在室温和77 K条件下对生物样品进行电子顺磁共振研究的应用
2019年1月11日
电子顺磁共振（EPR）波谱法是检测自由基的明确方法。利用特异性自旋探针，可实现对细胞不同区室中自由基的检测。本文介绍一种实用且高效的生物样本采集方法，便于样本的处理、保存和转移，以进行EPR测量。
氧化还原信号的失调与多种疾病的发病机制相关。氧化还原生物学的研究需要准确检测不同细胞和组织区室中的活性氧物质。电子顺磁共振（EPR）波谱法是唯一能够明确测定自由基的方法。
本方案展示了一种用于电子顺磁共振（EPR）波谱学的生物样本处理与保存的实用方法。这些方案阐述了EPR技术及自旋探针在两种代表性模型中的应用。尽管这些方法也可经调整后用于评估其他生物体系中的活性物质。
实验设计和样本处理对其可重复性至关重要。我们建议考虑细胞密度，并确保设置适当的时间匹配对照。首先，每孔使用一毫升克雷布斯-亨塞莱特缓冲液（Krebs-Henseleit Buffer）或KHB，轻柔地清洗RAW 264.7细胞。
向每孔细胞加入500微升KHB，其中添加100微摩尔DTPA。若需用超氧化物歧化酶预处理，则向每孔加入15微升超氧化物歧化酶储备液或载体溶液，将培养板置于37摄氏度孵育10分钟。超氧化物歧化酶预处理结束后，向相应孔中加入12.5微升10毫摩尔CMH溶液和40微升125微摩尔PMA工作液，于37摄氏度孵育50分钟。
立即将培养板置于冰上，并将每个孔中的缓冲液收集到预冷的1.5毫升离心管中。接着，向每个孔中加入100微升新鲜的KHB加DTPA溶液，轻轻刮取孔底的细胞。然后通过移液重悬细胞悬液，并将细胞转移至预冷的1.5毫升离心管中。
在室温下检测超氧阴离子时，首先将50微升的一种缓冲液或细胞样品加入毛细管中，并密封该管。立即将毛细管放入电子顺磁共振（EPR）波谱仪中，并设置EPR采集参数以进行室温测量。始终使用在相同实验条件下处理的、含有相同浓度探针的缓冲液空白样品作为对照进行检测。
在77开尔文下检测超氧时，取150微升样品加入一段一至两英寸长的直型聚四氟乙烯（PTFE）管中，管的一端用橡胶塞封住。用第二个塞子密封管的另一端，并将样品在液氮中快速冷冻。然后迅速移除塞子，将PTFE管放入标记好的冻存管中，置于液氮中保存。
进行电子顺磁共振（EPR）测量时，将EPR波谱仪的指形杜瓦瓶中装入液氮，并将含有样品的聚四氟乙烯（PTFE）管置于液氮中。将指形杜瓦瓶放入EPR波谱仪内，并设置EPR采集参数，以在77开尔文温度下进行测量。对于冷冻肺组织中的活性氧（ROS）检测，将组织置于干冰上，并使用镊子在干冰上固定快速冷冻的组织。
将样品切成五份，每份15毫克，并在已去皮重的1.5毫升离心管中称重。向样品中加入196微升KHB加DTPA溶液和4微升CMH，然后将肺组织样品置于37°C水浴中孵育1小时，再通过短暂离心沉淀组织碎片。随后将样品置于冰上，取150微升上清液转移至一段PTFE管中，进行快速冷冻，以备后续EPR检测，操作方法如前所示。
如所示，对经PMA刺激的RAW 264.7细胞中总超氧阴离子生成的评估表明，由于自旋探针具有通透性且能快速达到平衡，PMA处理组细胞悬液和缓冲液中的硝酰自由基浓度相似。与对照细胞相比，经PMA刺激的RAW 264.7细胞中硝酰自由基信号增强，但在预先用细胞不可渗透的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase）处理的细胞中则无此现象。在低温条件下，RAW 264.7细胞经PMA刺激后所测得的硝酰自由基浓度在存在超氧化物歧化酶时亦受到抑制，该结果与室温下的数据一致。
与PBS处理的对照组相比，博来霉素处理小鼠（bleo小鼠）及损伤小鼠的血液和支气管肺泡灌洗液中的硝基氧化物浓度升高，且从这些小鼠收获的肺组织碎片上清液中硝基氧化物浓度也升高。此外，在经眼眶后注射自旋探针后，bleo小鼠及处理动物显示出比对照组更高的自旋探针信号。这些实用的实验方案将使研究人员能够利用电子顺磁共振（EPR）技术，在包括低温测量在内的条件下，检测不同细胞区室和生物样品中的自由基生成情况。
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概述
本文介绍了一种用于收集和处理电子顺磁共振（EPR）光谱学生物样品的实用方法。EPR 是一种能够明确测定自由基的独特技术，而自由基在氧化还原生物学中具有关键作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 氧化还原生物学
- 电子顺磁共振（EPR）波谱法
- 自由基检测
背景
- 氧化还原信号失调与多种疾病相关。
- 在生物研究中，准确检测活性氧至关重要。
- 电子顺磁共振（EPR）波谱法是唯一能够明确测定自由基的方法。
- 本研究聚焦于生物样本的处理与保存方案。
研究目的
- 演示一种用于电子顺磁共振（EPR）波谱学的实用样品采集方法。
- 阐明选择性自旋探针在生物环境中的应用。
- 提供可适用于多种生物模型的实验方案。
使用的方法
- 用于电子顺磁共振（EPR）测量的生物样品采集。
- 利用选择性自旋探针检测自由基。
- 样品处理与保存的操作规程。
- 在代表性生物模型中应用相关方法。
主要结果
- 这些方案可有效促进样本的处理与保存。
- EPR 能谱法可提供自由基的可靠测量结果。
- 自旋探针可适用于多种生物环境。
- 该研究展示了 EPR 在氧化还原生物学中的多功能性。
结论
- EPR 能谱法是研究自由基的有力工具。
- 正确的样品处理对于获得准确测量结果至关重要。
- 所介绍的方法可促进氧化还原生物学领域的研究。
常见问题
行业重要性概述
准确检测活性氧（ROS）对于理解疾病机制中的氧化还原信号传导和靶点验证至关重要。电子顺磁共振（EPR）波谱法可对自由基进行明确且直接的测量，有助于在早期发现阶段降低机制风险。该方法通过实现细胞和组织模型中特定区室的ROS定量，为临床前项目中的“推进/终止”决策提供依据，从而提升预测的可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过高特异性检测特定活性氧（ROS）物种的生理水平，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：利用细胞可渗透探针和超氧化物歧化酶（SOD）对照，区分胞外与胞质超氧化物，明确信号通路的参与情况。
- 预测价值：在与疾病相关的模型中，通过定量、区室分辨的超氧化物测量，支持生物学风险的降低。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：通过标准化的自旋探针标记和样本稳定化，制备可用于下游工作的已验证生物系统。
- 可重复性：支持样本在 -80°C 下储存并在 77 K 下进行分析，确保不同批次和不同实验地点间电子顺磁共振（EPR）测量结果的一致性。
- 可扩展性：通过允许冷冻样本的转移和重复使用，支持高通量筛选中的可靠化合物评估。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：可检测损伤模型中肺组织、血液及支气管肺泡灌洗液中的超氧阴离子，支持转化生物标志物的一致性验证。
- 临床前连续性：通过相同的自旋探针检测策略（如 CPH、mito-TEMPO-H），将体外研究结果与体内模型相连接。
- 风险调整后的推进：通过在相关病理生理环境中确认活性氧（ROS）调控所介导的靶点结合，为后续研究推进决策提供依据。
流程与工作流整合
EPR 能谱技术贯穿从靶点验证到临床前验证的整个发现过程，可为基于机制的氧化还原信号效应提供正交确认。
- 发现生物学：利用选择性自旋探针和酶学对照，定量特定细胞区室中的超氧阴离子，支持假设验证。
- 筛选：通过可重复的样品制备和冷冻保存，实现检测就绪状态，可在化合物库中获得一致的自由基读数。
- 分析：生成与超氧阴离子浓度成正比的定量氮氧自由基信号，支持不同条件间的比较及剂量-反应评估。
- 转化研究：通过检测疾病模型中获取的组织上清液和生物体液中的活性氧（ROS），连接发现研究与临床前验证。
- 企业级复用：建立可在不同治疗领域重复使用的氧化还原谱分析平台，减少重复的方法开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：提供明确的自由基检测结果，减少氧化还原通路验证中的机制不确定性。
- 操作价值：通过标准化的自旋探针动力学、受控的样品处理以及低温测量选项，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过提供靶点介导的活性氧调控的直接证据，改善“推进/终止”决策，降低后期生物学研发失败率。
- 项目组合影响：通过确认化合物在与疾病相关体系中的机制保真度，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 准确选择探针并解释数据需要具备电子顺磁共振（EPR）波谱学和自旋探针化学方面的专业知识。
- 需要能够进行室温和77 K条件下测量的EPR波谱仪设备支持。
- 为确保数据可比性，必须采用标准化的细胞密度、孵育时间以及匹配的对照实验方案。
- 针对不同模型系统（如培养细胞与肺组织）在探针递送和组织处理方面需考虑相应的适应性调整。
- 存在实际操作限制，包括需要使用在低温下稳定的专用管路，以及需谨慎操作以防止自旋探针降解。
