口服抗生素处理后小鼠肠道微生物群的定量聚合酶链式反应分析

本方案提供了一种可靠的方法，用于定量分析小鼠经口服抗生素处理后肠道微生物群的变化。该方法有助于研究微生物群之间的相互作用，为与菌群失调相关的病理状态（如炎症性肠病）提供见解。这些抗生素处理方案的主要优势在于，能够避免小鼠在口服抗生素后通常出现的显著体重下降。

通过口服灌胃进行抗生素处理时，需制备抗生素混合液：按照技术方案中所述方法配制各抗生素储备液，然后将它们混合。配制1毫升混合液时，加入50微升氨苄青霉素、50微升庆大霉素、50微升新霉素、500微升甲硝唑、25微升万古霉素以及325微升水。将抗生素混合液吸入1毫升注射器中，排除所有气泡，并连接合适规格的灌胃针头。

牢固抓住小鼠肩部上方的皮肤，并拉直头部与颈部以伸展食管。将喂食针的球形针头沿上颚顶部向咽后部推进，然后轻柔地将其送入食管，并注入200 µL溶液。

在实验期间，每天给予一次抗生素混合物。作为通过饮用水给予抗生素的替代方法，按照技术方案中所述配制抗生素混合物。必须在抗生素混合物中加入甜味剂，因为这是防止小鼠脱水的关键因素。

将抗生素混合液分装至水瓶中，每瓶约 100 毫升。避光保存，并放置于小鼠笼内。实验期间每周更换两次新鲜的抗生素混合液。

在抗生素给药期间，应每天仔细监测小鼠的体重及总体健康状况。称重并标记2毫升的 autoclave 管用于样本采集。采集新鲜粪便样本时，将每只小鼠放入固定器中。

然后用收集管直接从肛门采集粪便颗粒。按照技术方案中所述实施安乐死后，将小鼠尸体腹部完全暴露朝上放置，并用70%乙醇喷洒腹部区域。使用灭菌的镊子和剪刀在腹部做横向切口，暴露腹膜，注意不要损伤任何内部组织。

提起腹膜，做切口以暴露肠管。用镊子和剪刀取出肠管，并置于无菌的培养皿中。小心使用镊子将小肠从肠系膜动脉和脂肪组织中分离出来。

将肠道拉直并放置在干净的实验纸巾上。使用直尺测量，并截取小肠远端回肠的四厘米肠段。剪除并丢弃靠近盲肠端近端的一厘米肠段。

将保留一段3厘米长的回肠用于收集肠道细菌。将回肠部分置于一个2毫升无菌管上方，通过直接挤压肠管内容物，将样本收集到管中。

该样本将含有来自回肠内容物的细菌。用一个装有冷磷酸盐缓冲液的20毫升注射器冲洗回肠段，弃去冲洗液。将回肠段置于无菌培养皿中，并用剪刀沿纵轴剪开。

用手术刀刮取回肠壁内侧。用一毫升磷酸盐缓冲液冲洗手术刀，并将冲洗液收集到干净的离心管中，以获取手术刀上的细菌。在八千倍重力下离心五分钟，使细菌沉淀。

离心后弃去上清液。此样品将含有来自回肠壁的细菌。称量含有粪便和回肠样品的离心管。

用空管重量减去样品总重量，计算出每个样品的粪便重量。使用市售试剂盒从粪便、回肠内容物和回肠壁样品中提取细菌DNA。将DNA样品于-20°C保存，直至使用。

将商用 qPCR 标准品、粪便样本 DNA 及 qPCR 试剂在冰上解冻。用无菌无 DNA 水将标准品稀释至每微升 10⁷ 到 10² 拷贝的浓度范围。将粪便样本 DNA 稀释至二分之一、五分之一和十分之一浓度。

然后为总反应数加一个反应配制总反应混合液。将30微升总反应混合液与5微升模板（标准品、样品或用于阴性对照的水）混合。随后将10微升该混合液加入384孔光学qPCR板的每个孔中。

每个反应设三个重复。密封qPCR板后短暂离心，然后将板放入已按照技术方案中所列程序设定好的qPCR仪中。

最后获取标准品和样品的循环阈值，然后计算粪便样品的16S rDNA拷贝数。代表性结果表明，通过灌胃或饮水给予抗生素后，小鼠出现体重下降。通过灌胃给予抗生素的小鼠未检测到明显的体重下降。

当小鼠在饮水中接受抗生素处理时，它们在治疗最初几天内会失去约10%的体重，但随后恢复正常的体重增长。对粪便样本中细菌数量的定量需要使用标准曲线，该曲线通过将标准品的拷贝数对数值与其在qPCR中获得的C-T值进行绘图而得到。在标准曲线的线性范围内，回归分析方程可用于定量粪便样本中16S rDNA的丰度。

如图所示，针对粪便、小肠内容物和小肠壁样本。在口服抗生素处理5天或10天后，经抗生素处理小鼠的粪便样本中细菌密度显著下降。然而，在停止抗生素给药一周后，粪便中细菌密度恢复至正常水平。

口服灌胃和饮水中给予抗生素均可短暂降低处理小鼠的粪便细菌载量。研究人员可根据实验需求（例如处理时间长短等因素）选择更适合的给药方法。用于细菌定量的qPCR方法可通过使用特异性引物进行修改，以定量特定的细菌分类群。

这将提供关于微生物组大小和组成的定量与定性信息。