原生质体在叶绿体中导入蛋白质的研究
2018年12月10日
在这里, 我们描述了一种协议, 以表达蛋白质原生质体使用 peg 介导的转化方法。该方法为感兴趣的蛋白质的表达提供了方便的方法, 有效地研究了蛋白质定位和各种实验条件在体内的导入过程。
这个谜团可以帮助回答细胞生物学领域的几个问题，如蛋白质输入叶绿体。该技术的主要优点是，在体内条件下可以研究叶绿体的蛋白质输入。演示程序将是李俊浩和杨菊康，两个后出我的实验室。
首先，从一到两个B5板从两个星期大的植物中收获完整的叶组织。使用手术刀收获叶子，并把它们放入含有25毫升酶溶液的50毫升圆锥管中。将管子水平放在旋转摇床上，在黑暗中22摄氏度的温和搅拌下孵育8至12小时，直到溶液中只保留小毛花和茎。
完成孵育后，通过140微米孔径网将含有释放的表层酶溶液过滤成新鲜的培养皿。然后在 50 毫升锥形管中小心地将溶液分层在 15 毫升 21%蔗糖溶液上。在98 gs下将管在摆动桶转子中离心10分钟，加速和减速设置最低。
之后，使用帕图拉移液器小心地从最上层去除含有酶溶液的蛋白酶，以及酶溶液和蔗糖溶液之间的界面。将溶液转移到含有 30 毫升 W5 溶液的 50 毫升锥形管中，然后反转管进行混合。在51克时将管子离心6分钟。
使用移液器小心丢弃此上流液，而不干扰颗粒中的原体。加入 25 毫升 W5 溶液，轻轻重新悬浮原压。为了稳定，在四摄氏度的冰箱中孵育至少一小时。
经过4摄氏度的孵育，在46克左右离心两分钟，完全将原型丸粒育成。小心地完全去除超高动量，并将 MANG 溶液添加到原丸中，达到每毫升五倍十至六。使用移液器将 10 微克的血浆 DNA 和 300 微升的 protoplast 溶液添加到新鲜 13 毫升圆形底部管中。
用手轻轻旋转管子，然后立即加入300微升新鲜准备的40%PEG溶液。通过几乎水平倾斜管子，用手轻轻旋转几次，完全混合。在室温下孵育30分钟。
然后添加一毫升W5溶液，并像以前一样用手轻轻旋转管子完全混合。在室温下孵育样品10分钟。重复两次，先加入1.5毫升，然后加入两毫升W5，最后加入混合后，孵育30分钟。
在46克时将管离心4分钟，然后丢弃上一代。将两毫升 W5 溶液加入颗粒中，然后以与以前相同的方式轻轻混合，但完全混合。在22摄氏度的黑暗室内孵育18小时。
要使用荧光显微镜分析蛋白质导入，请使用带修剪尖端的移液器，在玻璃幻灯片上放置 10 微升的 protoplast 溶液。使用盖滑器小心地盖住溶液，以避免损坏前托帕斯特。将幻灯片放在荧光显微镜的舞台上，使用用于观察绿色荧光蛋白和叶绿素自荧光的激发入场过滤器。
使用冷却充电两者设备摄像头捕获图像，并使用想象编辑软件处理图像以生成伪彩色图像。对于总蛋白质提取和免疫印迹，从原蛋白溶液中去除一毫升，然后混合剩余的一毫升。将这种原状溶液转移到离心管中，以 46 gs 的离心机进行 4 分钟。
完成离心后去除上流液，并添加80微升变性缓冲液。漩涡活力五秒钟。添加五个 XDS 样品缓冲液，混合好，煮沸 10 分钟，变性。
继续使用标准 STS 页面和具有抗 GFP 抗体的免疫印迹。RbcS 和 TGFT 是编码 79 端端氨基酸残留物的融合结构，含有与 GFP 融合的过境肽，用于研究通过荧光显微镜和免疫膨胀将蛋白质导入叶绿体。当通过荧光显微镜检查时，目标蛋白的绿色荧光信号与来自叶绿素自体浮游的红色荧光信号合并，表明蛋白质导入叶绿体。
在隔离总蛋白后，在免疫布洛特中观察到两个蛋白带，表明一种蛋白质被正确导入叶绿体。上带对应于导入叶绿体后加工的全长前体和下带。蛋白质的加工形式以时间依赖的方式增加，表明蛋白质被导入叶绿体。
在这一开发中，这项技术为细胞生物学领域的研究人员探索阿拉比多普斯的蛋白质累人或膜螺纹采摘铺平了道路。
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概述
本文描述了一种PEG介导的转化方法，用于在质原体中表达蛋白质，从而允许研究体内蛋白质定位和进口过程。该协议由Junho Lee和Hyangju Kang展示，为蛋白质进入叶绿体提供了洞见。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 植物生物学
- 蛋白质表达
背景
- 理解蛋白质定位在细胞生物学中至关重要。
- 叶绿体在植物代谢中扮演重要角色。
- 研究蛋白质进口过程可以增强我们对细胞功能的认识。
- PEG介导的转化是一种广泛用于质原体的技术。
研究目的
- 提供质原体中蛋白质表达的协议。
- 在体内条件下研究蛋白质定位。
- 促进对叶绿体中蛋白质进口过程的研究。
使用的方法
- 从两周大的植物中收集完整的叶组织。
- 使用手术刀准备叶样本。
- 在酶溶液中孵育叶组织以分离质原体。
- 采用PEG介导的转化进行蛋白质表达。
主要结果
- 在质原体中成功表达蛋白质。
- 高效调查蛋白质定位。
- 经过培训的研究人员展示了该协议。
- 对蛋白质进入叶绿体的过程有了洞见。
结论
- PEG介导的转化方法对蛋白质表达是有效的。
- 这种方法允许研究体内蛋白质动态。
- 进一步的研究可以扩展叶绿体中蛋白质进口的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding protein import mechanisms into chloroplasts provides foundational insights for target validation in plant-based bioproduction systems. This protoplast-based assay enables mechanistic de-risking of nuclear-encoded protein trafficking pathways, supporting predictive confidence in chloroplast engineering for therapeutic protein expression. The method offers a disease-relevant system for evaluating targeting signal functionality and import efficiency under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates chloroplast targeting signal functionality and import kinetics for nuclear-encoded proteins.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein localization using fluorescence microscopy and immunoblotting readouts.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of transit peptide efficacy and import machinery engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot data showing precursor-to-processed protein conversion over time.
- Operational Value: Provides a reproducible protoplast isolation and transfection workflow using PEG-mediated transformation.
- Assay Readiness: Delivers dual-readout capability (fluorescence and immunoblot) for import validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage targeting signal analysis to preclinical evaluation of chloroplast-expressed biologics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein accumulation results from proper import versus cytosolic aggregation.
- Predictive Confidence: Time-dependent increase in processed protein band correlates with functional import progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation precedes lead identification, particularly for chloroplast-directed expression systems. It supports screening campaigns by providing import-competent biological systems ready for effector protein testing. Analytics derived from the assay include fluorescence co-localization metrics and immunoblot-based quantification of import efficiency.
- Discovery Biology: Tests whether candidate proteins achieve proper subcellular localization via endogenous import pathways.
- Screening: Delivers standardized protoplast preparations suitable for high-content localization screening.
- Analytics: Enables quantification of import kinetics through precursor/product band ratios in immunoblots.
- Translational Research: Informs construct design for chloroplast expression vectors by validating transit peptide functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targeting signals across protein therapeutics candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein targeting hypotheses through direct visualization of import.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable protoplast isolation protocol with defined centrifugation and resuspension steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for chloroplast expression constructs by confirming import competence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targeting sequences based on empirical import data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant protoplast isolation, PEG-mediated transfection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on enzymatic tissue digestion equipment, sucrose gradient centrifugation, and PEG solution preparation.
- Necessitates standardization of protoplast density (5×10⁶/mL) and DNA input (10 µg) for reproducible expression.
- Involves adaptation considerations when extending to non-Arabidopsis species or alternative chloroplast transformation systems.
- Practical limitations include protoplast viability window post-isolation and sensitivity to osmotic stress during PEG incubation.
