利用双相循环流动系统对真菌生物膜发育进行实时成像与定量分析

该方法有助于解答微生物学领域的关键问题，例如流体流动如何改变真菌生物膜的生长与发育。该技术的主要优势在于，能够让我们实时定量评估流动对生物膜生长和发育的影响。请按照文本方案中的描述，首先组装流动装置，然后开始本实验。

实验当天，安装气泡捕集器、温度探头以及所有一次性组件。组装滤器时，将一毫升注射器的活塞取出，使其成为接头。将滤瓶的管路强行插入该端，并在通向培养瓶的管路上连接一个2微米滤器。

在连接滑块适配器之前，先在其卡口周围涂抹硅脂真空润滑脂，以帮助防止空气泄漏进入系统。向附件烧瓶中加入100毫升YPD培养基，并向生长烧瓶中加入200毫升YPD培养基。确保绿色侧管路伸入每个烧瓶的培养基中。

确保所有阀门均处于打开状态。将除泡装置连接至真空源，并将泵连接至除泡装置下游的绿色管路一侧。以 3.3 毫升/分钟的流速泵送液体，完全充满绿色侧管路。

然后，分配并弃去约一到两毫升的培养基，因为最初的几毫升通常含有死亡的细胞或随机碎片。继续操作前，确保管路的绿色侧充满培养基，并且气泡捕集器下游无气泡。用 YPD 填充通道载玻片和储液槽，注意避免引入气泡。

将载玻片连接至流动装置，然后泵入更多液体，在橙色一侧形成约5米长的缓冲液段。这是为了防止回流时意外将空气困在载玻片内。

现在，通过首先封闭气泡捕集器的入口和出口，为将流动装置转移至显微镜做好准备。然后夹紧绿色和橙色侧接烧瓶的阀门。确保脉动阻尼器和滤瓶的螺口盖拧紧，因为在自动镀膜过程中它们可能会松动。

断开泵与管路的连接，以便更方便地进行运输。然后将所有组件（包括加热磁力搅拌器）移至显微镜附近的次级容器中。将温度探头连接到加热磁力搅拌器上，并开始将连接烧瓶加热至 37 摄氏度。

以 300 RPM 的速度搅拌培养基，并在整个实验过程中保持该转速。将载玻片安装到显微镜上，必要时使用胶带将其牢固固定。然后将气泡捕获装置连接至真空泵。

现在，将泵连接到流动装置上。以每分钟3.3毫升的流速启动泵，并使其运行约5到10秒。然后，取下气泡捕集器的进液口盖帽并进行清洗。

在连接烧瓶加热过程中，保持泵继续运行。当连接烧瓶和培养室均达到37°C时，向连接烧瓶中加入适量的真菌细胞过夜培养物，使细胞浓度达到每毫升一百万个。等待15分钟，使细胞适应环境。

打开绿色和橙色侧接培养瓶的阀门，同时关闭两个生长培养瓶的阀门，以启动细胞流动。等待约五分钟，使细胞到达载玻片。在此期间，调节显微镜，并将其成像参数调整至与先前实验相同的设置。

开始采集贴壁阶段的图像。大约5到10分钟后返回检查，确保焦点保持稳定。若焦点偏移，请在下一张图像采集完成后立即调整焦距。

在贴壁阶段结束后立即保存文件。然后打开绿色和橙色侧生长瓶的阀门，同时关闭两个贴壁瓶的阀门。如果任何阀门位于培养箱内，请注意不要碰撞载物台。

拔下温度计探头，并将附着烧瓶更换为生长烧瓶。现在，设置软件以每15分钟采集一次图像，持续22小时，并开始生长阶段的图像采集。当生长阶段的图像采集完成后且文件已保存，打开绿色和橙色侧附着烧瓶的阀门，此时橙色侧可能因压力释放而发出声响。

向上拉动来自两个培养基瓶的绿色侧边管路，使其至少高出培养基几厘米。然后以高速运行泵，将管路中的所有培养基抽出，这将使清洗过程更加容易。最后，按照文本方案中所述的方法对视频进行定量分析。

此延时暗视野显微镜视频展示了野生型白色念珠菌细胞在贴附阶段随流动附着于基底表面的过程，随后在生长阶段持续生长发育，最终形成生物膜。这些视频的数据可用于分析细胞贴附与脱离速率以及随时间变化的生物量；此处显示的是通过密度测定分析确定的成像区域内总生物量。同时展示了细胞贴附的累积速率以及随时间变化的生物量脱离百分比。

在进行该实验操作时，重要的是要记住在所有实验中使用相同的成像条件，因为这使得实验之间能够进行定量比较。