Name: 成人小鼠心脏干细胞的分离、鉴定及分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学习从成年小鼠心脏分离、鉴定和分化心脏干细胞的标准化方案。该方法采用密度梯度离心技术，为心血管疾病和心脏再生治疗研究提供经济高效的实验基础。

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本工作部分由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为HL-113281和HL116205，授予Paras Kumar Mishra。

小鼠的饲养、麻醉和处死均按照内布拉斯加医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 材料
<ol>
	<li>使用机构动物实验中心自繁的10至12周龄C57BL/6J黑色雄性小鼠，用于分离心脏干细胞（CSCs）。CSCs也可从非妊娠雌性小鼠中分离。</li>
	<li>在小鼠安乐死后前，通过高压灭菌法对所有必要的手术器械进行灭菌，包括手术剪、精细手术剪、弯柄镊子和手术刀片。</li>
	<li>在无菌条件下配制CSC分离缓冲液，并将其置于冰上4 °C保存。这些缓冲液包括密度调整为1.077 g/mL的聚蔗糖与碘海醇钠溶液、不完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium）、1x汉克平衡盐溶液（HBSS）以及细胞培养级1x磷酸盐缓冲液（PBS）。配制1%胶原酶II储备液（过滤除菌），并在HBSS中稀释为0.2%工作液。</li>
	<li>将组织培养所需材料置于生物安全柜内的无菌环境中，包括10 mm培养皿、6孔板、24孔板、T-25和T-75培养瓶、15 mL和50 mL锥形离心管，以及带有40 µm和100 µm细胞筛网和0.22 µm滤器的一次性移液管。</li>
	<li>通过高压灭菌法对10 µL、200 µL和1,000 µL的移液器吸头进行灭菌。</li>
	<li>实验全程佩戴无粉腈类手套，并使用70%乙醇维持无菌环境。</li>
	<li>使用10%次氯酸钠溶液作为消毒剂。</li>
	<li>分别使用市售的心脏干细胞维持培养基和心肌细胞分化培养基进行CSC的培养与分化。</li>
</ol>
2. 心脏干细胞的分离方法
<ol>
	<li>使用 CO2 室处死四至五只成年雄性（或未怀孕雌性）小鼠。用针或胶带将每只小鼠的前肢固定在独立的解剖纸板上。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠体表以去除外部微生物，并在心脏采集过程中维持无菌条件。用剪刀在腹部中央做切口，沿直线从腹部向上剪开皮肤至胸腔。将中线切口两侧的皮肤掀开，清除腹部区域的皮肤和毛发。使用剪刀和镊子剪开肋骨下方的膈肌。</li>
	<li>在生物安全柜内剪开肋骨以打开小鼠胸腔。暴露心脏并清除心脏周围的血液。用冰浴 PBS 冲洗心脏周围区域，以去除心脏附近的任何残留血液。</li>
	<li>使用手术剪刀和镊子分离心脏。将心脏置于含有 10 mL 冰浴 PBS 的 100 mm 培养皿中。</li>
	<li>用弯柄镊轻轻挤压心脏，以去除心脏内部的残余血液。</li>
	<li>使用完整心脏进行心脏干细胞（CSCs）的分离。</li>
	<li>将全部四至五只完整心脏转移至含有 10 mL 冰浴 HBSS 的 50 mL 锥形管中。将管子置于冰上，待后续处理。</li>
	<li>用 70% 乙醇擦拭生物安全柜的内部和外部，以建立无菌环境。用 70% 乙醇对含心脏的管子及其他所需材料进行消毒。将含心脏的管子放入生物安全柜中，准备后续操作。</li>
	<li>将心脏转移至含有 10 mL 冰浴 HBSS 的 100 mm 培养皿中。通过挤压心脏再次清洗，以去除心脏内部的任何残余血液。每次清洗后更换 HBSS 溶液，确保血液被完全清除。</li>
	<li>在含有 5–7 mL HBSS 溶液的 100 mm 培养皿中，使用精细手术剪刀或手术刀片将心脏切成小块。用一对镊子夹住每只心脏，使用精细手术剪刀或手术刀片将其切成 2–4 mm 的小片。频繁更换 HBSS 溶液，以确保使用无血的 HBSS。在 HBSS 溶液中将心脏组织切碎。</li>
	<li>将切碎的组织在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于 5–6 mL 含 0.2% 胶原酶 II 的溶液中，置于 50 mL 锥形管内。胶原酶溶液的体积应约为沉淀体积的 1.5 至 2 倍。 
	注意：用于组织消化时，0.2% 胶原酶 I 和 2.5 U/mL 分散酶溶液可替代 0.2% 胶原酶 II。分散酶溶液的体积应与胶原酶 I 溶液体积大致相等。</li>
	<li>通过振荡管子或在 37 °C 条件下以 75 x g 在摇床上摇动 45–60 分钟，使沉淀与 0.2% 胶原酶 II 溶液充分混合。每隔 20–30 分钟用手剧烈振荡管子，以增强组织裂解效果。</li>
	<li>使用&#160;5 mL 血清移液管和 1 mL 移液枪头反复吹打裂解后的组织混合物，将组织团块解离为单细胞悬液。 
	注意：为最大程度回收心脏干细胞（CSCs），吹打裂解混合物至少 5 分钟。若组织团块相对较大，可用剪刀或手术刀片剪去 1 mL 移液枪头的尖端，再用于吹打。</li>
	<li>加入市售的心脏干细胞维持培养基，以终止组织的酶消化过程。加入的维持培养基体积约为步骤 2.14 中裂解组织体积的 2–3 倍。</li>
	<li>将消化后的细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网，以去除未消化的组织碎片。</li>
	<li>使用 40 µm 细胞滤网重复步骤 2.16。</li>
	<li>通过密度梯度离心分离细胞。分离细胞时，将等体积的滤液小心地叠加在多聚蔗糖和泛影酸钠溶液上。例如，先在 50 mL 锥形管中加入 20 mL 多聚蔗糖和泛影酸钠溶液，然后将步骤 2.17 得到的 20 mL 滤液小心地加在多聚蔗糖和泛影酸钠溶液之上。 
	注意：使用前将多聚蔗糖和泛影酸钠溶液在 37 °C 预热。将步骤 2.17 的滤液非常小心且缓慢地加在多聚蔗糖和泛影酸钠溶液上，避免两种溶液混合。此步骤至关重要。</li>
	<li>将含有两种溶液的管子置于水平转子离心机中，在室温下以 500 x g 离心 20 分钟。设置较低的加速度和减速度，以避免溶液混合并确保心脏干细胞（CSCs）的正确分离。这是心脏干细胞分离中的关键步骤。将含梯度混合液的管子缓慢、平稳地放入离心机中，并开始离心。</li>
	<li>使用 1 mL 移液枪或塑料巴氏移液管，从上层液体中取出白膜层及其上方的额外液体，转移至 15 mL 无菌管中。该白膜层将含有心脏干细胞（CSCs）。 
	注意：吸取白膜层时需格外小心，避免吸取到下方的多聚蔗糖和泛影酸钠溶液层，因其对心脏干细胞具有毒性。</li>
	<li>向步骤 2.20 得到的细胞悬液中加入等体积的心脏干细胞维持培养基，并充分混匀，以中和可能残留的多聚蔗糖和泛影酸钠溶液。</li>
	<li>将上述细胞悬液在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 7–10 mL 不完全 DMEM 培养基中，并在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟，以去除任何残留的多聚蔗糖和泛影酸钠溶液。</li>
	<li>收集含有纯化心脏干细胞（CSCs）的沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 mL 心脏干细胞维持培养基中，计数心脏干细胞数量，并用于后续培养。计数时使用台盼蓝染色和血细胞计数板。使用四只雄性小鼠心脏，心脏干细胞的产量约为 180 万个。</li>
	<li>将心脏干细胞接种于涂有含 0.5% 纤连蛋白的 0.02% 明胶溶液的 6 孔培养板中。每孔加入 2 mL 完全维持培养基。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。</li>
	<li>在第三天之前，每天更换一次培养的心脏干细胞培养基。此后，每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>通过显微镜观察确定心脏干细胞的生长情况。</li>
</ol>
3. 心脏干细胞的培养维持与传代
<ol>
	<li>将分离的CSCs在市售的维持培养基中进行培养。每隔一天用新鲜的维持培养基更换培养液。当CSCs培养至汇合状态时，按照步骤2.26所述，将CSCs转移至经明胶和纤连蛋白包被的新培养板中。使用酶法细胞解离缓冲液解离培养的CSCs，并遵循标准的细胞从培养板上解离的操作流程。此阶段的CSCs被视为第0代（P0）细胞。</li>
	<li>将P0代CSCs接种于新的经明胶和纤连蛋白包被的培养板中，在37 °C、5% CO2的培养箱中，使用完全CSC维持培养基进行培养，待其生长至汇合后，按照步骤3.1操作获得第1代（P1）CSCs。将P1代CSCs储存于液氮中或用于后续实验。</li>
	<li>在6孔板中接种50万个细胞，或在T-25培养瓶中接种100万个细胞，以维持CSCs培养的初始状态。</li>
	<li>当CSCs达到85%–90%汇合时进行传代。CSCs可在维持培养基中连续培养四至六周。 
	注意：CSCs的初始接种密度应保持相对较高（40%–50%），因为在较低接种密度下，CSCs的形态可能变为扁平且拉长。</li>
</ol>
4. 心脏干细胞的表征
<ol>
	<li>为表征培养的心脏干细胞（CSCs），需在相差显微镜或明场显微镜下进行观察。将含有CSCs的培养板置于荧光显微镜的物镜下，先将放大倍数设为较低倍率（10X）以聚焦细胞，使用相差光阑观察细胞。随后更换物镜，将放大倍数提高至20X，对CSCs进行成像；再将物镜倍数提高至40X，再次对CSCs进行成像。培养两天后，CSCs呈近乎圆形，但细胞体积随时间逐渐增大，至第七天时，CSCs呈近乎圆柱形（图&#160;1A - 1C）。</li>
	<li>使用多能性/干性标志物（OCT4、SOX2或Nanog）、增殖标志物（Ki-67）（图&#160;2A - 2D）以及心脏来源/前体细胞标志物（Sca-1、NKX2-5或GATA4）（图&#160;3A - 3C）对CSCs进行免疫染色。
	<ol>
		<li>进行CSCs免疫染色时，将10,000个CSCs接种于24孔培养板中。</li>
		<li>次日（培养18–24小时后），用300 µL的4%多聚甲醛固定CSCs，固定10分钟。</li>
		<li>用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。</li>
		<li>用300 µL含0.2% Triton X-100的PBS溶液对CSCs进行通透处理，持续10分钟。</li>
		<li>用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。</li>
		<li>使用300 µL含1% BSA的PBST溶液（PBS + 0.1% Tween 20）或300 µL含10%正常鸡血清的PBST溶液，在室温下封闭CSCs 1小时。</li>
		<li>将CSCs与200 µL用封闭液稀释的一抗在4 °C下孵育过夜。一抗稀释比例应依据抗体说明书推荐或已建立的标准方法进行。</li>
		<li>用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。</li>
		<li>将CSCs与200 µL用封闭液（见步骤4.2.6）稀释的二抗在室温下孵育1小时。二抗稀释比例应依据抗体说明书推荐或已建立的标准方法进行。</li>
		<li>用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。</li>
		<li>用200 µL含DAPI（1 µg/mL）的PBS溶液对CSCs进行复染，孵育5分钟。</li>
		<li>用500 µL预冷的PBS洗涤1次，然后每孔加入300 µL预冷的PBS。</li>
		<li>使用荧光显微镜进行成像。遵循荧光成像操作说明，例如避免强光直射培养板。将培养板置于显微镜下，调节不同放大倍数对细胞进行聚焦，通过相差显微镜和/或不同激发滤光片观察细胞，并保存图像。</li>
		<li>将培养板置于4 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 心脏干细胞向心肌细胞的分化
<ol>
	<li>进行CSCs的分化时，将500,000个CSCs接种于6孔板中，加入2&#160;mL预热（37 °C）的市售CSC维持培养基。</li>
	<li>将含有CSCs的培养板置于37 °C的CO2培养箱中孵育。让CSCs贴壁并增殖至亚汇合状态。若培养基变黄，需更换为新鲜的维持培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到85%–90%时，弃去维持培养基，加入2 mL预热（37 °C）的心肌细胞分化培养基。将培养板置于37 °C的CO2培养箱中孵育，持续2–3周。</li>
	<li>每2–3天更换一次分化培养基。每次换液时在显微镜下观察CSCs的形态，以确保良好的培养状态。</li>
	<li>在分化培养基中培养CSCs 12天后，按照标准免疫染色方案检测分化标志物（见步骤4.2.1–4.2.14）。保存荧光图像以显示心肌细胞标志物的表达（图&#160;4A–4B）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该心脏干细胞（CSC）分离方案的关键步骤如下：1）从小鼠体内取出心脏时必须保持无菌条件，心脏提取过程中的任何污染都可能影响CSC的质量。2）在切碎心脏组织前必须彻底清除血液，可通过多次使用HBSS溶液洗涤完整心脏及心脏组织块来实现。3）心脏组织块必须使用胶原酶溶液完全消化，形成单细胞悬液。4）用于细胞分离的聚蔗糖和泛影酸钠梯度溶液必须预先温育。5）CSC培养所用的培养基必须预先温育。6）将CSC接种至培养皿时，细胞汇合度应较高，因为在低汇合度条件下，CSC可能发生形态改变。7）应在从心脏组织中分离出CSC后、接种至培养皿前对CSC数量进行计数。CSC的数量反映了从心脏组织中分离细胞的效率，准确计数对后续在培养板中接种CSC至关重要。
我们采用成年小鼠分离心脏干细胞（CSCs），该方法已被其他研究者在啮齿类动物模型中使用23,28。CSCs 可从新生啮齿类动物心脏29,<sup class="xre...

缺血性心脏病，包括心肌梗死（MI），是全球主要的死亡原因之一1。利用干细胞治疗来再生坏死的心肌仍是改善MI心脏功能的主要策略2,3,4,5。已有多种类型的干细胞被用于补充坏死的心肌组织并改善MI心脏的功能，大致可分为胚胎干细胞6和成体干细胞。在成体干细胞中，已应用的类型包括骨髓来源的单个核细胞7,8、骨髓来源的间充质干细胞9,10、脂肪组织来源的间充质干细胞11,12、脐带来源的间充质干细胞13以及心脏干细胞（CSCs）14,15。干细胞可通过内分泌和/或旁分泌作用促进心脏再生16,17,18,19,20。然而，干细胞治疗的一个主要局限在于获得足够数量的、能够增殖和/或向特定心肌谱系分化的干细胞21,22。自体和异体干细胞移植在干细胞治疗中仍面临重要挑战9。由于心脏干细胞来源于心脏本身，相较于非心脏来源的干细胞更易于向心肌谱系分化，因此可能成为更优的心脏再生策略。此外，使用心脏干细胞可降低畸胎瘤发生的风险。同时，心脏干细胞的内分泌和旁分泌效应（如其释放的外泌体和miRNA）可能比其他类型干细胞更为有效。因此，心脏干细胞仍是心脏再生治疗的更优选择23,24。
尽管由于心脏来源的原因，心脏干细胞（CSCs）在心肌梗死（MI）心脏中进行心脏再生更具优势，但其主要局限性在于缺乏高效的分离方法，导致产量较低。另一个局限性可能是CSCs向心肌细胞谱系分化的能力受损2,25,26,27。为了克服这些局限性，建立一种高效的心脏干细胞分离、鉴定及向心脏谱系分化的实验方案至关重要。目前尚无单一被广泛接受的心脏干细胞标志物，基于特定细胞表面标志物的分离方法所获得的CSCs数量较少。本文中，我们标准化了一种简单且经济有效的梯度离心方法，用于从小鼠心脏中分离CSCs，该方法可显著提高CSCs的得率。所分离的CSCs可通过荧光激活细胞分选技术，依据特定的细胞表面标志物进行进一步筛选。此外，我们还提供了CSCs的培养、鉴定以及向心肌细胞谱系分化的完整实验流程。因此，本文展示了一种优雅且系统的方法，用于从成年小鼠心脏中分离、鉴定、培养并诱导CSCs向心肌细胞谱系分化（图5）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠&lt;/strong&gt;</td><td>美国杰克逊实验室</td><td>货号：000664</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4-</td><td>Abcam</td><td>ab18976（兔多克隆）</td><td>OCT4-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959（兔多克隆）</td><td>SOX2-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892（兔多克隆）</td><td>Nanog-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667（兔多克隆）</td><td>Ki67-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>Millipore</td><td>AB4336（兔多克隆）</td><td>Sca I 一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>NKX2-5</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8697（山羊多克隆）</td><td>NKX2-5-一抗-1:50 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Abcam</td><td>ab84593（兔多克隆）</td><td>GATA4-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>MEF2C</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-13268（山羊多克隆）</td><td>MEF2C-一抗-1:50 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>肌钙蛋白 I</td><td>Millipore</td><td>MAB1691（小鼠单克隆）</td><td>肌钙蛋白 I-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>肌动蛋白结合蛋白</td><td>Millipore</td><td>MAB1682（小鼠单克隆）</td><td>肌动蛋白结合蛋白-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>ANP</td><td>Millipore</td><td>AB5490（小鼠多克隆）</td><td>ANP-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中</td></tr><tr><td>Alex Fluor-488 鸡抗兔</td><td>Life technology</td><td>货号：A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 山羊抗兔</td><td>Life technology</td><td>货号：A11012</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 兔抗山羊</td><td>Life technology</td><td>货号：A11078</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-488 鸡抗小鼠</td><td>Life technology</td><td>货号：A21200</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluor-594 鸡抗山羊</td><td>Life technology</td><td>货号：A21468</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSC 维持培养基</td><td>Millipore</td><td>SCM101</td><td>注：用于 CSC 培养时，使用 PBS 或不完全 DMEM 培养基洗涤细胞</td></tr><tr><td>心肌细胞分化培养基</td><td>Millipore</td><td>SCM102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞分离缓冲液：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚蔗糖与碘海醇溶液（Histopaque1077）</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>2018-03</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Dispase 溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>LONZA</td><td>S1226</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Thermoscientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>正常鸡血清</td><td>Vector laboratory</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 溶液</td><td>Applichem</td><td>A100,0010</td><td>DAPI，工作浓度为 1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Biorad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>ACROS</td><td>Cas No. 900-293-1</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20</td><td>Fisher Sceintific</td><td>批号：160170</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织培养材料：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>货号：309604</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L、200 &amp;micro;L、1000 &amp;micro;L 移液枪头</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL、10 mL、25 mL 一次性塑料移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>LEGEND X1R 离心机</td><td></td></tr><tr><td>EVOS 显微镜</td><td>Life technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Biorad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Thermo Scientific</td><td>S1 移液器辅助器</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Scientific Tool</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细手术剪刀</td><td>Fine Scientific Tool</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯柄镊</td><td>Fine Scientific Tool</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Fine Scientific Tool</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

心肌梗死（MI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。再生医学的一个主要目标是在心肌梗死后补充已坏死的心肌组织。尽管已有多种策略被用于心肌再生，干细胞治疗仍是补充心肌梗死心脏中坏死心肌的主要方法。越来越多的证据表明，成年心脏中存在内源性心脏干细胞（CSCs），并具有内分泌和/或旁分泌作用，参与心脏再生过程。然而，CSCs的分离及其鉴定和向心肌细胞（尤其是心肌细胞）的分化仍面临技术挑战。在本研究中，我们提供了一种从成年小鼠心脏中分离、鉴定及诱导CSCs分化的简便方法。本文描述了一种利用密度梯度法分离CSCs的技术，其中心脏组织通过0.2% II型胶原酶溶液进行消化。为鉴定所分离的CSCs，我们检测了CSCs/心脏标志物Sca-1、NKX2-5和GATA4，以及多能性/干性标志物OCT4、SOX2和Nanog的表达情况。我们还将分离得到的CSCs在培养皿中进行培养，并检测增殖标志物Ki-67的表达，以评估其增殖潜能。为评估CSCs的分化潜能，我们选取培养7至10天的CSCs，将其转移至含有心肌细胞分化培养基的新培养板中，在细胞培养箱中孵育12天，期间每3天更换一次分化培养基。分化后的CSCs表达心肌细胞特异性标志物：肌动蛋白结合蛋白（actinin）和肌钙蛋白I（troponin I）。因此，采用本方案分离的CSCs具有干性及心脏特异性标志物，并具备向心肌细胞谱系增殖和分化的潜能。

在本研究中，我们从10至12周龄的C57BL/6J雄性小鼠心脏中分离出心脏干细胞（CSCs）。本文介绍了一种利用多能性标志物对CSCs进行分离与鉴定的简便方法。同时，我们还展示了一种优雅的方法用于诱导CSCs向心肌细胞谱系分化，并对分化后的CSCs进行表征。在相差显微镜下观察培养2至3天的CSCs，可见其呈纺锤形形态（图1A 和 1B）。在维持培养基中培养7天后，CSCs的形态发生变化，细胞变得细长（图1C）。我们对CSCs的多能性标志物进行了鉴定，发现其表达OCT4、SOX2和Nanog（图2A - 2C）。此外，我们发现CSCs在培养基中能够增殖，并表达增殖标志物Ki-67（图2D）。为鉴定CSCs的心脏来源特性，我们检测了其心脏标志物Sca-1、NKX2-5和GA...

本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。

心肌梗死（MI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。再生医学的一个主要目标是补充因心肌梗死而死亡的心肌细胞……

本文的总体目标是建立从小鼠成年心脏中分离、鉴定和诱导心脏干细胞（CSCs）的标准化实验方案。该方法有助于回答心血管疾病及区域性治疗领域中的关键问题，例如心脏干细胞治疗和心力衰竭。该技术的主要优势在于成本低廉，并可在较短时间内高效获得大量细胞。按照方案所述，在无菌条件下准备好本实验所需的所有材料、仪器和分离缓冲液。处死小鼠后，去除其腹部皮肤，在无菌操作台内剪开肋骨以暴露胸腔。暴露心脏后，使用1毫升注射器吸除心脏附近的血液。为清除心脏附近的血液，用冰冷的PBS冲洗周围区域。使用手术剪和镊子分离心脏，并将其置于含有10毫升冰冷PBS的100毫米培养皿中。用弯柄镊轻轻挤压心脏，以去除心腔内的残留血液。将四到五个分离的心脏转移至含有10毫升冰冻汉克斯平衡盐溶液的100毫升培养皿中。再次轻轻按压心脏，以冲洗并去除心脏内部残留的血液。为确保彻底清除血液，每次冲洗后均需更换HBSS溶液。用一对镊子夹住每颗心脏，在含有5至7毫升HBSS的100毫米培养皿中，使用手术刀片将心脏切成2至4毫米大小的组织块。频繁更换溶液以确保彻底去除血液。最后，在HBSS溶液中将心脏组织进一步剪碎。 将置于50毫升锥形管中的剪碎心脏在4摄氏度下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入5至6毫升0.2% II型胶原酶溶液以消化组织。将管子置于摇床上，在37摄氏度、75 × g条件下振荡45至60分钟，充分重悬沉淀。每20至30分钟，用手剧烈振荡试管以增强裂解效果。使用5毫升血清移液管和1毫升移液枪头吹打裂解后的组织混合物，将组织团块解离成单细胞悬液。为终止组织的酶解反应，加入体积为裂解后组织2至3倍的商用CSC维持培养基。将消化后的细胞悬液通过置于50毫升锥形管上的100微米细胞筛网，以去除未消化的组织碎片。为了通过密度梯度离心分离细胞，向50毫升锥形管中加入37摄氏度预热的聚蔗糖和泛影酸钠溶液。然后，缓慢而轻柔地将等体积的滤液加在该溶液上方，避免两种溶液混合。必须将滤液沿管壁缓慢加入到聚蔗糖和泛影酸钠溶液上层，同时将试管倾斜45度，避免混合。切勿将聚蔗糖和泛影酸钠溶液加在滤液上方。将试管极其缓慢地放入水平转子离心机中，确保液体分层不被扰动。在室温下以500 × g离心20分钟，设置较低的加速度和减速度，以避免两种溶液混合，并实现心脏干细胞的有效分离。必须非常小心地加入梯度溶液，避免对离心管内溶液造成扰动。离心机的加速度和减速度必须设置为最低速度，例如1或0。使用1毫米移液器将含有CSC的上层絮状层连同过量溶液转移至15毫升无菌管中。加入等体积的CSC维持培养基，并充分混匀，以中和残留的聚蔗糖和泛影酸钠溶液。将此悬液在4摄氏度下以500 × g离心5分钟。弃去上清液。用不完全DMEM溶液至少重复洗涤CSCs两次。在4°C条件下，以500 × g离心5分钟，以去除残留的聚蔗糖和泛影酸钠溶液。去除上清液后，将含有纯化CSCs的沉淀重悬于1毫升CSC维持培养基中，然后进行细胞计数。将CSCs接种至经含0.5%纤维连接蛋白的0.02%明胶溶液包被的六孔培养板中，每孔加入2毫升完全维持培养基。于37°C、5%CO₂条件下培养细胞。当CSC培养达到汇合状态时，按照文本方案所述，将细胞转移至新的明胶和纤连蛋白包被的培养板中。将这些传代后的P0代CSC在37摄氏度、5%CO2培养箱中，用完全CSC维持培养基继续培养至汇合。重复将细胞转移至新培养板以获得P1代CSC，可用于后续实验。为了在初始阶段维持CSC培养，需按照文本方案中所述进一步接种细胞。为表征培养的细胞，将含有CSC的培养板置于荧光显微镜的物镜上。使用10倍放大倍数对细胞进行聚焦。观察细胞时，使用相差光圈，通过更换物镜将放大倍数调至20倍，然后对CSCs进行成像。完成免疫染色后，将培养板置于荧光显微镜下，以不同放大倍数对细胞进行聚焦，利用相差显微镜和不同的激发滤光片观察细胞，并保存图像。进行细胞分化时，将CSCs在六孔板中培养，每孔加入2 mL 37摄氏度预热的CSC维持培养基。当细胞融合度达到80%至95%时，弃去维持培养基，更换为2 mL 37摄氏度预热的心肌细胞分化培养基。在37摄氏度、5% CO2条件下培养，持续两到三周。每两到三天更换一次分化培养基。换液时，在显微镜下观察细胞形态，以确保培养状态良好。培养12天后，按照标准免疫荧光染色方案对细胞进行分化标志物的成像检测。在相差显微镜下观察，培养2至3天的CSCs呈纺锤形形态。培养7天后，其形态发生变化，变得更为细长。经多能性标志物免疫染色后，CSCs显示表达OCT4、SOX2和Nanog。此外，心脏干细胞（CSCs）在培养基中增殖，并表达增殖标志物Ki67。为鉴定CSCs的心脏来源特性，检测了心脏标志物的表达，结果显示这些细胞对心脏标志物Sca-1、NKX2.5和GATA4呈阳性。在心肌细胞分化培养基中培养12天后，分化的CSCs表达心肌细胞标志物ACTININ和TROPONIN-I。进行此操作时，重要的是注意不要让梯度溶液与滤液混合。同时，应将加速度和减速度设置为最低速度。无论何种情况造成污染，均建议在生物安全柜内完成所有细胞分离过程。采用此方法后，还可进行其他实验技术，如基于磁珠的分离或基于流式细胞术的细胞分选，以回答更多科学问题，例如：心脏干细胞的均一细胞群体纯度如何？心脏干细胞的裂解半径较大，是重要的标志特征，且其特性与心肌细胞存在差异。该技术的建立将为心血管疾病领域的研究者提供重要支持，使其能够从小鼠心脏中高效获取大量心脏干细胞，这在缺血性心力衰竭的再生治疗中可能具有重要意义。请注意，使用手术刀、漂白剂和二甲基亚砜（DMSO）可能存在危险，在进行本操作时，应始终采取相应防护措施，例如佩戴个人防护装备（PPE）。

isolation-characterization-differentiation-cardiac-stem-cells-from

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

成人小鼠心脏干细胞的分离、鉴定及分化

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

我们描述了一种分离成年小鼠心肌细胞的可靠方法。该方案可稳定地从多种基因修饰小鼠中培养出具有功能的成年心肌细胞。...

成年小鼠心肌细胞的分离与培养用于细胞信号转导研究 体外 心脏肥大

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146-...

从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

本文演示了从小鼠成年个体中分离窦房结心肌细胞（SAMs）的方法，可用于膜片钳电生理学或成像研究。分离的细胞可直接使用，也可在培养中维持，以实现目的蛋白（如基因编码报告蛋白）的表达。...

从小鼠成年心脏窦房结分离、培养及功能表征心肌细胞的方法

本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

从成年小鼠中分离心房心肌细胞

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

学习从成年小鼠心脏分离、鉴定和分化心脏干细胞的标准化方案。该方法采用密度梯度离心技术，为心血管疾病和心脏再生治疗研究提供经济高效的实验基础。

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

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