Name: 果蝇视觉系统中低丰细胞的纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学习使用荧光激活细胞分选技术从果蝇视觉系统中纯化低丰度细胞的方法。该方案结合木瓜蛋白酶解离与FACS技术，可高效分离稀有细胞类型，为转录组学和基因组学研究提供支持，助力深入理解细胞多样性与组织形成机制。

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本研究由美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）资助，资助编号为 K01NS094545，以及来自神经退行性疾病研究勒弗勒中心的资助。我们感谢Liming Tan和Jason McEwan提出的宝贵意见。

1. 实验前的规划
<ol>
	<li>在开始实验之前，先进行小规模的预实验，以确认遗传标记是否按预期工作，能够特异性地标记目标细胞。
	<ol>
		<li>初步可通过免疫组织化学染色和光学显微镜观察，判断是否有非目标细胞被标记。理想情况下，遗传标记在视网膜和视叶中具有特异性（图3）。由于仅使用视叶进行细胞解离，因此中央脑区的标记不会造成影响。同时，确定每只果蝇大脑中标记的目标细胞数量。</li>
		<li>若遗传标记具有理想的特异性，可进一步开展预实验性质的流式细胞分选（FACS）实验（图4），以评估是否能够稳定地分离出纯度较高的目标细胞群体，并估算每只大脑可分离出的目标细胞数量。如有需要，可通过定量PCR检测分离细胞的纯度，评估特定基因的富集或去富集情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定为获得实验所需材料量而需设置的杂交组合数量。 
	注意：根据实验经验，使用本方案通常可稳定分离出约17–25%的荧光标记细胞，且仅需1,000个经FACS纯化的细胞即可获得高质量的RNA测序数据（更少的细胞数也可能足够）。
	<ol>
		<li>若需获得1,000个用于RNA-seq分析的细胞，应确保每只大脑中至少有40个目标细胞被荧光标记（每个视叶约20个）。每只大脑平均可纯化约10个目标细胞，因此需解剖100只果蝇的大脑。</li>
		<li>为在每次实验中获得约100只处于合适发育阶段的果蝇用于解剖，若需排除平衡染色体，则通常需设置约100个杂交组合（具体数量取决于亲本基因型）。若目标等位基因/转基因为纯合状态，则可减少杂交组合数量。</li>
		<li>建议将解剖时间窗口控制在1小时内，以最大限度维持细胞活性，并减少大脑解剖后可能发生的基因表达和基因组结构的非特异性变化，但此时间可根据实际情况调整。根据解剖人员的技术熟练程度，确定在1小时内完成100只大脑解剖所需的解剖人员数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 果蝇实验
注意：果蝇在未特别说明的情况下，均在25 °C、约50%湿度条件下培养。以下雌性基因型表示为基因型F，雄性基因型表示为基因型M。
<ol>
	<li>扩增种群
	<ol>
		<li>获取约100管基因型为F的年轻果蝇（不超过一周龄）和约30管基因型为M的果蝇。</li>
		<li>在第1周的星期四，将100管基因型F的果蝇转移到新鲜培养基上。从星期五开始，每天翻管一次，直至第2周的星期二。这6次翻管所得的果蝇用于收集处女蝇。同时在第2周的星期三，将基因型M的果蝇转移到新鲜培养基上，并在第2周的星期五清除亲代果蝇。这些试管将用于收集杂交所需的雄蝇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集处女蝇
	<ol>
		<li>从第3周的星期一开始，从基因型F的试管中收集处女蝇。每天收集2–3次，并将收集到的处女蝇储存在18 °C、相对湿度约50%的环境中。重复此操作直至第4周的星期二。强烈建议尽可能多地收集处女蝇，因为在设置杂交前会有大量处女蝇死亡&#160;。通常，为设置100个杂交组合，应收集约2,500只处女蝇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置杂交
	<ol>
		<li>在第4周的星期五，按所需数量设置杂交组合（通常每个实验设置100–200个杂交组合），每个杂交组合包含15只基因型F的处女蝇和7只基因型M的雄蝇。必须使用年轻且健康、翅膀完整的雄蝇。</li>
		<li>从第5周的星期天到星期六，每天翻管一次。若发现有果蝇死亡，应及时补充新鲜的处女蝇或雄蝇。必须防止培养基干燥，根据需要适时加水。干燥的培养基会显著降低杂交产出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS分选的阴性对照
	<ol>
		<li>在进行FACS分选时，应设置一个未标记目标细胞的阴性对照。理想情况下，阴性对照应含有报告基因（例如 UAS-GFP），但不含驱动基因（例如 GAL4），以便确定报告基因的基础表达水平（UAS构建体可能存在“渗漏”表达&#34;leaky&#34;），从而为FACS分选设定合适的门控参数。阴性对照果蝇应与实验组果蝇同时翻管，并以相同方式同步发育阶段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛹期同步化
	<ol>
		<li>为在蛹发育的特定阶段（例如 蛹壳形成后40小时 [h APF]）收集细胞，需在1小时的时间窗口内对蛹进行同步化处理，以匹配解剖操作所预留的1小时时间段（如前所述）。细胞解离后应立即进行FACS分析，而解离过程在解剖后进行，耗时约40分钟。因此，同步化和解剖的具体时间取决于FACS仪器的可用时间。</li>
		<li>为获得40 h APF的蛹，应在第6周的星期一特定时间点（例如 下午5点）进行同步化处理，以便在40小时后（例如 星期三上午9点）进行解剖。使用湿润的画笔轻轻挑取白色前蛹，并将其置于预热过的试管壁上。仅挑选具有目标基因型的蛹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物学重复
	<ol>
		<li>每个实验至少进行3次生物学重复。一种简便的方法是在同一周（第6周）内使用相同的杂交组合重复实验三次。例如，分别在星期二和星期三对第二和第三次重复进行蛹期同步化处理，并分别在星期四和星期五进行解剖。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品制备
注意：本方案中使用的所有试剂均列于材料表中。
<ol>
	<li>准备用于解剖和组织解离的溶液
	<ol>
		<li>配制蛋白酶混合物储备液（参见 材料表) 通过用ddH₂O重悬冻干酶来实现2O 至浓度为 26 Wünsch 单位（Wu）/mL。对于含有 260 Wu（大瓶）的西林瓶，加入 10 mL ddH₂O。2将溶液加入小瓶中，分装成单次使用量（每次解离需要4.2 µL）。将储备液保存于-20 °C。每次实验需要解离两个样本（阴性对照和实验组织）。</li>
		<li>在解剖前一天（第6周的星期一）配制10倍浓度的里纳尔迪尼溶液（Rinaldini's Solution, RS）和完全 Schneider 培养基（Complete Schneider's Media, CSM）。每位解剖操作者准备5 mL CSM，每2个样本（阴性对照组和实验组）的消化需准备约5 mL 1× RS 和 5 mL CSM。10× RS 可在4 °C保存一个月，CSM 可在4 °C保存一周。
		<ol>
			<li>配制 100 mL 10x RS 溶液：溶解 8 g NaCl、200 mg KCl、50 mg NaH₂PO₄ 和 185 mg Na₂HPO₄ 于去离子水中，用去离子水定容至 100 mL。2PO4，1 g NaHCO₃3 以及1 g葡萄糖溶于100 mL ddH₂O中2在250 mL烧杯中。使用0.22 mm滤器过滤除菌。</li>
			<li>将20 mg L-谷胱甘肽加入1 mL ddH₂O中2在微量离心管中。</li>
			<li>配制50 mL CSM：将5 mL热灭活牛血清、0.1 mL 10 mg/mL胰岛素溶液、5 mL 200 mM L-谷氨酰胺溶液、12.5 μL 20 mg/mL L-谷胱甘肽和1 mL青霉素-链霉素溶液（每毫升含5,000单位青霉素和5 mg链霉素）加入38.9 mL Schneider's培养基中，混匀。使用0.22 mm滤器过滤除菌。</li>
			<li>用ddH₂O将10x RS稀释2O 以配制1x RS工作液。为每个样本在非粘性微量离心管中准备500 μL的1x RS。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>打开水浴锅，将温度设置为 37 °C。使用温度计确认温度准确。在激活木瓜蛋白酶之前，水浴锅必须达到正确温度。建议在早晨解剖前一晚即设置好温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备木瓜蛋白酶和蛋白酶混合物 
	注意：每次消化前均需新鲜配制木瓜蛋白酶溶液。
	<ol>
		<li>在第6周星期二开始解剖前约45分钟，从4 °C取出1管木瓜蛋白酶粉末，置于室温孵育。同时将CSM移至一个Eppendorf管中，于室温放置，后续用于加入木瓜蛋白酶粉末中。</li>
		<li>在开始解剖前1分钟，使用注射器将室温的CSM加入木瓜蛋白酶小瓶中（直接穿刺瓶盖），使终浓度为100单位/mL（每瓶粉末含量略有不同；对于含123单位的瓶子，加入1.23 mL CSM）。混匀时，先倒置小瓶以收集粘附在瓶盖内侧的粉末，然后用移液器反复吹打混匀。</li>
		<li>将小瓶放入水浴锅中盛有37 °C水的烧杯内，确保木瓜蛋白酶溶液小瓶未漂浮。在37 °C条件下活化木瓜蛋白酶30分钟。</li>
		<li>将木瓜蛋白酶加入水浴中的烧杯后，从-20 °C取出一份蛋白酶混合液（26 Wu/mL），于室温下孵育。激活30分钟后，将木瓜蛋白酶置于室温下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖
	<ol>
		<li>在第6周的星期二，用洁净的镊子在冷的CSM中解剖处于特定发育阶段的蛹脑，并在视叶与中央脑的连接处夹断，去除视叶。</li>
		<li>将组织块加入含有500 μL 1x RS溶液的微量离心管底部（实验组织和阴性对照组织各使用一支微管）。始终将离心管置于冰上。</li>
		<li>在1小时内尽可能解剖多个叶。对于阴性对照组织，解剖10个叶已足够。将解剖得到的视叶合并至同一微量离心管中，以避免在微量离心管之间转移时造成组织损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞解离
	<ol>
		<li>使用P200移液器小心地从含有解剖所得视叶的微量离心管中移除1x RS，保留足以覆盖组织的液体量。沿管壁小心加入500 μL的1x RS，尽量减少对脑组织的扰动。始终将离心管置于冰上。</li>
		<li>让叶状物沉降至底部。仅一次，吸取200 μL并吹打混合（叶状物应随之移动）。再次让叶状物沉降。</li>
		<li>将600 μL活化的室温木瓜蛋白酶分装至两个样本（实验组和阴性对照组）的微量离心管中。向每管600 μL木瓜蛋白酶溶液中加入4.2 μL室温蛋白酶混合液，使终浓度达到0.18 Wu/mL。通过移液器反复吹打混匀。此即为解离溶液。</li>
		<li>小心移除每个样本中的1x RS，并向组织小叶中加入300 μL解离溶液。将样本置于微量离心管恒温混匀仪中，在25 °C、1,000 rpm条件下孵育15分钟。</li>
		<li>在5分钟和10分钟时间点，停止恒温混匀仪，使叶状组织沉降至微量管底部。吸取200 μL溶液，用移液器吹打混匀。</li>
		<li>孵育15分钟后，让肺叶沉降至底部，小心移除肺叶周围的解离液（注意不要扰动肺叶）。</li>
		<li>用1× RS洗涤两次。操作时，小心加入500 μL 1× RS（尽量不要扰动叶状结构）。为混匀，轻轻用移液器吸取200 μL，再重新排入微量离心管中。待叶状结构沉降至管底后，重复该步骤。</li>
		<li>每个样本用 500 μL CSM 洗涤两次（与前一步相同）。</li>
		<li>小心移除CSM，向管中再加入200 μL CSM。使用P200移液器上下吹打，使组织充分分散，注意避免产生气泡，直至溶液呈均匀状态（即， 再也看不到任何组织残留物。</li>
		<li>将细胞悬液通过装有30 μm滤网帽的5 mL FACS管在冰上过滤（使用P200枪头，确保全部悬液均通过滤网）。加入500 μL CSM冲洗解离微管，并将冲洗液过滤至同一FACS管中。</li>
		<li>小心取下FACS管的管盖，用P200移液器收集滤网下方的溶液，并将其加入FACS管中其余的悬液中。样品现已准备好用于FACS分析。</li>
		<li>务必提前准备好用于收集FACS纯化细胞的微量离心管。进行RNA-seq时，将每个样本的细胞直接分选至含有300 μL RLT缓冲液（裂解缓冲液）的微量离心管中，RLT缓冲液来自RNA纯化试剂盒（按1:100加入2-使用前加入巯基乙醇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS 分选 
	注意：解离后应立即通过流式细胞术（FACS）分选细胞（最长不超过1小时）。实验规划时，需提前预约相应的FACS分选时段。通常使用配备100 μm喷嘴的细胞分选仪。
	<ol>
		<li>将阴性对照样本与实验样本中的细胞分布进行比较，以设定分选门控。理想情况下，应在预实验的流式细胞分选（FACS）中预先建立门控策略，阴性对照样本可用于确认或微调已预设的门控。目标细胞应在阴性对照和实验样本中均与背景细胞实现良好分离。图4（在预实验中对此进行测试）。</li>
		<li>将分选后的细胞收集到预先准备好的收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA纯化
	<ol>
		<li>将细胞直接分选至300 μL RLT缓冲液后，上下吹打以裂解细胞。</li>
		<li>使用纯化试剂盒，按照动物和人类细胞总RNA纯化标准操作步骤进行RNA纯化（参见 材料表) 采用柱上DNA消化7用 20 μL 无 RNase 水洗脱 RNA。</li>
		<li>用液氮冷冻RNA样品，并在-80 °C下保存。</li>
		<li>每次实验需对对照组和实验组条件分别进行至少3次重复。所有样本的cDNA文库应同时制备，并在同一张测序芯片（flow cell）上进行测序，以控制技术变异。所有RNA样本制备完成后，使用真空浓缩仪将每个样本的体积浓缩至2–5 μL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 采用 Smart-seq2 法制备 cDNA 文库并进行测序
注意：为尽量减少技术差异，应同时构建所有 cDNA 文库，并在同一张芯片上进行测序。
<ol>
	<li>使用1.5 μL浓缩RNA作为输入，按照Smart-seq2的标准操作流程构建cDNA文库17 除以下修改外：使用不同的高保真PCR预混液（见 材料表用于PCR扩增；使用柱式PCR纯化试剂盒（参见 材料表）以纯化PCR产物，替代磁珠。</li>
	<li>Smart-seq2 实验方案在逆转录后包含一个PCR预扩增步骤，在标签化（tagmentation）后包含一个最终的富集PCR步骤。PCR扩增的循环次数取决于起始材料的丰度。当起始细胞数量为1,000个时，PCR预扩增步骤通常采用15个循环，最终富集PCR步骤采用12个循环。</li>
	<li>将文库混合后，在一个流动池上进行测序（例如， NextSeq 平台</li>
</ol>

<ol><li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Tan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+Superfamily+ligand+and+receptor+pairs+expressed+in+synaptic+partners+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila.</a> Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Fezf+coordinates+laminar-specific+connectivity+through+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+cell+sorting+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Whole animal cell sorting of Drosophila embryos.</a> Science. 251 (4989), 81-85 (1991).</li>
<li>Cumberledge, S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+pure+cell+populations+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila.</a> Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).</li>
<li>Bryant, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+differentially+expressed+genes+in+purified+Drosophila+follicle+cells%3A+toward+a+general+strategy+for+cell+type-specific+developmental+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).</li>
<li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).</li>
<li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).</li>
<li>Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+cardiac+cells+from+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of cardiac cells from Drosophila embryos.</a> Methods. 56 (1), 44-49 (2012).</li>
<li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li>
<li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+gentle+and+scalable+method+for+dissociation+and+fluorescent+sorting+of+imaginal+disc+cells+for+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing.</a> Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+N-cadherin+interactions+mediate+distinct+steps+in+the+targeting+of+lamina+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons.</a> Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案操作简单，技术难度不高，但若忽略若干关键步骤，将显著降低细胞得率。（步骤 2.3.2）确保杂交果蝇健康且培养基不干涸至关重要。定期为杂交果蝇加水是获得足量、基因型正确且发育阶段合适的果蝇用于解剖的关键。加水频率需根据所用培养基及果蝇饲养条件而定。为防止培养基干涸，应每天检查两次试管，并根据需要添加水分。（步骤 3.3）此外，应将所有解剖获得的脑组织汇集至同一个微量离心管中用于后续解离，而不是每位操作者各自使用单独的离心管再合并样本。此做法可避免因转移过程中造成的脑组织丢失，此类损失可能相当显著。（步骤 3.4.9）在通过移液器反复吹打以机械破坏组织时，必须持续操作直至肉眼观察不到悬浮液中有任何组织残余。组织解离不完全将减少可通过流式细胞分选（FACS）获得的单细胞数量，从而降低细胞得率。
细胞得率的主要限制因素是起始材料的量。在这方面，解剖步骤成为限制性因素的原因有多个：（1）组织解离方案要求将视叶从头部解剖出来，并与中央脑部分离；（2）为了在发育过程中精确的时间点获取组织，解剖操作的时间窗口必须受到限制；（3）解剖与流式细胞分选（FACS）之间的时间越长，细胞活力下降以及基...

果蝇视觉系统是研究发育和行为遗传基础的杰出模型。该系统具有高度保守的细胞结构1，并拥有可操控特定细胞类型的先进遗传工具包2,3。该系统的一个主要优势在于，能够利用遗传嵌合体方法，在单细胞分辨率下自主探究目标细胞类型中基因的功能4,5。我们旨在将这些遗传工具与新一代测序技术的最新进展相结合，以在遗传嵌合体实验中的单细胞克隆内开展细胞类型特异性的转录组和基因组分析。
为此，必须建立一种稳健且高效的方法，以选择性分离大脑中丰度较低的细胞群体。此前，我们已建立了一种通过流式细胞术（FACS）在蛹期发育过程中分离视觉系统中特定细胞类型的实验方案，并结合RNA测序技术测定其转录组。6在这些实验中，某一特定类型的绝大多数细胞（例如 R7 光感受器）被荧光标记。利用该方法，在遗传嵌合体实验中（仅同一类型的细胞中的一部分被标记），我们未能分离出足够数量的细胞以获得高质量的测序数据。为解决这一问题，我们尝试通过优化细胞解离方案来提高细胞得率。
我们的方法是缩短整个实验流程的总时长，以最大限度地维持解离细胞的活性，通过优化解剖和解离缓冲液来改善细胞状态，并减少对解剖后组织的机械性损伤。我们采用镶嵌分析结合可抑制细胞标记物5（MARCM）技术测试了改进后的实验方案7，该技术可在整体为杂合子的果蝇中，特异性地产生单个荧光标记的细胞克隆，这些克隆可为特定目的基因的野生型或突变型。在相同条件下，此前的实验方案无法获得足够的RNA-seq样本量，而改进后的方案则成功实现了目标。我们可稳定获得较高的细胞得率（约25%的标记细胞），并仅用低至1,000个细胞即可获取高质量的RNA-seq数据7。
已有多种方案被用于从黑腹果蝇中分离特定的细胞类型6,8,9,10,11,12,13,14,15,16。这些方案主要用于分离在脑中数量丰富的细胞类型。本方案经过优化，适用于利用流式细胞分选技术（FACS）从视觉系统中分离低丰度细胞群体（每脑少于100个细胞），以便进行后续的转录组和基因组分析。本方案旨在提供一种可重复的方法，通过FACS从果蝇视觉系统中分离低丰度细胞，并通过RNA-seq获得高质量的转录组数据。

<table><tbody><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>蛋白酶混合物</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S5761</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>L-谷胱甘肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>热灭活牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's 培养基</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 微量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNA纯化试剂盒</td></tr><tr><td>无RNase的DNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP混合液</td><td>Life Technologies</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>甜菜碱溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Q5 高保真 2x 预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index 试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛旋盖的试管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶真空过滤系统</td><td>Corning</td><td>CLS431153</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 测序系统</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td></td></tr></tbody></table>

果蝇视觉系统中低丰度细胞的纯化

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

下一代测序技术的灵敏度近期得到显著提升，使得转录组和基因组分析能够应用于少量细胞。利用该技术研究果蝇视觉系统发育，结合该系统丰富的细胞类型特异性遗传工具，为在精确的细胞分辨率下探究发育的分子基础提供了强大手段。要实现这一研究策略，关键在于能够可靠且高效地分离脑内稀有细胞。本文介绍了一种可在遗传嵌合实验中高效纯化单细胞克隆的方法。通过该方案，我们利用荧光激活细胞分选（FACS）纯化后 consistently 获得较高的细胞得率（约占所有标记细胞的25%），并成功对通过可抑制细胞标记嵌合分析（MARCM）产生的单细胞克隆进行了转录组学分析。该方案适用于在发育的不同阶段以及不同遗传操作背景下，对视觉系统中的特定细胞类型进行转录组和基因组分析。

总体方案 
协议的总体方案如图1所示。该协议分为三个主要部分：果蝇操作、样品制备、测序与数据分析。为简化起见，总体方案中未包含“实验前的规划”部分。
时间线 
果蝇实验和样品制备等主要实验步骤的时间安排见图2。
通过共聚焦显微镜验证细胞特异性标记 
在一项代表性实验中，L3 胶原单极神经元（L3）被荧光标记。L3 神经元是五种同源胶原神经元（L1-L5）之一，接收来自广泛调谐的感光细胞 R1-R6 的输入，并通过与髓质中靶向神经元形成突触，将信息传递至高级中枢。在 MARCM 实验中，通过有丝分...

本文介绍了一种细胞解离方案，可通过荧光激活细胞分选（FACS）高效分离果蝇视觉系统中低丰度存在的细胞。

下一代测序技术灵敏度的近期提升已促进转录组学和基因组学分析在少量样本中的应用...

该方法有助于解决生物学中的关键问题，例如不同类型的细胞是如何产生并组织成功能特异的高阶结构的。该技术的主要优势在于，能够高效纯化果蝇视觉系统中丰度较低的细胞，用于转录组和基因组分析。在方案第六周的星期二，解剖前45分钟，从4°C取出一管木瓜蛋白酶粉末，并在室温下孵育。接下来，将完全配制的施耐德培养基（Complete Schneider's Medium，简称CSM）分装至一个离心管中，置于室温下备用，稍后用于溶解木瓜蛋白酶粉末。在开始解剖前5到10分钟，使用注射器通过瓶盖直接将室温的CSM加入装有木瓜蛋白酶的试剂瓶中，使其终浓度达到每毫升100个单位。混匀时，首先倒置试剂瓶，使附着在瓶盖内壁的粉末落入液体中，然后用移液器反复吹打溶液以充分混匀。混合试剂后，将烧杯置于水浴中，加水至37摄氏度。然后将小瓶放入烧杯中孵育30分钟，以激活木瓜蛋白酶，并确保小瓶不漂浮。在木瓜蛋白酶孵育的同时，从冰箱中取出一份蛋白酶混合液，置于室温下孵育。激活30分钟后，将木瓜蛋白酶在室温下孵育。第六周的星期二，在冷的CSM中用洁净的镊子解剖分期的瞳孔脑组织。在10分钟内尽可能多地解剖脑组织，并将脑组织收集到一滴新鲜的冷CSM中。在视叶与中央脑的连接处捏住并切除视叶。随后，将视叶组织加入含有500 µL 1× RS溶液的微量离心管底部。每个样本使用一个微量离心管，分别用于实验组织和阴性对照组织。将离心管置于冰上保存。在一小时内尽可能解剖多个叶。将解剖得到的视叶汇集到一个微量离心管中，以避免在管间转移时组织丢失。使用P200移液器小心移除含有解剖视叶的微量离心管中的1x RS，保留足够覆盖视叶的溶液量。小心地将 500 微升 1x RS 缓冲液加入管壁一侧。待叶状体沉降至管底后，用移液器吸取 200 微升。排出液体，观察叶状体的移动，并让叶状体再次沉降。对于这两个样品，将600 µL已活化的室温木瓜蛋白酶分装至微量离心管中。接下来，配制解离溶液：将4.2 µL室温蛋白酶混合液加入600 µL木瓜蛋白酶溶液中，使终浓度达到0.18 WU/mL，并通过反复吹打混匀溶液。然后小心地从每个样本中移除1x RS，并向组织小叶中加入300微升解离溶液。将样本置于微量离心管恒温混匀仪中，在25摄氏度、1,000 RPM条件下孵育15分钟。在5分钟和10分钟时间点，停止ThermoMixer运行，让叶瓣沉降至微量离心管底部。用移液器吸取200微升溶液并混匀。15分钟孵育结束后，等待叶瓣沉降至管底，小心移除解离溶液，注意不要扰动叶瓣。用1x RS缓冲液将叶叶清洗两次。小心加入500微升1x RS缓冲液，避免扰动叶叶。然后小心吸取200微升溶液，并轻轻排出。让叶叶沉降至底部，重复此操作。接下来，用500微升CSM将每个样品洗涤两次。小心移除CSM，然后向管中加入另外200微升CSM。使用P200移液器，通

purification-of-low-abundant-cells-in-the-drosophila-visual-system

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

果蝇视觉系统中低丰细胞的纯化

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分离与纯化 果蝇 通过磁珠分选分离外周神经元

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成年个体的制备 黑腹果蝇 用于薄切片与显微分析的眼组织

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学习使用荧光激活细胞分选技术从果蝇视觉系统中纯化低丰度细胞的方法。该方案结合木瓜蛋白酶解离与FACS技术，可高效分离稀有细胞类型，为转录组学和基因组学研究提供支持，助力深入理解细胞多样性与组织形成机制。

果蝇视觉系统中低丰度细胞的纯化

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