基于类病毒系统的Escherichia coli中环形支架上大规模生产重组RNA

该方法可用于生产大量目标重组RNA，适用于科研或工业应用。其主要优势在于，重组RNA可在大肠杆菌（Escherichia coli）中以低成本的方式进行生产，并且易于放大规模。重要的是，RNA在环状RNA支架上生成，这有助于实现均一性的纯化。

与DNA或蛋白质不同，目标RNA难以通过生物工厂系统（如大肠杆菌培养）大量生产。我们的方法基于将目标RNA插入一个高度稳定的环状骨架中进行共表达，并使用介导RNA环化的连接酶。该环状RNA骨架来源于一项专利的类病毒。

类病毒是相对较小、不形成超螺旋、具有高度碱基配对的环状RNA，可感染某些高等植物。在常规实验室条件下，每升细菌培养物可生产数十毫克的重组RNA。开始该实验步骤时，按照文本方案中所述，通过PCR扩增cDNA。

接下来，将100纳克质粒pLELVd-BZB加入一个0.5毫升离心管中。加入10 U的IIS型限制性内切酶BpiI，以及足够的缓冲液G，配制成20微升的反应体系。在37摄氏度孵育1小时，以消化质粒。

此后，使用含有一％琼脂糖凝胶的TAE缓冲液对PCR产物和消化产物进行电泳分离。将凝胶置于200毫升浓度为0.5微克/毫升的溴化乙锭溶液中振荡染色。使用紫外透射仪观察DNA。

使用手术刀切下对应于扩增的 cDNA 和经 BpiI 消化质粒的条带。利用硅胶柱从凝胶片段中洗脱 DNA。通过分光光度分析测定 DNA 的浓度。

使用扩增的cDNA和酶切后的质粒进行Gibson Assembly反应。在50摄氏度孵育一小时。然后，使用硅胶柱纯化反应产物。

电穿孔转化感受态大肠杆菌DH5-Alpha细胞后，挑取数个白色菌落并转移至液体LB培养基中。在37摄氏度下过夜培养菌落。接着，使用质粒小提试剂盒纯化质粒，并在TAE缓冲液中通过1%琼脂糖凝胶电泳分析其大小。

首先，将选定的大肠杆菌菌株与含有目标RNA对应cDNA的pLELVd-BZB衍生物质粒以及P15LTRNISM质粒共同进行电穿孔转化，以共表达茄子tRNA连接酶。将SOC液体培养基加入电穿孔比色皿中以复苏细胞，并在37摄氏度下孵育1小时。随后，将细菌涂布于含有50微克/毫升氨苄青霉素和34微克/毫升氯霉素的LB固体培养基平板上。

在37摄氏度下孵育过夜。第二天，向一个1升带挡板的锥形瓶中加入250毫升液体TB培养基，其中含有50微克/毫升氨苄青霉素和34微克/毫升氯霉素。取出孵育后的E.Coli，挑取单菌落接种至锥形瓶的培养基中。

收获细菌前，在37摄氏度、180转/分钟剧烈振荡条件下孵育12至16小时。将收获的大肠杆菌（E. coli）培养物倒入250毫升离心瓶中，在14,000 ×g 条件下离心10分钟以沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于30毫升水中。

将此悬浮液转移至离心管中，再次使用先前的条件离心收集细胞。弃去上清液，向细胞沉淀中加入10毫升层析缓冲液。涡旋振荡以使细胞在缓冲液中充分重悬。

加入等体积的苯酚：氯仿，剧烈涡旋以裂解细胞。然后在12,000 G离心10分钟。收集水相，加入等体积氯仿，剧烈涡旋。

在 12,000 G 条件下离心 10 分钟。随后，通过 45 微米针头滤器过滤 RNA 样品。使用连接至液相色谱系统的 1 毫升二乙基乙醇胺柱纯化 RNA。

调节流速至每分钟1毫升，用10毫升层析缓冲液平衡层析柱。然后上样，并用10毫升层析缓冲液洗涤层析柱。用20毫升洗脱缓冲液洗脱RNA，收集每份1毫升的组分。

采用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，将环状RNA与其线性对应物分离。首先，按照文本方案中的说明，在TBE缓冲液中配制含有8摩尔尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶。将20微升RNA样品与一倍体积的上样缓冲液混合。

在加热块中95摄氏度孵育1.5分钟，然后迅速在冰上冷却。将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中，并根据凝胶尺寸选择适当条件进行电泳。随后，将凝胶置于含0.5微克/毫升溴化乙锭的溶液中染色15分钟。

用清水洗涤染色后的凝胶，然后在紫外光下观察RNA。当比较插入不同cDNA的多种重组质粒与pLELVd-BZB时，电泳分析显示其迁移速率存在差异。需要注意的是，pLELVd-BZB含有lacZ标记基因，该基因被对应于目标RNA的cDNA所取代，因此尽管迁移速率取决于插入cDNA的大小，重组质粒通常比对照质粒迁移得更快。

通过裂解共电穿孔的细菌培养物并利用变性PAGE分析RNA，可监测重组RNA在细菌中的产生情况。可观察到明显的条带，对应于空载ELVd以及嵌合型ELVd形式，其中插入了不同的目标RNA。有趣的是，大部分重组RNA以环状形式存在。

通过在高离子强度和低离子强度条件下，结合使用两种变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可观察到主组分的环状特性。RNA 样品可通过阴离子交换色谱进一步纯化。如图所示，大肠杆菌（E. coli）RNA 在低离子强度下被有效保留，随后在高离子强度下洗脱，大部分 RNA 收集于第2和第3洗脱组分中。

重组RNA可通过二维电泳进一步纯化至均一。该方案利用最终产物的环状特性，可在大肠杆菌中高效生产大量重组RNA并实现均一纯化。请注意，目标RNA嵌入于源自植物类病毒的环状RNA支架中。

如果需要分离两个部分，则必须使用标准策略，例如核酶、脱氧核酶或RNase H。本方案的产量取决于目标RNA的特性，因为小RNA的产量通常高于大RNA。对于大规模表达，需注意细菌收获的最佳时间取决于多种因素，包括大肠杆菌菌株、培养基和生长条件。我们建议进行初步的时间过程实验，以确定在特定条件下的最佳生产窗口。

请记住，重组RNA在细菌细胞中是短暂积累的，并且在生长后期会完全消失。