利用天然绿色凝胶电泳分离菠菜类囊体蛋白复合物及通过时间相关单光子计数进行条带表征

该方法有助于回答光合作用研究领域中的一些关键问题，例如：假定的类囊体复合物是否为具有能量连接组分的生理真实复合物？本文所述的绿色凝胶与时间相关单光子计数（TCSPC）方案的主要优势在于其快速且稳健。样品可在一天内完成处理与分析，从而降低了储存与稳定性方面的问题。

尽管时间相关单光子计数（TCSPC）可为我们在此研究的光合系统提供深入见解，但它也可应用于其他系统，范围涵盖化学、物理和生物领域，例如液体、细胞或单分子层及离子液体等新型结构体系中荧光分子运动的研究。开始本实验前，请按照文本方案中所述制备所需的储备溶液和绿色迷你凝胶。接着，准备一些冰并调暗灯光。

使用玻璃Dounce匀浆器，在约一到两毫升TMK缓冲液中将菠菜叶片彻底匀浆。为制作一个简单的过滤装置，将一块精细擦拭布剪成两半，并折叠成四层。取下注射器的活塞，然后将折叠好的擦拭布塞入注射器底部。

用移液器将叶片匀浆液滴加至拭子滤膜的中心，然后使用推杆使匀浆液通过滤膜，并收集到1.5毫升离心管中。在4°C条件下以5,000 g离心10分钟，使不溶性物质（包括类囊体膜）沉淀。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升TMK缓冲液中。

为从每个样品中提取叶绿素，取50微升等分试样并转移至1.5毫升微量离心管中。加入950微升甲醇，盖紧管盖，并通过反复倒置混匀。在10,000 g离心10分钟，以沉淀析出的蛋白质。

根据叶绿素浓度测定结果进行调整，必要时从每个样品中移除并弃去部分体积，直至每支试管中的叶绿素总量相等。在5,000 g离心10分钟，重新沉淀类囊体膜。小心移除并弃去上清液，确保完全去除上清液的同时不扰动沉淀物。

首先，解冻一份TMK 30%甘油去污剂溶液。颠倒混匀数次，并将溶液置于冰上保存。加入适量的去污剂溶液以溶解沉淀，使叶绿素的终浓度达到1毫克/毫升。

反复吹打混匀，注意避免样品产生气泡。然后将样品置于冰上，使类囊体样品充分溶解。溶解完成后，在 10,000 g、4 °C 条件下离心 10 分钟，使不溶性物质沉淀，得到澄清的深绿色上清液。

此后，将15微升溶解的类囊体上清液直接加样至预先制备的1.5毫米天然凝胶的每个加样孔中。使用1×电泳缓冲液，以100伏电压开始电泳运行天然绿色凝胶。在整个电泳过程中，将整个凝胶槽置于湿冰上，以减少电阻产生的热量。

当凝胶电泳完成后，将凝胶从电泳槽中取出，并用蒸馏水冲洗掉凝胶板上的电泳缓冲液。移除凝胶的上层玻璃板，然后用蒸馏水冲洗凝胶。将仍附着在底层玻璃板上的凝胶置于冰上；当不使用时，用塑料膜覆盖并避光保存，以防止凝胶干燥。

接下来，当准备进行时间相关单光子计数（TCSPC）分析时，使用锋利的手术刀或剃刀片切下每条目标条带。确保切下的条带不含有任何污染性条带物质。对于每个待分析的复合物，使用荧光光谱仪在600至800纳米范围内测定室温荧光光谱。

在载玻片的两端贴上医用胶带，并反复折叠数次以形成垫片，从而确保载玻片能够牢固地贴合在一起，同时不会压缩中间的空间，然后将凝胶切片夹在两片玻璃显微载玻片之间。在玻璃载玻片边缘的凝胶切片上加入少量水，以形成光滑的界面，减少信号散射。接着，将凝胶夹心结构固定在光束路径中，使光束通过载玻片的开口边缘照射到凝胶切片上。

针对每个复合物，在荧光发射光谱范围内以固定间隔采集共计 10,000 个数据点。为分析特定复合物的数据，首先将所采集各波长下每条衰减曲线的峰值高度进行归一化处理，然后按照文本方案中所述方法，将每条衰减曲线的尾部与该复合物的稳态荧光光谱进行匹配。绿色凝胶电泳的代表性结果展示了分析菠菜类囊体时的理想结果，其中可见多条清晰锐利的绿色条带。

泳道2和3展示了通过简单的类囊体分离并在非梯度5%丙烯酰胺凝胶上电泳所获得的较为典型的结果。泳道4、5和6示例了由于类囊体样品溶解不足程度逐渐增加而导致的较差结果，而泳道7则展示了使用拟南芥类囊体代替菠菜类囊体时所能获得的结果。在将TCSPC数据的衰减曲线调整至相同的时间刻度后，可将其归一化为相同的峰值高度，从而可在数据的初步分析中对曲线进行比较。

在特定波长下，可将来自不同复合物的峰值归一化衰减曲线相互叠加，从而直观地观察各复合物之间行为的差异。通过对衰减曲线进行尾部匹配，可构建衰减相关光谱。如图所示，LHCII 的衰减相关光谱显著之处在于缺乏动态特征，且随着信号随时间衰减，LHCII 荧光光谱的形状保持不变。

荧光光谱的衰减也被延迟，需要100皮秒才能达到最大荧光强度。这表明在荧光衰减过程中，能量并未在复合物内具有不同能量状态的色素之间发生转移。随后，构建了Band 5复合物的衰减相关光谱。

与LHCII相比，5号条带的荧光衰减要快得多，仅在30皮秒内即达到最大强度，随后在500皮秒后衰减至初始强度的20%以下。在进行该实验操作时，需注意TCSPC数据的解析依赖于额外的生物化学信息，以鉴定所研究复合物的组分，例如通过二维SDS-PAGE、蛋白质印迹（Western Blotting）或质谱分析。