成人小鼠心脏干细胞的分离、鉴定及分化
2019年1月7日
本文的总体目标是规范心脏干细胞 (csc) 与成年小鼠心脏分离、表征和分化的协议。在这里, 我们描述了一种密度梯度离心方法, 以分离小鼠 csc 和详细的方法, csc 培养, 增殖, 并分化为心肌细胞。
本文的总体目标是标准化心脏干细胞、CCS与成人小鼠心脏的分离、表征和分化协议。这种方法可以帮助回答心血管疾病和区域治疗领域（如心脏干细胞治疗和心力衰竭）中关键问题。这种技术的主要优点是具有成本效益，在小时间内具有高助用性。
开始本实验，如协议所述，在灭菌条件下准备所有必要的材料、仪器和隔离缓冲液。从安乐死小鼠腹部取出皮肤后，切开无菌罩内的肋骨以打开胸腔。暴露心脏，然后用一毫升注射器去除心脏附近的血液。
要去除心脏附近的任何血液，请用冰冷的PBS清洗周围区域。使用手术剪刀和钳子解剖心脏，将心脏放在含有10毫升冰冷PBS的100毫米培养皿中。使用弯曲的刀柄钳子来心绞痛，并去除心脏内的残余血液。
将四到五颗孤立的心转移到含有 10 毫升冰冷火腿平衡盐溶液的 100 毫升培养皿中。再次洗动心脏，洗掉心脏内残留的血液。为确保完全去除血液，每次洗涤后更换HSS溶液。
用一对钳子握住每颗心脏，用手术刀片将每颗心脏切成两到四毫米，放入一个100毫米的培养皿中，其中含有5至7毫升的HPSS。经常更换溶液，以确保完全脱血。最后，在哈佛商学院解决方案中切碎心脏。
将切碎的心在50毫微锥形管中以500倍G，在4摄氏度下放置5分钟，然后丢弃上流水线。加入5至6毫升，0.2%的胶原酶II溶液到颗粒中消化组织。在 37 摄氏度的摇床上摇动管，在 37 摄氏度下，45 至 60 分钟，彻底悬浮颗粒。
每20至30分钟，用手大力摇动管子，增强解解。使用五毫升血清移液器和一毫升移液器尖端将糖化组织混合物分离成单细胞悬浮液。要停止组织的酶解，添加两到三倍的商用CSC维持介质，以体积的解酶组织。
通过放置在50毫升锥形管上的100微米细胞过滤器将消化的细胞悬浮液传递，以去除任何未消化的组织碎片。要将细胞分离为密度梯度离心，在50毫升锥形管中加入37摄氏度、预热、多糖和三酸钠溶液。然后轻轻地缓慢地在溶液上添加等量的滤液，避免两种溶液的任何混合。
在聚糖和三聚氰酸钠溶液上缓慢添加滤液，而不通过将管子倾斜在45度并倾斜在管壁上，这一点至关重要。不要过度添加聚糖和二三酸钠溶液。将管子非常缓慢地放在回转铲斗离心机中，确保不打扰溶液。
在室温下以较低的加速和减速速度离心500倍G，20分钟，以避免混合两种溶液，并正确分离心脏干细胞。在离心机中非常小心地将梯度溶液置于无干扰状态至关重要。将离心机的加速和减速必须处于最低速度，如 1 或零。
使用一毫米移液器将含有 CCS 的薄薄涂层以及额外的溶液从上层转移到 15 毫升消毒管。加入等量的CSC维护介质，并正确混合以中和残留的多糖和三酸钠溶液。在 4 摄氏度下，在 500 次 G 下将这种悬浮液离心五分钟。
丢弃上一杯。使用不完整的 DMEM 解决方案重复洗涤 CCS 至少两次。在4摄氏度下以500倍G离心5分钟，去除残留的多糖和三酸钠溶液。
去除上清液后，将含有纯化CSC的颗粒重新用一毫升CSC维护介质中，然后计算细胞数。将CSC播种在涂有0.02%明胶溶液的六井培养板中，该溶液含有0.5%纤维素，并加入两毫升完整的维护介质。在5%CO2中生长在37摄氏度的细胞。
当CSC培养达到汇合时，将细胞转移到新的明胶和纤维素涂层板，如文本协议中所述。培养这些转移的P0CSC在37摄氏度在5%CO2培养箱，直到汇合的完整CSC维护介质。将细胞转移到新板上，以制造可用于进一步实验的P1 CCS。
为了在初始阶段保持 CSC 区域性，请进一步播种单元格，如文本协议中所述。要描述培养细胞的特性，请将包含CSC的板放在荧光显微镜的目标上。使用十倍的放大率对细胞进行聚焦。
要观察细胞，请使用相位对比度光圈，通过更改目标镜头将放大倍数提高至 20 倍，然后对 CCS 进行图像。进行免疫控制后，将培养板置于荧光显微镜下。聚焦不同放大倍率的单元格，观察相位对比度下的细胞和不同的激发滤镜，并保存图像。
对于细胞分化，在六井板中生长CSC，其温度为37摄氏度，预热CSC维护介质。当细胞达到80至95%汇合时，用两毫升37摄氏度的预热心肌细胞分化介质取代维持介质。在37摄氏度下孵育，在5%CO2中孵育长达两到三周。
每两到三天更换一次分化介质。在介质变化期间，在显微镜下观察细胞形态，以确保良好的培养条件。12 天后，按照标准免疫控制协议对细胞进行分化标记图像。
在相对比显微镜下观察到两到三天的培养性 CSC 会显示主轴状形态。经过七天的文化，他们表现出形态的变化变得拉长。在对多能标记进行免疫污染后，CSC 将显示 OCT4、SOX2 和 Nanog 的表达。
此外，CSC在文化媒介中扩散，并表达扩散标记Ki67。为了描述CSC的心脏起源，检查了心脏标记的表达，并且细胞对心脏标记Sca-1、NKX2.5和GATA4呈阳性。在心肌细胞分化介质中培养12天后，分化的CSC显示心肌细胞标记ACTININ和TROPONIN-I的表达。
在尝试此过程时，必须记住不允许混合梯度溶液和滤液。将加速和减速设置为最低速度也很重要。无论谁污染它们，建议在生物安全柜内执行所有细胞隔离过程。
按照这个程序，其他方法，如磁珠为基础的分离或流细胞为基础的细胞排序方法，可以执行，以回答其他问题，如，心脏干细胞的均质种群有多清晰？心脏干细胞的裂纹半径是大标记，与心肌细胞有差异。开发后，这项技术将为心血管疾病领域的研究人员铺平道路，他们往往从小鼠心脏中高产心脏干细胞，这对缺血性心力衰竭的再生治疗可能很重要。
不要忘记，使用手术刀片、漂白剂和 DMSO 可能会很危险，在执行本程序时应始终采取预防措施，例如使用人员防护设备 PPE。
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概览
本研究旨在标准化从成年小鼠心脏中分离、表征和鉴别心脏干细胞（CSCs）的协议。该协议为解决心血管疾病的关键问题提供了一种经济有效的方法，特别是关于心脏干细胞疗法和心力衰竭。
关键研究组成部分
研究领域
- 心血管疾病
- 干细胞研究
- 心脏干细胞疗法
背景
- 心脏干细胞在心脏修复和再生中具有潜在应用。
- 该研究探索了从CSCs中提取和处理的有效方法。
- 改进方法学可以促进心血管疗法的进步。
使用的方法
- 用于CSCs分离的密度梯度离心
- 成年小鼠心脏组织的分离和培养技术
- 用于细胞表征的荧光成像
主要结果
- 成功用特定协议分离出CSCs。
- 展示了分化为心肌细胞的潜力。
- 验证了维持和表征CSCs的技术。
结论
- 该研究建立了一种可靠的CSCs分离和培养方法。
- 该研究支持未来在心脏再生和治疗方面的工作。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation and functional validation of cardiac stem cells (CSCs) from adult mouse hearts supports early-stage target de-risking in cardiovascular regenerative medicine. This protocol enables reproducible generation of a stem cell source with cardiomyogenic potential, facilitating mechanistic studies of myocardial repair pathways. The approach provides a scalable in vitro system for evaluating therapeutic hypotheses prior to in vivo validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac stem cell identity through co-expression of Sca-1, NKX2-5, GATA4, OCT4, SOX2, and Nanog markers.
- Operational Value: Provides a standardized isolation workflow using density gradient centrifugation to obtain purified CSC populations.
- Therapeutic Value: Supports target validation by demonstrating differentiation into cardiomyocytes expressing actinin and troponin I.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates proliferating CSCs validated by Ki-67 expression for use in compound screening platforms.
- Reproducibility: Defines differentiation conditions (cardiomyocyte medium, 12-day incubation, medium changes every 3 days) for consistent cardiomyocyte output.
- Scalability: Describes passaging (P0 to P1) and culture expansion on gelatin/fibronectin-coated surfaces for increased yield.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Establishes a mouse-derived CSC model aligned with ischemic heart failure pathophysiology.
- Translational Continuity: Bridges isolation to functional differentiation, enabling preclinical assessment of cardiomyogenic potential.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of paracrine effects and proliferation capacity prior to in vivo engraftment studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing in cardiovascular regenerative programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stemness and cardiac lineage commitment via marker analysis.
- Screening: Delivers standardized, proliferative CSC suspensions suitable for compound library screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of differentiation efficiency through actinin and troponin I immunostaining.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for evaluating cardiomyocyte maturation and functional maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and differentiation platform for iterative cardiac regeneration target evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of cardiac regeneration targets through validated stemness and differentiation capacity.
- Operational Value: Standardized isolation via density gradient centrifugation ensures reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by defining cardiomyocyte differentiation benchmarks.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac stem cell therapies based on in vitro differentiation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissociation, density gradient centrifugation, and sterile cell culture techniques.
- Dependent on access to centrifuge with low acceleration/deceleration settings and collagenase II for tissue digestion.
- Necessitates standardization of CSC maintenance and differentiation media formulations across teams.
- Adaptation to alternative model systems (e.g., human iPSC-derived cardiac progenitors) may require marker re-validation.
- Limited by murine source material; scalability to human tissue requires additional optimization.
