后一次混匀后，孵育30分钟。将离心管在46 ×g下离心4分钟，然后弃去上清液。向沉淀中加入2毫升W5溶液，以与之前相同的方式轻轻但充分地混匀。在22 °C避光条件下孵育18小时。为了利用荧光显微镜分析蛋白质导入，使用带有修整尖端的移液器将10微升原生质体溶液滴加到玻璃载玻片上。用盖玻片小心覆盖溶液，避免损伤原生质体。将载玻片置于荧光显微镜载物台上，设置激发滤光片以观察绿色荧光蛋白和叶绿素自发荧光。使用冷却的电荷耦合器件相机采集图像，并利用图像编辑软件处理，生成伪彩色图像。进行总蛋白提取和免疫印迹时，从原生质体溶液中取出1 mL，将剩余的1 mL混合。将该原生质体溶液转移至离心管中，在46 ×g下离心4分钟。离心完成后，移除上清液，加入80微升变性缓冲液，涡旋剧烈振荡5秒。加入5倍XDS上样缓冲液，充分混匀后煮沸10分钟以进行变性。使用抗GFP抗体进行标准的SDS-PAGE和免疫印迹分析。RbcS和TGFT是一种融合构建体，编码含有转运肽的RBCS的C端79个氨基酸残基，并与GFP融合，用于通过荧光显微镜和免疫印迹研究蛋白质向叶绿体的导入。在荧光显微镜下观察时，来自目标蛋白的绿色荧光信号与叶绿素自发红色荧光信号重叠，表明蛋白已导入叶绿体。在分离总蛋白后，免疫印迹中观察到两条蛋白条带，表明该蛋白已成功导入叶绿体。上方条带对应全长前体蛋白，下方条带对应导入叶绿体后加工处理的成熟形式。该蛋白加工形式的量随时间延长而增加，提示该蛋白可被导入叶绿体。随着这一进展，该技术为细胞生物学领域的研究人员探索拟南芥中的蛋白质疲劳或膜丝挑选铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

原生质体在叶绿体中导入蛋白质的研究

利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

本文介绍了一种在胁迫条件下研究蛋白质导入分离叶绿体的新方法。该方法快速且简便，可用于研究不同胁迫条件对叶绿体蛋白质导入的影响及其相应的调控机制。...

分析蛋白质向胁迫条件下植物分离叶绿体的导入

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植物原生质体mRNA相互作用组捕获

本文介绍了高效分离具有生理活性的类囊体以及用于叶绿体双精氨酸转运（cpTat）、分泌（cpSec1）和信号识别颗粒（cpSRP）途径的蛋白质转运实验方法。...

分离具有生理活性的类囊体及其在依赖能量的蛋白质转运实验中的应用

本文介绍了一种经过验证的纯化叶绿体蛋白导入复合物（TOC-TIC复合物）的实验方案，该方法利用TAP标签进行一步亲和纯化。该一步亲和分离方案原则上可适用于任何蛋白，并可用于通过质谱技术鉴定新的相互作用蛋白伙伴。...

使用TAP标签亲和纯化叶绿体转运子蛋白复合物

本文介绍一种从拟南芥（Arabidopsis）叶片中分离完整叶绿体及其三个主要亚区室（被膜、基质和类囊体）的方法，该方法结合了差速离心、连续Percoll梯度离心和不连续蔗糖梯度离心。该方法可用于通过免疫印迹和蛋白质组学手段进行蛋白质的亚叶绿体及亚细胞定位研究。...

拟南芥叶绿体亚区室的制备及其用于免疫印迹或蛋白质组学分析的蛋白质定位研究

线粒体是骨骼肌中具有高度表型可塑性的关键代谢细胞器。细胞质蛋白的输入是细胞器生物发生的关键途径，对线粒网状结构的扩展和线粒体功能的维持至关重要。因此，蛋白质输入可作为细胞健康状况的指标。...

骨骼肌线粒体蛋白质导入能力的测定

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

本文介绍了一种在厌氧条件下进行蛋白质纯化、蛋白质浓缩以及后续利用氧电极系统进行动力学表征的实验方案。该方法以DesB酶为例进行说明，DesB是一种双加氧酶，在厌氧环境中纯化和保存时具有更高的稳定性与活性。...

通过氧电极进行厌氧蛋白质纯化与动力学分析以研究DesB双加氧酶活性与抑制作用

学习利用PEG介导转化法在原生质体中表达蛋白质，研究蛋白质向叶绿体输入的定位与动态过程。该方法可在活体条件下高效分析蛋白质输入机制，为植物细胞生物学研究提供重要技术支持。

利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入

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