Name: 凝胶神经元全细胞斑块夹的急性脊髓切片的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习在急性脊髓切片中对胶状质神经元进行全细胞膜片钳记录的方法，用于研究感觉传递和慢性疼痛机制。该技术可精确分析神经元电生理特性，为神经科学研究提供重要工具。

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本工作得到中国国家自然科学基金（编号：81560198，31660289）的资助。

所有实验方案均经南昌大学动物伦理委员会（中国南昌，伦理编号：2017-010）批准。所有操作均尽可能减少实验动物的应激和疼痛。本研究中的电生理记录在室温（RT，22–25 °C）下进行。
1. 动物
<ol>
	<li>使用任一性别的 Sprague-Dawley 大鼠（3–5 周龄）。将动物饲养在 12 小时光照-黑暗循环条件下，并提供 随意摄取 获得充足的食物和水。</li>
</ol>
2. 溶液与材料的准备
<ol>
	<li>溶液
	<ol>
		<li>制备人工脑脊液（ACSF）（单位：mM）：117 NaCl、3.6 KCl、1.2 NaH2PO4·2H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1.2 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、11 D-葡萄糖、0.4 抗坏血酸和 2 丙酮酸钠。参见表 1。</li>
		<li>制备蔗糖-ACSF（单位：mM）：240 蔗糖、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4·2H2O、0.5 CaCl2·2H2O、3.5 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、0.4 抗坏血酸和 2 丙酮酸钠。参见表 2。</li>
		<li>制备基于 K+ 的细胞内液（单位：mM）：130 K-葡萄糖酸盐、5 KCl、10 Na2-磷酸肌酸、0.5 EGTA、10 HEPES、4 Mg-ATP 和 0.3 Li-GTP。参见表 3。</li>
		<li>制备基于 Cs+ 的细胞内液（单位：mM）：92 CsMeSO4、43 CsCl、10 Na2-磷酸肌酸、5 四乙基铵（TEA）-Cl、0.5 EGTA、10 HEPES、4 Mg-ATP 和 0.3 Li-GTP。参见表 4。 
		注意：所有溶液均需使用蒸馏水配制。ACSF 和蔗糖-ACSF 在使用前应通入碳氧混合气（95% O2 和 5% CO2）以维持约 7.4 的最佳 pH 值，且这两种溶液的渗透压应调节至 300–310 mOsm。由于抗坏血酸可能影响钙通道，若需记录钙电流，则必须省略该试剂。细胞内液的渗透压和 pH 值应分别测定并调节至 290–300 mOsm 和 7.2–7.3。建议使用 0.2 µm 滤器过滤细胞内液，并将溶液分装为 1 mL 等份，于 -20 °C 保存。在基于 Cs+ 的细胞内液中加入 Cs+ 和 TEA 以阻断钾通道，这有助于在记录抑制性突触后电流（IPSCs）时使放大器将膜电位稳定在 0 mV。</li>
		<li>制备 0.05% Neurobiotin 488 溶液。将 2 mg Neurobiotin 488 溶解于 4 mL 基于 K+ 的细胞内液中，必要时用蒸馏水或蔗糖调节渗透压至 290–300 mOsm。 
		注意：1 mM 蔗糖可使渗透压升高 1 mOsm。</li>
		<li>制备 3% 琼脂作为脊髓固定块。将 7.5 g 琼脂溶解于 250 mL 纯化水中，置于玻璃烧杯中，用微波炉加热至沸腾并澄清。轻轻旋转溶液，随后将其倒入 17.5 cm × 10.5 cm × 1.8 cm 的塑料盒中使其凝固。使用前将琼脂保存于 4 °C。</li>
		<li>制备用于免疫组织化学处理的 4% 多聚甲醛（PFA）。将 40 g PFA 粉末加入约 800 mL 已加热（约 60 °C）的 1× PBS 溶液（130 mM NaCl、7 mM Na2HPO4、3 mM NaH2PO4）中。缓慢滴加 1 N NaOH 调节 pH，直至 PFA 粉末完全溶解。待溶液变澄清后，用 1× PBS 定容至 1 L。必要时用 1 N HCl 将 pH 重新调节至 7.2–7.4，然后过滤 4% PFA 溶液并保存于 -20 °C 备用。 
		注意：PFA 具有毒性，操作时需佩戴口罩、手套和护目镜。应在通风橱内进行 4% PFA 的配制。PFA 粉末在 pH 约为 9–10 时可完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仪器
	<ol>
		<li>典型的电生理系统应包括：配备红外微分干涉差（IR-DIC）和高分辨率水浸物镜的直立显微镜、CCD/CMOS 相机、膜片钳放大器、微电极夹持器以及可精细调节电极位置的微操纵器。还需配备 XY 载物台以移动显微镜。</li>
		<li>将所有设备安装在配有法拉第笼的防震台上。将视频监视器连接至摄像机，以便观察神经元并可视化微电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微电极
	<ol>
		<li>使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管制备记录电极。当填充细胞内液时，电极的典型阻抗范围为 3–6 MΩ。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂块
	<ol>
		<li>制备一个 1.2 cm × 1.5 cm × 2.0 cm 的琼脂块。根据需要将其修整为图 1所示的形状。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 急性脊髓切片制备
注意：横切或旁矢状脊髓切片的制备方法如先前所述18,19,20。
<ol>
	<li>在进行心脏灌注和脊髓提取之前，准备约500 mL用95% O2和5% CO2平衡的蔗糖-ACSF溶液，并将溶液冷却至冰浴温度（0–4 °C）。</li>
	<li>将所有解剖工具（例如解剖剪、虹膜剪、有齿镊、精细镊、弯头镊）置于冰上预冷。急性脊髓切片制备的示意图见图1。</li>
	<li>心脏灌注
	<ol>
		<li>通过腹腔注射（i.p.）单次给予乌拉坦（1.5 g/kg）后，等待2–3分钟，并通过夹捏足趾或尾部反应评估大鼠麻醉深度。当达到外科麻醉水平时，将大鼠仰卧位放置于碎冰上。 
		注意：&#160;为确保在开胸过程中产生足够深的麻醉以避免疼痛感知，请遵循当地IACUC指南。</li>
		<li>从剑突至锁骨处沿皮肤做一3–4 cm的切口，然后在剑突水平以下做一横向切口。</li>
		<li>用一对弯头镊夹住并抬起剑突，充分暴露膈肌。横向切开膈肌，然后沿胸骨与肋骨之间双侧剪开肋骨，打开胸腔。使用弯头镊夹住剑突以固定肋骨，充分暴露心脏。</li>
		<li>用另一把弯头镊轻轻夹住心脏，然后将22 G针头从左心室插入至主动脉弓根部。</li>
		<li>立即用精细剪刀剪开右心房，随后通过重力系统开始灌注冰浴、含氧的蔗糖-ACSF。 
		注意：使用冰浴的蔗糖-ACSF进行快速且充分的心脏灌注有助于脊髓迅速降温，同时低钠和低钙浓度可能有助于减轻兴奋性毒性并保护神经元功能。此外，在进行形态学研究时，清除红细胞有助于减少生物胞素染色的背景信号。只要从右心房流出的液体变得澄清，且大鼠肝脏和脚掌颜色变苍白，即可认为灌注充分且满意。22 G针头的尖端应为钝头，以避免刺破心脏或主动脉弓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脊髓解剖与切片
	<ol>
		<li>在灌注状态下，从尾侧向头侧沿背部皮肤做一5 cm的纵向切口，然后在脊柱与肋骨之间双侧剪开肋骨。</li>
		<li>在脊柱尾端做一切口，用剪刀去除周围组织，迅速分离腰骶段脊柱。</li>
		<li>将腰骶段转移至盛有冰浴蔗糖-ACSF的玻璃培养皿中。腹侧朝上，用精细剪刀双侧剪断椎弓根，小心暴露脊髓。分离一段长约2 cm、包含腰骶膨大部分（L1–S3）的脊髓，并将其转移至另一盛有冷蔗糖-ACSF的玻璃培养皿中。</li>
		<li>在解剖显微镜下剥离脑膜和软脑膜-蛛网膜。尽快切断所有腹根和背根。</li>
		<li>将脊髓置于预先修整好的琼脂块上。若制备横切面切片，将脊髓腹侧粘附于琼脂上，使背侧朝向刀片；若制备旁矢状切片，则如图1所示，用超级胶水将脊髓腹侧垂直粘附于琼脂上。然后用超级胶水将琼脂块固定于振动切片机的载物平台上。以0.025 mm/s的进刀速度和80 Hz的振动频率，制备300–500 µm厚的横切或旁矢状切片。</li>
		<li>使用经塑料修整的移液管将切片转移至储存室中的尼龙网架上，储存室中持续通入含氧ACSF，并在记录前于32 °C孵育至少30分钟。 
		注意：在去除脑膜和脊神经根时需小心，避免损伤脊髓，尤其是背角区域。脊髓应按背腹方向切片。为获得最佳效果，切片过程应迅速完成（15–20分钟内）。脊髓切片厚度不应超过600 µm，以保证细胞可见性。此外，上述技术也可用于获取水平方向的脊髓切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 全细胞膜片钳记录
<ol>
	<li>对SG神经元进行全细胞膜片钳记录时，大多数记录情况使用基于K+的细胞内液，仅在记录抑制性突触后电流时使用基于Cs+的细胞内液。</li>
	<li>将脊髓切片轻柔地移至记录浴槽中，并用尼龙线固定在U形铂丝上以确保切片稳定；通过重力灌流系统在室温下持续灌注充氧的人工脑脊液（ACSF），灌流速度设定为2–4 mL/min，以保证充分供氧。</li>
	<li>使用低倍显微镜物镜识别SG区域（一条半透明带），再用高倍物镜选择一个健康的神经元作为目标细胞，并将其调整至视频监视器屏幕中央。</li>
	<li>根据需要，用适量的基于K+或Cs+的细胞内液填充玻璃微电极，将微电极插入电极夹持器中，并确保细胞内液与夹持器内的银丝良好接触。</li>
	<li>使用显微操作器将微电极调至视野清晰，并浸入ACSF中，随后施加轻微正压（使用压力计测量约为1 psi），以防止微电极尖端被杂质污染。</li>
	<li>逐步将微电极移向目标神经元；当微电极接近神经元并在细胞膜表面形成微小凹陷时，释放正压，以形成吉欧封接（gigaseal）。</li>
	<li>将钳制电位调整至-70 mV，该值接近细胞的生理静息膜电位（RMP）。随后对微电极施加短暂而轻柔的负压，以击穿膜片，形成良好的全细胞记录构型。 
	注意：将切片转移至记录浴槽后，应确保至少5分钟的稳定灌流，以清除切片表面的碎片。值得注意的是，准确区分健康与不健康/死亡神经元对实现良好封接和稳定记录至关重要。不健康/死亡的神经元表现为肿胀或皱缩，并可见明显的大细胞核；而健康的神经元具有三维（3D）形态，细胞膜明亮且光滑，细胞核不可见。为实现全细胞构型，必要时需逐步补偿快速或慢速电容。在室温下，基于K+和基于Cs+的细胞内液的液接电位分别计算为15.1–15.2 mV和4.3–4.4 mV。在本研究中，记录的数据未对液接电位进行校正。</li>
	<li>内在膜特性的记录
	<ol>
		<li>记录被动性内在膜特性：在破膜后立即（20秒内）记录静息膜电位（RMP）。在电流钳模式下，于RMP处施加去极化电流脉冲（10 pA，500 ms），通过测量电压反应来确定神经元的输入电阻。</li>
		<li>记录放电特性：在电流钳模式下，于RMP处施加一系列持续1秒的去极化电流脉冲（25–150 pA，步长25 pA），检测每个神经元的放电模式。离线测量单个动作电位的阈值、幅度和半宽。</li>
		<li>记录阈下电流：为评估胞体阈下电流，在电压钳模式下将膜电位钳制在-50 mV，随后施加一系列持续1秒的超极化电压脉冲，从-60 mV逐步递减至-120 mV，步长为10 mV。</li>
		<li>记录兴奋性突触后电流（EPSCs）：使用基于K+的细胞内液，在电压钳模式下于-70 mV钳制电位处记录EPSCs。</li>
		<li>记录抑制性突触后电流（IPSCs）：使用基于Cs+的细胞内液记录IPSCs。建立全细胞构型后，先将膜电位钳制在-70 mV约5分钟，然后逐步将钳制电位调整至0 mV。等待数分钟待信号稳定后，开始记录IPSC事件。 
		注意：仅选择静息膜电位低于-50 mV且具有超射现象的神经元进行后续研究。本研究中串联电阻通常为10–30 MΩ，若串联电阻变化超过20%，则应排除该记录。EPSCs可通过浴槽灌注50 µM APV和20 µM CNQX进行确认，IPSCs则可通过10 µM荷包牡丹碱（bicuculline）和1 µM士的宁（strychnine）进行确认。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 形态学研究
<ol>
	<li>进行形态学实验时，使用含有0.05%神经生物素488的K+为基础的细胞内溶液。</li>
	<li>在维持稳定的电生理记录至少20分钟后，缓慢向上移除微电极，使细胞膜重新封闭，并将脊髓切片转移至盛有4%多聚甲醛（PFA）的容器中。在室温下用4% PFA固定1小时，随后于4°C过夜固定。</li>
	<li>用PBS冲洗切片，然后将其浸入50%乙醇中30分钟。再用PBS洗涤三次后，将切片保持原有厚度，用封片剂封固于载玻片上。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜（见材料表）进行图像采集和神经元三维重建。通过20倍物镜以1.5 µm的z轴步长扫描神经元。</li>
</ol>

<ol><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices%3A+pharmacological+properties+of+synaptic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li>
<li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology.+584+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li>
<li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li>
<li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li>
<li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+%28ERK%29+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25(2014).</li>
<li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li>
<li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li>
<li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li>
<li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II%3A+Role+of+alpha2delta-1+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li>
<li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li>
<li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+%28laminae+I+and+II%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li>
<li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li>
<li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li>
<li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li>
<li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li>
<li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li>
<li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li>
<li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li>
<li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li>
<li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).</li>
<li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li>
<li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案详细描述了制备脊髓切片的步骤，我们此前在对SG神经元进行全细胞膜片钳实验时已成功应用此方法18,19,20,21。通过采用该方法，我们近期报道了米诺环素（一种第二代四环素）可通过突触前机制显著增强SG神经元中的抑制性突触传递19。此外，该药物还可减小Ih电流的幅度，并进一步抑制SG神经元的兴奋性21。结合已发表的数据以及本文展示的代表性结果，表明本方案适用于多种电生理学研究。
正如我们之前指出的，经心灌注是获得健康样本的关键步骤。首先，我们使用冰冻的灌注液，以便迅速冷却脊髓并减缓神经元的代谢活动22其次，蔗糖替代的ACSF是一种“保护性切割”溶液，具有低Na<...

胶状质（SG，脊髓背角第II层）是传递和调节感觉信息的无可争议的重要中继中枢。它由兴奋性和抑制性中间神经元组成，这些神经元接收来自初级传入纤维、局部中间神经元以及内源性下行抑制系统的输入1近几十年来，急性脊髓切片制备技术的发展以及全细胞膜片钳记录技术的出现，使得研究人员能够对脊髓后角浅层神经元的固有电生理学和形态学特性开展多种研究。2,3,4 以及对SG局部环路的研究5,6此外，通过使用 体外 脊髓切片制备，研究人员可解读神经元兴奋性的变化7,8离子通道的功能9,10以及突触活动11,12 在多种病理条件下。这些研究加深了我们对脊髓节神经元在慢性疼痛和神经性瘙痒的发生与维持中所起作用的理解。
实现对急性脊髓切片中神经元胞体的清晰可视化以及理想的全细胞膜片钳记录的关键前提在于确保切片质量优良，从而获得健康且可进行膜片钳操作的神经元。然而，制备脊髓切片涉及多个步骤，例如进行腹侧椎板切除以及去除软脑膜-蛛网膜，这些操作可能成为获取健康切片的障碍。尽管脊髓切片的制备并不容易，但成功实施记录 体外 在脊髓切片上进行实验具有多项优势。与细胞培养制备相比，脊髓切片能够在生理相关条件下部分保留固有的突触连接。此外，利用脊髓切片进行的全细胞膜片钳记录可与其他技术结合使用，例如双膜片钳13,14，形态学研究15,16 单细胞RT-PCR17因此，该技术可提供更多关于特定区域内解剖与遗传多样性的表征信息，并可用于研究局部神经环路的组成。
本文中，我们提供了制备急性脊髓切片并从脊髓后角神经元获取全细胞膜片钳记录的基本且详细的实验方法。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>用于制备ACSF和PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td>用于制备ACSF、蔗糖-ACSF以及基于K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;的细胞内溶液</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>用于制备ACSF、蔗糖-ACSF和PBS</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>用于制备ACSF和蔗糖-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>用于制备ACSF和蔗糖-ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>用于制备ACSF和蔗糖-ACSF</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>用于制备ACSF</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>用于制备ACSF和蔗糖-ACSF</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>A7631</td><td>用于制备ACSF和蔗糖-ACSF</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td>用于制备蔗糖-ACSF</td></tr><tr><td>K-葡萄糖酸盐</td><td>Wako</td><td>169-11835</td><td>用于制备基于K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;的细胞内溶液</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-磷酸肌酸</td><td>Sigma</td><td>P1937</td><td>用于制备细胞内溶液</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td>用于制备细胞内溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>用于制备细胞内溶液</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>用于制备细胞内溶液</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td>用于制备细胞内溶液</td></tr><tr><td>CsMeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>用于制备基于Cs&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;的细胞内溶液</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>用于制备基于Cs&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;的细胞内溶液</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td>Sigma</td><td>T2265</td><td>用于制备基于Cs&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;的细胞内溶液</td></tr><tr><td>Neurobiotin 488</td><td>Vector</td><td>SP-1145</td><td>0.05% Neurobiotin 488可用于形态学研究</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>A7002</td><td>本方案中使用了3%琼脂块</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>免疫组织化学处理中使用4%多聚甲醛</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>恒兴化学试剂</td><td></td><td>用于制备PBS</td></tr><tr><td>封片介质</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>乌拉坦</td><td>中国食品药品检定研究院</td><td>30191228</td><td>1.5 g/kg，腹腔注射</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>外径1.5 mm，内径1.12 mm</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>用于制备微电极</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>红外CCD相机</td><td>Dage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>X-Y位移平台</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR X-Y</td><td></td></tr><tr><td>正置显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>渗透压仪</td><td>Advanced</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

脊髓胶状质神经元全细胞膜片钳记录用急性脊髓切片的制备

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

近年来，对胶状质（substantia gelatinosa, SG）神经元进行的全细胞膜片钳研究，为揭示感觉传递、伤害性调节以及慢性疼痛或瘙痒发生背后的脊髓机制提供了大量信息。结合急性脊髓切片技术开展的电生理记录与形态学研究，进一步加深了我们对SG神经元特性及其局部环路组成的理解。本文提供了一套制备脊髓切片的详细且实用的操作指南，并展示了典型的全细胞记录与形态学结果。该方案可实现理想的神经元保存，并在一定程度上模拟体内（in vivo）环境。总之，获得体外（in vitro）脊髓切片制备物的能力，使得稳定的电流钳和电压钳记录成为可能，从而有助于利用多种实验方法深入研究神经元的固有膜特性、局部环路及神经元结构。

根据图1所示示意图制备急性脊髓切片。切片完成后经过恢复期，将脊髓切片转移至记录室中。通过红外微分干涉相差（IR-DIC）显微镜观察细胞体的形态，以鉴定健康的神经元。随后，在将神经元钳制于静息膜电位（RMP）的条件下，施加一系列去极化电流脉冲（持续1秒），诱发胶状质（SG）神经元的动作电位。如图2所示，SG神经元中观察到的放电模式包括持续性放电、延迟性放电、间隙性放电、初始簇状放电、时相性簇状放电、单次放电以及难兴奋性放电，这些放电模式已被先前的研究描述并分类。
采用该制备方法，我们还在电压钳制模式下记录了亚阈值电流以及自发出现的电流。图3A展示了亚阈值电流的代表性记录，包括超极化激活电流（Ih）、T型钙电流（IT）和A型钾电流（I<...

在此，我们描述了在 substantia gelatinosa (SG) 神经元中进行全细胞膜片钳记录的关键步骤 体外 脊髓切片。该方法可用于研究胶状质（SG）神经元的固有膜特性、突触传递及形态学特征。

近期对胶状质（substantia gelatinosa, SG）神经元进行的全细胞膜片钳研究，已提供了大量关于脊髓机制的信息……

该方法有助于阐明感觉传导、伤害性调节以及慢性疼痛或酸痛发展的脊髓机制。该技术的主要优势在于能够实现理想的神经元保存，并在一定程度上模拟体内条件。首先，使用毛细管拉制仪从硼硅酸盐玻璃微毛细管中拉制记录电极。然后，将熔化的琼脂倒入模具中，制备一个尺寸为1.2厘米×1.5厘米×2.0厘米的琼脂块。如果计划制作横切面，应修整组织块以形成中央通道；若制作矢状旁切面，则应将通道修整至组织块边缘。在进行心脏灌注和脊髓提取之前，准备500毫升基于蔗糖的任氏液（ACSF）。将溶液冷却至冰浴温度，并用95% O2和5% CO2平衡。将所有解剖工具置于冰上冷却。从尾侧向头侧方向，在背部皮肤上做一个5厘米长的纵向切口。然后，从脊柱与肋骨两侧之间的肋骨笼处剪开。使用剪刀在脊柱的尾端进行切割。随后去除周围组织，并迅速分离出脊柱的腰骶段。将腰骶段转移至一个盛有冰冷蔗糖型人工脑脊液（ACSF）的玻璃培养皿中。腹侧朝上，用精细剪刀双侧剪断椎弓根，小心暴露脊髓。分离出包含腰骶膨大的长约2厘米的脊髓节段，并将该脊髓节段转移至另一个盛有冷蔗糖ACSF的玻璃培养皿中。在解剖显微镜下操作，去除脑膜和软脑膜。尽快切断所有腹侧和背侧神经根。在去除脑膜和脊神经根时，注意避免损伤脊髓，尤其是背角。将脊髓放置在先前修整好的琼脂块上。制备横切片时，用脊髓腹侧朝下粘附于琼脂上，背侧朝向刀片。制备旁矢状切片时，用超级胶水将脊髓腹侧垂直粘附于琼脂上。然后，使用超级胶水将琼脂块固定在振动切片机的载物台上。以每秒0.025毫米的进刀速度和80赫兹的振动频率，制备300至500微米厚的横切或旁矢状切片。脊髓应沿背腹方向进行切片。为了获得最佳结果，切片应在15至20分钟内完成。脊髓切片的厚度不应超过600微米，以保证细胞可见性。使用塑料修整过的移液管将切片转移至储存 chamber 中的尼龙网膜上，该 chamber 内含有持续充氧的ACSF，并保持在32摄氏度。为对胶状质（substantia gelatinosa，SG）神经元进行全细胞膜片钳记录，应使用基于钾离子的细胞内记录液进行记录，仅在记录抑制性突触后电流时使用基于铯阳离子的溶液。将脊髓切片轻柔地移至记录室，然后用尼龙线固定在U形铂丝上，以确保切片的稳定。在室温下用持续通氧的ACSF稳定灌流脑片，灌流速率为每分钟2至4毫升，以确保充分供氧。然后，使用低倍显微镜物镜识别SG神经元区域，该区域呈半透明带状结构。选用高倍物镜观察，挑选一个形态立体、细胞膜明亮且光滑的健康神经元作为目标细胞，并将其调整至视频监视器屏幕中央。用适量体积的基于钾离子或铯离子的细胞内液填充微量移液管。然后将微量移液管插入电极夹持器中，并确保细胞内液与夹持器内的银丝接触。调节微量移液管至成像清晰，使用显微操作器将其浸入ACSF中。施加轻微的正压以排除任何污垢和碎屑。逐渐将微移液管移向目标神经元。当移液管接近神经元且神经元膜上形成微小凹陷时，释放正压以形成吉欧封接（gigaseal）。将钳制电位调整至负70毫伏，该数值接近细胞的生理静息膜电位。随后，对微电极施加短暂而轻柔的负压，以击穿细胞膜并形成良好的全细胞记录构型。在静息膜电位下，采用电流钳模式，通过一系列持续1秒、强度从25至150皮安、以25皮安为增量逐步增加的去极化电流脉冲，检测每个神经元的放电模式，从而记录其放电特性。为了记录躯体亚阈值电流，将膜电位在电压钳制模式下钳制在 -50 mV，随后施加一系列持续时间为 1 秒的超极化电压脉冲，从 -60 mV 到 -120 mV，以 10 mV 递减。使用基于钾离子的细胞内溶液，在电压钳制模式下于 -70 mV 的钳制电位记录兴奋性突触后电流。使用基于铯离子的细胞内溶液记录抑制性突触后电流（IPSC）。将膜电位在负70毫伏维持约五分钟之后，逐渐将钳制电位改变至零毫伏。等待数分钟以达到稳定，然后开始记录IPSC事件。通过在静息膜电位下向SG神经元注入一系列持续一秒的去极化电流脉冲所确定的动作电位发放模式，可分为持续性发放、延迟性发放、间隙性发放、初始簇状发放、相位性簇状发放、单次放电以及难发放型。该图像显示了电压钳制下亚阈值电流的诱发电流方案。这些代表性曲线显示了对超极化电流注入的反应，分别归类为 IH、IA 和 IT。这是在 -70 毫伏条件下，从 SG 神经元记录到的自发兴奋性突触后电流（SEPSC）的代表性曲线，分别在无以及有 50 微摩尔 APV 和 20 微摩尔 CNQX 存在时的情况。该曲线显示了加入 APV 和 CNQX 前，在扩展时间尺度上记录的自发兴奋性突触后电流（SEPC）。在此操作步骤之后，可进行配对膜片钳记录或光遗传学等方法，以回答更多问题，例如表征胶状质中特定的神经元微环路。

preparation-acute-spinal-cord-slices-for-whole-cell-patch-clamp

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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