通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常

这种基于平板的浊度检测方法的主要优势在于操作快速，且无需复杂的设备或条件，即可同时筛选多种淀粉样蛋白β-纤维蛋白原相互作用抑制剂。在纤维蛋白浊度检测中表现突出的候选化合物，可进一步通过扫描电子显微镜分析，评估其恢复Aβ诱导的纤维蛋白凝块结构异常的能力。制备用于扫描电子显微镜分析的凝块时，直观的演示至关重要，因为制备过程中的任何差异都可能导致实验结果的变异。

本演示的重点是 A-β 与纤维蛋白原的相互作用。该方案可轻松修改，用于分析其他蛋白质或化合物与纤维蛋白凝块的相互作用。首先，在每孔中加入 1.5 µM 新鲜配制的纤维蛋白原溶液（溶于 200 µL 凝块形成缓冲液），包括含 A-β 肽段 42 的实验孔和对照孔，然后将酶标板置于室温下的旋转平台上孵育。

30分钟后，将30微升新鲜配制的凝血酶溶液直接加入含纤维蛋白原的孔中央，以启动凝块形成，同时立即在350纳米波长下读取体外凝块的吸光度，并在接下来的10分钟内每30至60秒重复测量一次。为评估Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂对纤维蛋白凝块结构的影响，首先用镊子将洁净的12毫米硅化玻璃盖玻片分别放入12孔板的各个孔中，然后在每张盖玻片上加入80微升纤维蛋白原溶液，轻轻铺展使其均匀分布。随后在每个孔中加入20微升凝血酶溶液，以启动凝块形成。

将培养板盖好，在室温下孵育 30 至 60 分钟，然后用 1 毫升移液器小心地将每个凝块浸入 2 毫升冰冻的二甲胂酸钠缓冲液中，在室温下覆盖孵育 2 分钟，重复两次，每次洗涤后用 1 毫升移液器小心吸除缓冲液。最后一次洗涤后，检查盖玻片上凝块的形成情况，并将凝块置于冰上，用 2 至 3 毫升冰冻的 2% 戊二醛固定 30 分钟。孵育结束后，轻轻吸除各孔中的戊二醛，并如所示在冰上用新鲜的二甲胂酸钠缓冲液洗涤凝块。

将固定的血凝块置于冰上，用一系列冰冻乙醇洗涤，每次五分钟，洗涤过程中无需在每次更换乙醇之间完全去除乙醇，以防止血凝块暴露于空气中。在最后一次100%乙醇洗涤期间，将盖玻片转移至临界点干燥仪的样品架中，每张盖玻片之间至少放置一个垫圈，并将样品架放入充满乙醇的临界点干燥室中。经过30分钟的干燥循环后，使用碳导电胶带将盖玻片分别固定在扫描电子显微镜样品台（stub）上，并将样品转移至真空溅射镀膜仪的溅射镀膜室中。

然后在样品上溅射镀覆厚度小于20纳米的金钯或其他导电材料，速率为每秒4埃，持续25秒，并在配备类型2二次电子探测器的扫描电子显微镜上以4千伏电压对样品成像。纤维蛋白凝块的形成会导致透过溶液的光线发生散射，从而使浊度增加，并在读数期结束时达到平台期。当纤维蛋白原在A-beta 42存在下孵育时，溶液的浊度降低，其曲线达到的最大高度约为仅含纤维蛋白原时的一半左右。

在存在 A-beta 42 相互作用阻断剂的情况下，β-淀粉样蛋白的作用得到缓解，浊度高于仅存在 A-beta 时的浊度。该阻断剂的作用并非源于背景浊度，因为在缺乏 A-beta 时，该化合物不会改变纤维蛋白凝块的浊度。此外，在存在已知可干扰纤维蛋白聚合的肽段 GPRP 时，凝块形成所导致的浊度显著低于无抑制剂存在时的纤维蛋白凝块形成。

仅在凝血酶和氯化钙存在下生成的纤维蛋白原会形成由细长且交错的纤维蛋白丝以及较粗纤维束构成的纤维蛋白网。当存在A-β时，纤维蛋白丝变细，并在聚集体中出现多个黏性团块，表明A-β诱导了结构异常。与浊度测定结果一致，在A-β与纤维蛋白原相互作用阻断剂存在下，凝块结构部分恢复，逆转了A-β诱导的改变，表现为经该处理后观察到的团块数量减少。

凝块浊度检测和扫描电子显微镜分析方案已得到优化，可快速、可重复地评估多种Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂。这些数据将为纤维蛋白凝块形成的机制提供有价值的信息，并可用于后续的体外和体内研究。