Name: 联合遗传和化学衣壳改性腺病毒基因转移载体用于屏蔽和靶向 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习利用简单化学方法对腺病毒衣壳进行特定位点修饰的技术，以研究载体与宿主相互作用。该方法可应用于基因治疗、溶瘤和遗传疫苗领域，为个性化治疗提供新策略。

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注意：以下详细描述了一种用于腺病毒载体的基因-化学法聚乙二醇化（PEGylation）的实验方案。为了实现PEG基团的特异性偶联，此前已通过在Ad5载体的六邻体蛋白高变区环5（hypervariable loop 5）中引入半胱氨酸残基的方式对其进行遗传修饰（如先前发表的研究36所述），并采用马来酰亚胺活化的PEG化合物作为偶联试剂。
1. 通过CsCl阶梯梯度纯化载体的缓冲液制备
<ol>
	<li>将 4.76 g HEPES 和 3.504 g NaCl 溶于双蒸水（ddH₂O）中，定容至 400 mL，配制 400 mL 腺病毒缓冲液（Ad-buffer，含 50 mM HEPES 和 150 mM NaCl）。2O)。制备以下三种Ad缓冲液变体需要350 mL该缓冲液。
	<ol>
		<li>方案A：用NaOH将150 mL腺病毒缓冲液（Ad-buffer）调节至pH 7.6。</li>
		<li>变体B：向50 mL溶液中加入终浓度为10 mM的TCEP［三(2-羧乙基)膦，0.143 g］，并用HCl调节pH至7.2。</li>
		<li>变体 C：向 150 mL 体系中加入终浓度为 0.5 mM 的 TCEP（0.022 g），并用 HCl 调节 pH 至 7.2。</li>
		<li>用ddH₂O配制缓冲液2O级和分析纯化学试剂。分别取100 mL的A型和C型溶液，用于制备CsCl缓冲液（见步骤1.2和1.3；各需50 mL），以用于CsCl阶梯密度梯度（见步骤3.2.6和3.2.18）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备CsCl阶梯梯度缓冲液（&#961;CsCl = 1.41 g/cm3) 于 Ad 缓冲液中 
	注意：该缓冲液需要配制两种不同的变体：
	<ol>
		<li>称取两份氯化铯，每份精确至27.42 g，分别放入50 mL离心管中。</li>
		<li>&#961;CsCl = 1.41/TCEP缓冲液：将CsCl溶解于40 mL Ad缓冲液C变体中。</li>
		<li>&#961;CsCl = 1.41 缓冲液：将 CsCl 溶解于 40 mL 腺病毒缓冲液 A 变体中。</li>
		<li>检查并根据需要使用 HCl 调整 pH。用相应的 Ad 缓冲液变体定容至恰好 50 mL。为获得最佳分离效果，精确的 CsCl 浓度和 pH 至关重要。</li>
		<li>通过称量每种梯度缓冲液1 mL（1.41 g）来检测其密度（CsCl含量）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备CsCl阶梯梯度缓冲液（&#961;CsCl = 1.27 g/cm3) 在 Ad 缓冲液中 
	注意：该缓冲液需要配制两种不同的变体：
	<ol>
		<li>称取两份氯化铯，每份精确称量为18.46 g，分别置于50 mL离心管中。</li>
		<li>&#961;CsCl = 1.27/TCEP缓冲液：将CsCl溶于40 mL腺病毒缓冲液C型中。</li>
		<li>&#961;CsCl = 1.27 缓冲液：将 CsCl 溶解于 40 mL 腺病毒缓冲液 A 型中。</li>
		<li>检查并根据需要使用 HCl 调整 pH。最后用相应的 Ad 缓冲液变体定容至恰好 50 mL。为获得最佳分离效果，精确的 CsCl 浓度和 pH 至关重要。</li>
		<li>通过称量每种梯度缓冲液1 mL（1.27 g）来检测其密度（CsCl含量）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有缓冲液（Ad-缓冲液和CsCl阶梯梯度缓冲液）通过过滤（使用0.45 μm滤膜）进行除菌。 &#181;m 网孔尺寸）分装至无菌瓶中。</li>
	<li>灭菌后，为防止TCEP氧化，需用氩气对含有TCEP的缓冲液进行约30秒的鼓泡处理，使缓冲液饱和并覆盖一层氩气。操作时务必使用无菌设备（例如使用氩气时，应采用无菌移液器吸头等无菌耗材，并使用足够大的瓶子以容纳氩气气泡。 
	注意：所有缓冲液均应新鲜配制，避光保存，可在4℃储存 &#176;C，数天内（尤其是氯化铯阶梯梯度缓冲液，应仅保存数天）。</li>
</ol>
2. 偶联基团：储存与准备
注意：用于与半胱氨酸偶联的基团需带有巯基反应性基团。马来酰亚胺活化的化合物将与基因引入的半胱氨酸形成稳定的硫醚键。或者，也可使用邻吡啶基二硫化物（OPSS）活化的化合物，其可在载体颗粒与偶联基团之间形成生物可响应的二硫键。冻干的malPEG-750以及大多数其他偶联试剂对水解敏感，应以冻干粉末形式在-80 °C干燥保存。
<ol>
	<li>为防止冻存管在解冻过程中产生冷凝水，应将冻存管置于装有硅胶珠缓冲层的大管（例如，50 mL 管）中。再将这些大管放入同样填充硅胶珠缓冲层的适当大容器中储存。</li>
	<li>在紧密封闭每个管子和容器之前，用氩气置换内部空气。可通过将开口的管子和容器放入干燥器中，抽除空气并充入氩气来实现。由于氩气密度大于空气，管子和容器会被氩气充满，随后可逐层嵌套放置，并将每个盖子紧密关闭。</li>
	<li>将容器储存在 -80 °C 条件下。</li>
	<li>解冻时，将容器放置在干燥器内的硅胶珠上，缓慢升温至室温后再打开容器。</li>
	<li>进行偶联反应时，应将所需量的偶联底物新鲜溶解于适当的溶剂中。注意偶联溶液的加入量不得超过最终偶联反应体系总体积的 10%，特别是当偶联底物使用 DMF 或 DMSO 作为溶剂时。</li>
</ol>
3. 腺病毒载体的扩增、纯化与化学修饰：
<ol>
	<li>腺病毒载体的扩增 
	注意：以下步骤必须根据当地生物安全规定，在安全柜中进行。
	<ol>
		<li>转染一种复制缺陷型 &#8710;含有一个（或多个）基因导入的半胱氨酸残基的E1缺陷型腺病毒载体，按Kratzer和Kreppel所述方法转染至HEK 293细胞38.</li>
		<li>根据本方案38，通过连续再感染扩增载体，直至最终制备用的15-20个大规格（15 cm）细胞培养板（约1-2 × 107 细胞/孔 
		注意：最佳情况下，最后一次再感染的时间应安排得当，使细胞在纯化和修饰操作当天早晨呈现完全的细胞病变效应（CPE）（参见 图2).</li>
		<li>在最终扩增步骤后，将细胞重悬于含10 mM TCEP的Ad缓冲液（变体B）中，可在-80℃保存 &#176;C；然而，为了获得最佳的载体颗粒产量，建议在细胞裂解后立即进行载体纯化和修饰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腺病毒载体的纯化与化学修饰 
	注意：载体的纯化按照所述的腺病毒纯化方案进行38 但在非氧化条件下进行。细胞收集与裂解以及载体纯化和化学修饰可在一天内完成。按照先前描述的方案收集并裂解感染的细胞38.
	<ol>
		<li>用刮板刮取细胞，并将上清液转移至200-500 mL离心管中。</li>
		<li>将细胞溶液在400 × g离心10分钟。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于4 mL Ad缓冲液 + 10 mM TCEP（pH 7.2）（变体B）中，并转移至无菌50 mL离心管。若细胞产量较低或仅诱导出轻微细胞病变效应（CPE），则用2 mL重悬。</li>
		<li>通过3次冻融循环（液氮中冷冻，37℃下融化）拯救载体 &#176;C 水浴）。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 5,000 x g 离心 10 分钟 &#176;C.</li>
		<li>离心时，准备两份等量的氯化铯阶梯梯度：
		<ol>
			<li>首先，作为下层相，加入3 mL密度为1.41 g/cm³的3 &#961;将CsCl溶于Ad缓冲液 + 0.5 mM TCEP（pH 7.2，变体C）中，加入超速离心管。在加入上相之前，标记管中下相液面的位置。</li>
			<li>小心地将上层5 mL密度为1.27 g/cm³的溶液叠加 &#961;在变体C中，将5 mL CsCl溶于Ad缓冲液加0.5 mM TCEP（pH 7.2）的溶液，沿管壁极其缓慢地加至下层相。 
			注意：由于在偶联过程中高浓度的TCEP可能与malPEG-750的马来酰亚胺残基发生反应，导致偶联效率降低，因此需在较低TCEP浓度下进行CsCl阶梯梯度离心纯化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将上清液加至CsCl梯度中（可将上清液等分加入两个梯度，或在载体产量较低时（见上文）仅加入其中一个梯度），然后用Ad缓冲液 + 10 mM TCEP（pH 7.2，变体B）将两个梯度均加至顶部。</li>
		<li>将相对应的离心管调整至重量差为0.0克。</li>
		<li>在 4°C、176,000 × g 条件下超速离心 2 小时 &#176;C.</li>
		<li>用夹子将超速离心管固定在支架上，使靠近下相液面标记的区域保持可接触。将鹅颈灯置于管子上方。在标记处、上下两相交界处，应可见一条清晰的条带（即载体病毒颗粒）。图&#160;3A-3C).</li>
		<li>用针头刺穿管壁，将病毒载体条带吸入注射器中以收集载体。将收集到的病毒颗粒转移至15 mL离心管中。 
		注意：腺病毒载体条带上方的较弱条带含有不完整的病毒颗粒，应避免吸取。表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的腺病毒载体的细胞碎片和EGFP将聚集在超速离心管的上部（参见 图&#160;3A 和 3B）。从本步骤开始至偶联反应（步骤 3.2.16）之前的各步骤均应迅速进行，因为此时载体对二硫键形成较为敏感，这是由于 TCEP 浓度较低所致。</li>
		<li>为计算在载体样品中实现所有半胱氨酸残基与偶联底物高效完全结合所需的底物用量，需测定OD260:
		<ol>
			<li>根据 Kratzer 和 Kreppel 描述的方案38，涡旋混合10 &#181;收集的载体病毒颗粒的L，89 &#181;升腺病毒缓冲液和1 &#181;L 的 10% SDS。作为空白对照，涡旋 99 &#181;L 的 Ad-缓冲液和 1 &#181;10% SDS 溶液</li>
			<li>为了使病毒颗粒变性，将两者在56℃孵育 &#176;10 分钟，4 °C</li>
			<li>测定OD260.</li>
			<li>计算每单位体积的物理载体滴度 &#181;L 使用以下公式：OD260 稀释倍数 × 腺病毒经验消光系数（1.1 × 109 病毒颗粒 = 1 OD260 单位/&#181;L）。因此，测得的OD260 1.36 乘以 10 再乘以 1.1 乘以 109 约 1.5 × 1010 病毒载体颗粒&#181;L. 
			注意：此滴度仅为粗略估算值；然而，其已足够准确，可用于后续所述的化学计量计算。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据通过引入半胱氨酸所修饰的蛋白质，按照以下通用公式确定偶联反应中偶联底物（以克计）的适量：病毒滴度 × 体积 × 半胱氨酸数量 × 基团过量倍数 × 基团分子量 / 6,022 × 1023 = 克偶联底物。 
		注意：在本方程中：1）病毒滴度是指滴度/&#181;L，由OD测定260 如上所述，2）体积应计入管道中的体积 &#181;用于偶联反应的腺病毒载体体积（L），3）半胱氨酸数量是指每个病毒颗粒中被引入半胱氨酸残基的蛋白质数目，4）修饰基团过量倍数是指实现高效偶联反应所需的修饰基团过量倍数（50倍），5）修饰基团的分子量必须以Da为单位输入（而非kDa）。</li>
		<li>在适当的溶剂中重新溶解所需量（或可实现的量）的化合物。 
		注意：由于偶联底物所需用量较少、称量困难且价格昂贵，应称取尽可能少的化合物量，并将其溶解于适合偶联反应使用的适当浓度溶液中。</li>
		<li>将载体溶液转移至适当大小的离心管中（例如， 2 mL 离心管）中，并加入计算量的偶联化合物储备液至病毒载体中。</li>
		<li>室温下通过顶置旋转轻柔混匀溶液1小时。</li>
		<li>用Ad缓冲液（pH 7.6，变体A）将病毒载体溶液补至总体积6 mL。 
		注意：此步骤必须在将溶液应用于阶梯梯度之前完成，以确保仍含有第一步阶梯梯度中氯化铯（CsCl）的病毒载体溶液密度低于1.27 g/mL。</li>
		<li>在第二次氯化铯梯度离心步骤中，将载体与未反应的偶联基团分离：
		<ol>
			<li>准备两份相同的氯化铯阶梯梯度，每份按以下步骤操作：1）下层：3 mL 密度为 1.41 g/cm³ 的氯化铯溶液；2）上层：3 mL 密度为 1.21 g/cm³ 的氯化铯溶液。3 &#961;CsCl 溶于 Ad-缓冲液（pH 7.6，变体 A）；2）在加入上相前，标记管中下相的液面位置；3）上相：5 mL 的 1.27 g/cm³ 溶液3 &#961;Ad-缓冲液中的CsCl（pH 7.6，变体A） 
			注意：偶联反应完成后，应使用不含TCEP的缓冲液，因为此时病毒载体衣壳上不应再有游离的巯基存在。</li>
			<li>将上清液加至CsCl梯度中，并用Ad缓冲液（pH 7.6，变体A）将两个梯度均加至满管。</li>
			<li>将相对应的离心管重量调整至重量差为0.0克。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 4°C、176,000 x g 条件下超速离心 2 小时 &#176;C.</li>
		<li>超速离心即将结束前，用5 mL腺病毒缓冲液（pH 7.6，A型）将PD-10柱平衡5次。</li>
		<li>如步骤 3.2.10 所述，将超速离心管固定直立，使下相液面标记周围的区域保持可接触状态。将鹅颈灯置于管子上方。在下相与上相交界处附近，应可见一条清晰的条带（即载体病毒颗粒）。图3C).</li>
		<li>用针头刺穿离心管，将病毒载体条带吸入注射器中收集，并转移至15 mL离心管。注意将两根梯度离心管中的病毒颗粒合并收集，总体积不超过2.5 mL。若收集体积较小，需用Ad缓冲液（变体A）补足至2.5 mL总体积。</li>
		<li>将2.5 mL样品加载至已平衡的PD柱上，弃去流出液。</li>
		<li>加入3 mL腺病毒缓冲液（变体A）至柱中，并收集流出液（含纯化的载体病毒颗粒）。</li>
		<li>加入甘油（333 &#181;L）以获得终浓度为10%的溶液，并分装至合适体积的等份中（例如， 400 &#181;L 每份），并包含一份 20 &#181;用于通过光密度测定滴度的 L260 测量</li>
		<li>将载体溶液于 -80 ℃ 保存 &#176;C.</li>
		<li>通过测量OD值确定载体滴度260 20 中的 &#181;L 病毒载体溶液，79 &#181;升腺病毒缓冲液（变体A），以及1 &#181;L 10% SDS，具体操作见步骤 3.2.12。以 79 作为空白对照 &#181;升腺病毒缓冲液（变体A），10 &#181;10% 甘油溶液，1 L &#181;10% SDS 溶液</li>
		<li>将病毒载体滴度计算为：OD260 稀释倍数 × 1.1 × 109 病毒载体颗粒&#181;L. 
		如步骤 3.2.27 所准备，计算：OD260 × 5 × 1.1 × 109 病毒载体颗粒&#181;L</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过SDS-PAGE验证偶联反应：
注意：如果使用分子量足够高的化合物与腺病毒颗粒偶联，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证偶联效果。成功偶联后，与未修饰的腺病毒颗粒蛋白相比，对应修饰后腺病毒颗粒蛋白的蛋白条带应发生迁移（见图4）。
<ol>
	<li>根据所计算的载体滴度（步骤 3.2.28），通过 SDS-PAGE（8%）分离 1-2 × 1010 个载体颗粒。</li>
	<li>采用银染法显色凝胶39，以检测即使很弱的蛋白条带：
	<ol>
		<li>配制银染所需缓冲液（括号内为配制 100 mL 缓冲液所需的试剂用量）：
		<ol>
			<li>通过混合 38 mL ddH2O、50% 甲醇（50 mL 100% 甲醇）、12% 乙酸（12 mL 100% 乙酸）和 0.0185% 甲醛（50 µL 37% 甲醛）配制缓冲液 1。</li>
			<li>将 50% 乙醇（50 mL 100% 乙醇）加入 50 mL ddH2O 中配制缓冲液 2。</li>
			<li>将 0.127 g/L Na2S2O3（12.744 mg）溶于 100 mL ddH2O 中配制缓冲液 3。</li>
			<li>将 2 g/L AgNO3（0.2 g）和 0.0185% 甲醛（50 µL 37% 甲醛）加入 100 mL ddH2O 中配制缓冲液 4。</li>
			<li>将 60 g/L Na2CO3（6 g）、0.0185% 甲醛（50 µL 37% 甲醛）和 2.5 mg/L Na2S2O3 （0.256 mg）加入 ddH2O 中，定容至 100 mL，配制缓冲液 5。</li>
			<li>通过混合 38 mL ddH2O、50% 甲醇（50 mL 100% 甲醇）和 12% 乙酸（12 mL 100% 乙酸）配制缓冲液 6。</li>
			<li>通过混合 60 mL ddH2O、30% 甲醇（30 mL 100% 甲醇）和 10% 甘油（10 mL 100% 甘油）配制缓冲液 7。</li>
			<li>将 10% 甘油（10 mL 100% 甘油）与 90 mL ddH2O 混合配制缓冲液 8。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行银染
	<ol>
		<li>将凝胶在缓冲液 1 中固定 30 分钟。</li>
		<li>用缓冲液 2 洗涤凝胶 15 分钟。</li>
		<li>用缓冲液 3 预处理凝胶 1 分钟。</li>
		<li>用 ddH2O 洗涤凝胶 3 次，每次 20 秒。</li>
		<li>将凝胶在缓冲液 4 中浸渍 20 分钟。</li>
		<li>用 ddH2O 洗涤凝胶 2 次，每次 20 秒。</li>
		<li>在缓冲液 5 中显色，直至条带可见（10 秒至 10 分钟）。</li>
		<li>用 ddH2O 洗涤凝胶 2 次，每次 2 分钟。</li>
		<li>在缓冲液 6 中终止显色反应 5 分钟。</li>
		<li>将凝胶在缓冲液 7 中保存 20 分钟。</li>
		<li>将凝胶储存在缓冲液 8 中。 
		注：可通过密度测定法对目标壳粒的修饰与未修饰条带进行定量，从而确定偶联效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-05597-7_1">Molecular evolution of adenoviruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

通过基因引入的半胱氨酸进行化学修饰的效率通常为80-99%，且某些变量会影响该效率。首先，必须确保基因引入的半胱氨酸不会发生过早氧化。尽管在生产细胞的还原性环境中能得到良好保护，但在从生产细胞释放病毒载体颗粒后以及化学修饰过程中，必须提供非氧化性环境。为此，可使用浓度为0.1-10 mM的还原剂，且必须选用不含巯基的还原剂，以避免其与马来酰亚胺活化的化合物发生快速反应。其次，当使用马来酰亚胺活化化合物时，偶联反应的pH不应超过7.35，因为pH高于7.4会降低反应的特异性。第三，在任何情况下，反应均应使用无胺缓冲液（例如 HEPES、PBS）。值得注意的是，含半胱氨酸的病毒载体颗粒可按前述方法通过两次CsCl梯度离心进行纯化，随后储存于含10%甘油的HEPES缓冲液中，以待化学修饰。在此情况下，应使用0.1-1 mM TCEP作为还原剂，或更优地，将载体储存在氩气环境中。可使用带盖的充氩塑料容器实现此目的。此外，偶联至衣壳的化合物的流体动力学直径及其偶联位点也会影响修饰效率。衣壳中许多衣壳蛋白亚基（如纤维蛋白、六邻体）以三聚体形式存在，或（如五邻体基底）以五聚体形式存在。因此，根据基因引入半胱氨酸的位置，连接在一个单体...

腺病毒（Ad）属于腺病毒科（Adenoviridae），是一类无包膜的DNA病毒，迄今已鉴定出70多种类型（http://hadvwg.gmu.edu）。根据其血凝特性、基因组结构及测序结果，这70种腺病毒可分为七个种（人类腺病毒A至G）1,2。人类腺病毒基因组大小为38 kb，由二十面体核衣壳包裹3。由于含量丰富，衣壳蛋白六邻体（hexon）、五邻体基底（penton base）和纤维蛋白（fiber）均被称为主要衣壳蛋白。其中含量最丰富且分子量最大的六邻体蛋白构成20个衣壳面，每个面由12个六邻体同源三聚体组成4,5。位于每个二十面体顶点的五邻体由五邻体基底的五聚体构成，是顶点突起的基部结构，该突起由糖基化的纤维蛋白三聚体构成5,6。腺病毒进入宿主细胞的过程主要包括两个关键步骤。第一步，纤维蛋白的 knob 结构域与细胞表面的初级受体结合；在A、C、E和F种腺病毒中，该受体为柯萨奇病毒与腺病毒受体（coxsackie and adenovirus receptor, CAR）。这一相互作用使病毒颗粒靠近细胞膜表面，从而促进细胞表面整合素与五邻体基底中的RGD基序之间的结合，进而引发细胞内的信号响应。第二步，细胞骨架发生改变，导致病毒颗粒被内吞并转运至内体7。病毒在内体中发生部分解体后，释放至细胞质，并最终转运至细胞核内进行复制。
尽管腺病毒（Ad）可进行局部递送（例如，用于基因疫苗接种），但如肿瘤病毒治疗所需的通过血液系统的全身性递送仍面临多种障碍。当腺病毒在血液中循环时，注射的病毒颗粒会遭遇宿主免疫系统的防御机制，导致基于病毒的载体迅速被中和，从而使腺病毒载体在全身性应用中效率极低。此外，腺病毒天然的嗜肝性会干扰其全身递送效果，必须解决这一问题才能将腺病毒重定向至新的靶细胞。
先天免疫系统中胚系编码的天然IgM抗体可快速识别并结合病毒颗粒表面高度重复的结构8,9这些免疫复合物随后激活补体系统的经典与非经典通路，导致大量病毒颗粒被补体介导的机制迅速中和。8另一种导致腺病毒病毒颗粒大量清除的途径由巨噬细胞介导10&#160;并与急性毒性和血流动力学副作用相关11,12以腺病毒（Ad）为例，定位于肝脏中的库普弗细胞可结合并以吞噬作用摄取腺病毒病毒颗粒 通过 特异性清道夫受体，从而将其从血液中清除13,14,15肝脏窦状内皮细胞（LSE细胞）上也已鉴定出特定的清道夫受体。16，LSE 细胞似乎也有助于载体的清除17，但其程度仍有待阐明。此外，某些腺病毒类型及其&#160;衍生载体可被人类红细胞高效摄取18&#160;它们所结合的 通过 CAR 或补体受体 CR119.&#160;值得注意的是，这种隔离机制无法在小鼠模型系统中进行研究，因为与人类红细胞不同，小鼠红细胞不表达CAR。
适应性免疫系统在接触腺病毒（Ad）后会产生特异性的抗Ad抗体，这种接触可能源于先前的Ad感染，或首次全身性应用Ad载体所致。这些抗体构成了有效使用Ad载体的另一重障碍，在高效的全身递送中应设法避开这些抗体的影响。
最后，某些腺病毒（Ad）类型（包括Ad5）强烈的嗜肝性严重阻碍了Ad在全身治疗中的应用。这种嗜肝性导致肝细胞转导，原因是Ad病毒颗粒与血液凝血因子X（FX）具有高亲和力，该作用由FX与Ad六邻体蛋白（hexon protein）的相互作用介导20,21,22。FX在病毒颗粒与肝细胞表面的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖（HSPGs）之间起桥梁作用20,23,24,25。这一相互作用的关键因素似乎是肝细胞中HSPGs特有的N-和O-硫酸化程度24，这与其他细胞类型的HSPGs不同。除了这种FX介导的途径外，最近的研究还提示存在其他尚未明确的途径，也可导致Ad对肝细胞的转导26,27,28。
最近研究表明，FX不仅参与腺病毒（Ad）对肝细胞的转导，而且通过结合，病毒颗粒可借助FX屏蔽补体系统对病毒颗粒的中和作用。26因此，通过阻止FX结合来降低肝细胞转导，将产生增加腺病毒中和作用的不良副作用 通过 先天免疫系统
因此，必须深入了解载体与宿主生物之间复杂的相互作用，以开发出更高效的载体，用于克服宿主生物所造成的障碍的全身性应用。
一种最初用于治疗性蛋白质的策略已被应用于腺病毒（Ad）载体，以至少部分克服上述障碍。通过与聚乙二醇（PEG）偶联，可降低治疗性蛋白质化合物的抗原性和免疫原性。29,30因此，将聚乙二醇（PEG）或聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]（pHPMA）等聚合物共价偶联至衣壳表面，可使载体免受非特异性载体-宿主相互作用的影响。通常，聚合物偶联靶向衣壳表面随机分布的赖氨酸侧链残基上的ε-氨基。由于所连接聚合物具有亲水性，溶液中的载体颗粒周围会形成稳定的水化层，从而降低被免疫细胞识别或酶降解的风险。此外，已有研究表明，经PEG修饰的腺病毒载体可逃避抗六邻体抗体的中和作用。 体外 在预先免疫的小鼠中 体内31与基因改造衣壳不同，聚合物的化学偶联是在病毒生产与纯化完成后进行的，这不仅允许使用常规的生产细胞系并制备高滴度的病毒载体储备液，还可同时对衣壳表面数千个氨基酸进行修饰。然而，这种靶向胺基的屏蔽作用会随机发生在整个衣壳表面，导致高度异质性，并无法实现对特定衣壳蛋白亚基（capsomers）的定向修饰。此外，产生有益效应所必需的较大聚合物基团会损害病毒的生物活性。32.
为了克服这些局限性，Kreppel 等.33 引入了一种用于载体重定向与去靶向的基因-化学概念。在病毒衣壳的溶剂暴露位点（如纤维蛋白HI环）通过基因工程引入半胱氨酸33蛋白IX34和六邻体35,36尽管半胱氨酸修饰的腺病毒载体并非天然存在，但可在普通生产细胞中以高滴度产生。重要的是，在特定衣壳蛋白亚基或同一亚基的不同位置插入半胱氨酸，可实现对巯基反应性基团的高度特异性修饰。这种基因-化学联合策略已被证实可克服腺病毒载体设计中的诸多障碍。基于氨基的聚乙二醇化用于去靶向，结合转铁蛋白通过硫醇基团偶联至纤维蛋白 knob 区 HI 环，已证明可成功将修饰后的腺病毒载体重定向至 CAR 缺失细胞。33由于六邻体（hexon）参与了大多数不良相互作用（如中和抗体反应、血液凝血因子FX结合），因此也对六邻体应用了基于巯基的修饰策略。将小分子PEG偶联至六邻体的HVR5区域可阻止腺病毒载体颗粒在FX存在下转导SKOV-3细胞，而大分子PEG则增强了肝细胞的转导能力。14,35携带纤维 knob 区突变（抑制 CAR 结合）和 HVR7 突变（抑制 FX 结合，同时在 HVR1 插入半胱氨酸以实现位点特异性 PEG 化）的腺病毒载体颗粒被证明可逃避抗体和补体介导的中和作用，以及清道夫受体介导的摄取，且不损失感染活性。有趣的是，尽管缺乏天然的 FX 保护层，PEG 化仍能再次提高肝细胞的转导效率，且该效应随 PEG 分子大小而变化36然而，研究表明共价屏蔽确实会影响细胞内运输过程。Prill 等比较了基于pHPMA的不可逆性与生物响应性保护层，结果表明，屏蔽方式或共聚物电荷均不影响细胞摄取，但会影响颗粒向细胞核的转运。采用带正电荷的pHPMA共聚物作为生物响应性保护层，可实现颗粒向细胞核的有效转运，同时保持腺病毒载体的高转导效率 体外 和 体内37.
总之，这些数据表明，即使假设所有载体-宿主相互作用都已知并被考虑，仍需对衣壳表面进行大量修饰，才能克服与系统性载体递送相关的障碍。
本文提供了一种对腺病毒载体衣壳进行位点特异性化学修饰的实验方案，用于屏蔽和/或重定向腺病毒载体颗粒以及基于腺病毒的溶瘤病毒。该技术的概念如图1所示。通过共价连接合成聚合物，可屏蔽衣壳特定区域，避免其发生非预期的相互作用。同时，该方法还可实现配体的连接，从而将屏蔽与靶向功能相结合。利用简单的化学反应，实验人员能够共价修饰腺病毒载体表面，所连接的分子种类广泛，包括肽/蛋白质、碳水化合物、脂类及其他小分子。此外，本方案提出了一种通用策略，可在保持生物活性病毒衍生载体生物学完整性和活性的前提下，对其进行化学修饰。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;载体纯化与化学修饰&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氩气</td><td>Air liquide</td><td>本地气体供应商</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>Air liquide</td><td>本地气体供应商</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Express Plus 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦（TCEP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-10g</td><td></td></tr><tr><td>2 mL（3 mL）Norm Ject（注射器）</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>一次性细针头（黄色 0.9 × 40 mm）</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710009040</td><td></td></tr><tr><td>氯化铯 99.999% 超纯级</td><td>Roth</td><td>8627.1</td><td></td></tr><tr><td>硅胶珠</td><td>Applichem</td><td>A4569.2500</td><td></td></tr><tr><td>甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺-750（PEG mal-750）</td><td>Iris Biotech</td><td></td><td>置于硅胶珠中于 -80 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>13.2 mL 超透明超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>仅可在通风橱中开启</td></tr><tr><td>PD-10 尺寸排阻层析柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A1069.1000</td><td></td></tr><tr><td>SDS 超纯级</td><td>AppliChem</td><td>A1112,0500</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>AppliChem</td><td>A1123.1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-0231SP</td><td></td></tr><tr><td>优质胎牛血清（FBS Good）</td><td>PAN Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere 滤芯吸头（多种规格）</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清移液管（多种规格）</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反应管（多种规格）</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC 培养皿 15 cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;银染实验材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>J.T.Baker</td><td>8045</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>AppliChem</td><td>1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>AppliChem</td><td>A0820,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 37%</td><td>AppliChem</td><td>A0877,0250</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>AppliChem</td><td>A1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>AppliChem</td><td>1,418,791,210</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>AppliChem</td><td>A3944.0025</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>AppliChem</td><td>A3900,0500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;特殊实验设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>Nalgene</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megafuge TX750 转子及适配器与 500 mL 管盖</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>常规</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 &lt;em&gt;例如 &lt;/em&gt;Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>适配的超速离心转子&lt;em&gt; 例如 &lt;/em&gt;SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>常规</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带夹子的支架</td><td>常规</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鹅颈灯</td><td>常规</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顶置式搅拌器</td><td>常规</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温金属浴</td><td>常规</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（OD 260）</td><td>常规</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

腺病毒基因转移载体的遗传与化学衣壳联合修饰用于屏蔽与靶向

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

腺病毒载体是基因疫苗接种和溶瘤病毒治疗的有力工具。然而，它们在多次使用后尤其容易引发多种非预期的载体-宿主相互作用，特别是 体内 递送。目前普遍认为，只有对载体表面进行明确的修饰，才能克服由非预期的载体-宿主相互作用所带来的限制。这些修饰包括通过引入新的配体来屏蔽颗粒以避免非特异性相互作用，并实现靶向递送。本方案的目标是使读者能够制备出具有屏蔽功能、并可根据需要实现重靶向的人源腺病毒基因转移载体或溶瘤病毒。该方案将使研究人员能够通过特异性化学连接合成聚合物、碳水化合物、脂类或其他生物或化学分子，对腺病毒载体衣壳表面进行修饰。本方案描述了前沿的遗传与化学衣壳修饰联合技术，该技术已被证明有助于深入理解并克服腺病毒在应用中所面临的递送屏障 体内 腺病毒载体的递送。本文提供了对执行涉及生物活性病毒或病毒衍生载体的特定化学反应的关键步骤进行详细且附有评注的描述。该方案所描述的技术基于将（天然缺失的）半胱氨酸残基通过遗传手段引入腺病毒衍生载体的溶剂暴露环区。这些半胱氨酸残基在载体以高滴度生产后，可提供特异性的化学反应活性，从而实现多种不同物质类别分子与载体颗粒之间高效且高度特异的共价化学偶联。重要的是，该方案可轻松调整，用于对腺病毒载体衣壳进行多种不同的（非巯基依赖型）化学修饰。最后，基于本方案，有望对除腺病毒外的其他非包膜病毒载体系统进行类似的改造。

图2展示了在293（HEK 293）细胞上出现的细胞病变效应（CPE）示例，表明载体已成功产生。在用病毒载体接种后40-48小时，细胞应显示出相应的形态学变化（图2C）。收获时间点的选择至关重要，过早会导致病毒颗粒因细胞裂解而丢失，同时也会防止基因引入的巯基发生氧化。若病毒颗粒因细胞裂解而释放到培养基中，基因引入的巯基将几乎立即被氧化，从而难以进行纯化和化学修饰。
图3展示了典型的CsCl条带。在化学修饰前进行不连续CsCl梯度离心的目的是去除病毒颗粒中的细胞碎片。化学修饰本身可在CsCl中进行。化学修饰后的第二次梯度离心则用于去除过量的（未反应的）偶联基团。需要注意的是，病毒是否成功修饰无法通过梯度结果直接观察，需进一步进行分子分析，理想方法为SDS-PAGE。
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本文所述方案使研究人员能够通过简单的化学方法在特定位置特异性修饰腺病毒衣壳。可由此生成被屏蔽的腺病毒载体颗粒和重定向基因转移载体，并可用于研究载体与宿主之间的相互作用。

腺病毒载体是基因疫苗接种和溶瘤病毒治疗的有力工具。然而，它们容易引发多种非预期的载体-宿主……

该方法有助于回答基因治疗、溶瘤治疗和遗传免疫接种领域的关键问题。它能够促进对腺病毒基因转移载体（迄今为止临床试验中使用最频繁的载体类型）与宿主相互作用的理解和调控。该技术的主要优势在于，可通过简单的化学方法，在特定位置以高度明确的方式并按可变程度对腺病毒衣壳进行特异性修饰。该技术在治疗领域具有重要意义，因为载体与宿主的相互作用不仅可被分析，还可针对患者进行调控。尽管该方法能够揭示特定的载体-宿主相互作用，也可用于在活体生物（如小鼠）中标记并追踪病毒颗粒。通常，初次接触该方法的研究人员将面临病毒学与有机化学的独特结合所带来的挑战，这需要同时具备两个领域的实践知识。该技术的特殊演示至关重要，因为此处有机化学的方法与细胞生物学及病毒学的方法相交汇，包括特定领域的操作技巧。开始此实验前，请按照文本方案中所述配制所有缓冲液。称取一毫升每种梯度缓冲液以检测其密度。将所有缓冲液灭菌后，用氩气对含有TCEP的缓冲液吹扫约30秒，以防止TCEP氧化。将含有固态粉末状偶联基团的小瓶储存于较大的试管中，每个大试管内填充一层硅胶珠作为缓冲，以防止小瓶解冻时冷凝水积聚。将这些试管放入干燥器中。抽出干燥器中的空气，并用氩气替换。然后将每个试管紧密封闭，并转移至一个装有硅胶珠的大容器中。待所有试管转移完毕后，关闭容器。将容器保存在 80 摄氏度下，直至准备使用。当需要解冻时，将容器放入干燥器中的硅胶珠层内。让容器缓慢升温至室温，然后打开容器。当细胞达到最佳细胞病变效应时，用刮板收集细胞，并将上清液转移至离心管中。以400 × g离心10分钟。随后，将细胞沉淀重悬于4毫升含有10 mmol/L TCEP的Ad缓冲液中，并将所得溶液转移至无菌的50毫升离心管中。将溶液在液氮中冷冻，然后在37摄氏度水浴中解冻。重复此冻融循环三次以回收载体。在4摄氏度下以5000 G离心10分钟。离心时，取出两个超速离心管，开始制备两份等量的氯化铯阶梯梯度。向每根离心管中加入3 mL下层相。在加入上层相之前，先在管壁上标记下层相的液面位置。然后小心地将上层相的5 mL缓慢沿管壁加入到底层相中，使用移液器极缓慢地进行操作。当梯度制备完成且离心结束后，将样品的上清液等量地加至两个梯度上。用含有10 mmol/L TCEP的Ad缓冲液填充每个梯度管中的剩余空间，确保将管完全加满至顶部。调整相对试管的重量，使重量差为零。然后在176000 ×g、4 °C条件下离心两小时。之后，使用夹具将一根超速离心管固定在支架上。确保标记处下方相界面周围的区域保持可见。将鹅颈灯放置在试管上方。在标记处周围，即下相与上相的交界处，应可见一条清晰的条带。用针头刺穿试管，将载体条带吸入注射器以收集载体。将收集到的载体病毒颗粒转移至一个15毫升的试管中，并根据文本方案中所述计算所需偶联底物的量。然后，将载体溶液转移至适当大小的试管中。以及计算量的偶联化合物储备液。室温下轻轻旋转混匀一小时。接下来，加入Ad缓冲液，将载体溶液的总体积调至6毫升。使用文本方案中所述的第二次氯化铯结合步骤，从未反应的偶联基团中纯化载体。用针头刺穿试管，将载体条带吸入注射器中。将收集到的载体转移至15毫升离心管中。如果两个梯度管的合并体积小于2.5毫升，则加入Ad缓冲液将体积调至2.5毫升。将合并的病毒颗粒上样到一个等量升级的Pd柱上，并弃去穿流液。然后向柱中加入3毫升Ad缓冲液，并收集穿流液。向收集的流穿液中加入 333 微升甘油，以获得终浓度为 10% 的溶液。将其分装为合适的等份，并确保其中包含一份 20 微升的等份，用于通过 OD 260 测定进行更精确的定量。将载体溶液保存在 80 摄氏度，直至准备使用。对 293 细胞作用的代表性结果表明，载体生产成功。接种病毒载体后 40 至 48 小时，细胞应显示相应的形态学变化。随后使用银染SDS噬菌体来评估偶联效率。同时进行带有引入衣壳五邻体基底部的半胱氨酸的载体电泳，包括六邻体修饰和未修饰的载体。六邻体条带出现迁移偏移，表明每个衣壳中超过90%的单体成功实现了修饰。进行此操作时，必须确保未修饰的载体颗粒处于还原性环境中。修饰完成后，常规大气环境即可满足要求。必须通过精确的记录和计算，确保所有载体颗粒的定量修饰。该技术的开发有助于基因治疗领域的研究，进一步探索安全且高效的载体递送策略。在此方法基础上，可进一步开展配体偶联以实现靶向递送，或使用荧光染料进行标记，从而回答受体利用和生物分布等其他科学问题。请务必遵守您所在地区的转基因生物（GMO）及实验室安全操作规范。

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