凝胶神经元全细胞斑块夹的急性脊髓切片的制备

在这里, 我们描述了由体外脊髓切片中的明胶 (sg) 神经元制成的全细胞膜片夹记录的基本步骤。该方法可对 sg 神经元的固有膜特性、突触传递和形态表征进行研究。

这种方法有助于澄清感觉传播、异常调节和慢性疼痛或疼痛发展背后的脊髓机制。首先使用毛细管拉拔器从硅酸盐玻璃微胶囊中拉出记录电极。然后，用熔融的加糖填充模具，准备一个1.2厘米1.5厘米由2.0厘米的加糖块。

如果规划横向部分，修剪块以具有中央通道。或具有抛物线部分块边缘的通道肉。在转心性灌注和脊髓提取之前，准备500毫升的蔗糖为基础的ACSF。

使用 95%O2 和 5%CO2 冷却冰冷溶液并均衡。冷却冰上所有的解剖工具。在背部皮肤上做一个纵向五厘米切口，从肌科达尔到罗斯特拉。

然后，切开脊柱和两侧肋骨之间的肋骨笼。用剪刀在脊柱的骨端做切口。然后切开周围的组织，并迅速分离脊柱的隆起部分。

将 lumbosacral 段转移到含有冰冷蔗糖的玻璃盘中。与腹侧向上，使用精细剪刀切开椎骨，并小心地暴露脊髓。用凸体扩大分离脊髓的两厘米长部分，将脊髓部分转移到另一个装满冷蔗糖ACSF的玻璃盘中。

在解剖显微镜下工作，去除梅宁和皮亚蜘蛛膜。尽快切开所有心根和后根。切中时注意避免脊髓受伤，尤其是后节角。

将脊髓放在先前修剪的胡须块上。要准备横向切片，请将脊髓的腹侧连接到带侧朝刀片的 agar 上。要准备寄生虫片，请将带超级胶水的腹侧垂直连接到阿加。

然后，将阿加块安装到具有超级胶水的振动器的平台上。并准备300至500微米横向或副卫星切片，高级速度为0.025毫米/秒，振动频率为80赫兹。脊髓应被切入多索-呼吸。

为了获得最佳效果，应在 15 到 20 分钟内准备切片。脊柱片的厚度不应超过600微米，以满足细胞的可见度。使用塑料修剪移液器将切片转移到 32 摄氏度的连续氧化 ACSF 的存储室中的尼龙网上。

要进行来自亚斯坦蒂娅胶质酶或SG神经元的全细胞贴片夹记录，请使用基于钾离子的细胞内溶液进行记录，同时仅应用基于钙的阳离子溶液进行抑制性后突触电流的记录。轻轻地将脊髓切片移动到记录室。然后用带尼龙线的 U 形铂线牢固地稳定住，以实现最佳的切片稳定性。

在室温下用气泡ACSF稳定地将切片进行，将灌注速率设置为每分钟2至4毫升，以实现足够的氧合。然后，使用低分辨率显微镜透镜，将SG神经元区域识别为半透明带。选择一个健康的神经元，其特征是三维形状，以明亮光滑的膜作为目标细胞，使用高分辨率目标，并调整到视频监视器屏幕的中心。

用适当的钾离子或基于钙离子的细胞内溶液填充微移液器。然后将微移液器插入电极支架，并确保细胞内溶液与支架内的银线接触。将微型移液器对焦，并使用微操纵器将它浸入 ACSF 中。

施加温和的正压，以强制清除任何污垢和碎屑。逐渐将微移液器移向目标神经元。一旦移液器接近神经元，神经元膜上形成非常小的酒窝，释放正压形成千兆酶。

将保持电位改变为负70毫伏，接近细胞的生理静膜电位。然后，对微移液器施加瞬态和温和的吸力，以破裂膜，并创建良好的全细胞配置。通过测试当前夹钳中每个神经元的点火模式，用一秒去极化电流脉冲 25 到 150 皮安，在静膜电位下以 25 皮安增量记录点火性能。

要记录体电位电位，在电压夹紧模式下将膜电位保持在负 50 毫伏，然后应用一系列超极化电压脉冲，持续时间从负 60 毫伏到负 120 毫伏，并降低 10 毫伏。在负70毫伏的保持电位下，在电压夹紧模式下，使用基于钾离子的细胞内溶液记录突触后兴奋电流。记录 IPSC 使用基于 caesium 离子的细胞内溶液记录 IPSC 的。

将膜电位保持负70毫伏约5分钟后，逐渐将保持电位更改为零毫伏。等待几分钟以稳定，然后开始记录 IPSC 事件。通过将一系列一秒去极化电流脉冲注入休息膜电位上的 SG 神经元而确定的点火模式可分为补品激发、延迟射击、间隙激发、初始爆发、磷爆炸、单尖峰和不情愿的激发。

此图显示了电压夹中低于额定电流的唤起协议。这些代表性跟踪显示了对分类为 IH、IA 和 IT 的超极化电流注入的反应。这是SEPSC在50微摩尔 APV 和 20 微摩尔 CNQX 不存在的情况下从 SG 神经元以负 70 毫伏记录的代表踪迹。此跟踪显示在扩展时间刻度上添加 APV 和 CNQX 之前记录的 SEPC。

遵循这个程序是方法，如配对补丁夹状或光遗传学可以执行回答其他问题，如描述特定神经元微电路在亚斯坦蒂娅胶质。