β-淀粉脂质诱导纤维蛋白斑点结构异常的光谱分析

本文介绍了两种方法, 可以单独使用, 也可以结合使用, 分析β-淀粉样蛋白对纤维蛋白凝块结构的影响。其中包括一种用于创建体外纤维蛋白凝块的协议, 其次是血栓浊度和扫描电子显微镜方法。

这种基于板的浊度测定的主要优点是，它速度快，允许一次筛选几种淀粉样蛋白-β纤维蛋白原相互作用抑制剂，而无需复杂的设置或要求。可进一步评估纤维蛋白浊度测定中的头部化合物，以恢复通过扫描电子显微镜分析的纤维蛋白血块中的 A-β 诱导结构异常的能力。扫描电子显微镜分析的血块制备的视觉演示至关重要，因为制备中的任何变化都可能导致实验结果的变化。

本演示的重点是 A-beta 纤维蛋白原相互作用。该协议可以很容易地修改，以分析与其他蛋白质和化合物与纤维蛋白凝块的其他相互作用。首先，在200微升凝块形成缓冲液中加入1.5微摩尔新鲜准备的纤维蛋白原，每个含有和控制井的 A-beta 阴性42，并在室温下在旋转平台上孵育板。

30分钟后，将30微升新鲜准备好的血栓溶液直接加入含纤维蛋白原的井中心，开始形成血块，并立即读取体外血块在350纳米的吸收度，在10分钟内每30至60秒重复一次测量。为了评估 A-β 纤维蛋白原相互作用抑制剂对纤维蛋白凝块结构的影响，首先使用钳子将清洁的 12 毫米硅化玻璃圆盖滑到 12 孔板的单个孔中，并在每个盖滑上添加 80 微升纤维蛋白原，轻轻摊铺溶液，以便均匀分布。向每井添加20微升血栓溶液，以启动血栓形成。

在室温下盖上板30至60分钟，然后轻轻将每个血块淹没在两毫升冰冷的卡罗迪酸钠缓冲液中两分钟，在室温下盖上两次，每次洗涤后用1毫升移液器小心地取出缓冲液。上次洗涤后，检查盖滑上的血块形成状态，将血块固定在两到三毫升的冰冷2%谷胱甘肽中，在冰上30分钟。在孵化结束时，轻轻地从每一个井中去除谷胱甘肽，用新鲜的卡多迪酸钠缓冲液清洗血块，如冰上证明的。

在分级的五分钟冰冷乙醇中对固定凝块进行水合，在不完全去除洗涤之间的乙醇的情况下，防止血块暴露在空气中。在上次 100% 乙醇清洗过程中，将盖滑移入临界点干燥器样品架中，在每个盖滑之间放置至少 1 个垫圈，并将盖放入充满乙醇的临界点干燥器室中。经过 30 分钟的干燥周期后，使用碳胶带将盖板安装在单个扫描电子显微镜存根上，然后将样品传输到真空溅射涂布机的溅射涂层室。

然后溅射涂层小于20纳米的金铂或其他导电材料到样品上25秒，以4个正负的秒，并在扫描电子显微镜上成像样品，该显微镜配备有四千伏的二级电子探测器。纤维素血块的形成导致通过溶液的光散射，导致在阅读期结束时出现稳定度增加。当纤维蛋白原在 A-beta 42 存在的情况下孵育时，溶液的浊度会随着曲线达到仅纤维蛋白原的大约一半的最大高度而减小。

在存在 A-beta 42 相互作用阻滞剂的情况下，β-淀粉样蛋白的效果得到改善，浊度高于仅使用 A-beta 的浊度。阻滞剂的效果不会由于背景浊度而出现，因为当 A-beta 不存在时，化合物不会改变纤维蛋白血块浊度。此外，GPRP（一种已知干扰纤维蛋白聚合的肽）存在凝块的形成表明，与没有抑制剂的纤维蛋白凝块形成相比，浊度显著降低。

在血栓和氯化钙存在的情况下产生的纤维素原只形成纤维蛋白网，与纤维蛋白的拉长和相互间螺纹以及更大的束。当存在 A-beta 时，纤维素螺纹变薄，在聚合中出现几个粘性团块，表明 A-beta 引起的结构异常。与浊度测定结果一致，在存在 A-β 纤维蛋白酶相互作用阻滞剂的情况下形成血块会部分恢复纤维蛋白血块的结构，从 A-β 诱导的变化中恢复，因为通过这种治疗观察到的团块更少。

血块浊度测定和扫描电子显微镜分析方案经过优化，以快速可重复的方式评估几种 A-β纤维蛋白原相互作用抑制剂。不久，数据将提供有关纤维蛋白血块形成的有价值的信息，可用于体外和体内的进一步研究。