口服抗生素治疗小鼠肠道微生物群的定量聚合酶链反应分析
November 17th, 2018
在这里, 我们提供了详细的方案, 口服抗生素给小鼠, 收集粪便样本, dna 提取和定量的粪便细菌的 qpcr。
该协议提供了一种可靠的方法，量化小鼠在口服抗生素给药后肠道微生物群的变化。这可以帮助研究交叉微生物群相互作用，提供与微生物生物障碍（如炎症性肠病）相关的病理学的见解。这些抗生素治疗方案的主要优点是，它们可以防止通常与小鼠口服抗生素给药相关的特征性减肥。
通过口服加夫格预制抗生素治疗，通过混合技术协议中描述的库存溶液来准备抗生素的鸡尾酒。对于毫升混合50微升的安皮西林，50微升的根霉素，50微升的新霉素，500微升的麦地纳达佐尔，25微升的万科霉素和325微升的水。将抗生素混合物加载到一毫升注射器上，同时消除任何气泡，并连接适当的量具量具针。
牢牢抓住老鼠肩上的皮肤，伸展头部和颈部，拉直食道。将喂食针的球尖沿着嘴的屋顶指向咽部背面。然后轻轻地将其传递到食道中，并注射200微升溶液。
在实验期间每天管理一次抗生素鸡尾酒。或者通过饮用水施用抗生素，如技术协议所述，准备抗生素鸡尾酒。将甜味剂加入抗生素混合物非常重要，因为这是防止小鼠脱水的关键因素。
将抗生素鸡尾酒以每瓶约100毫升的速度放入水瓶中。保护瓶子免受光线的光，并放在鼠标笼中。在实验期间，每周两次用新鲜库存代替抗生素鸡尾酒。
应在整个抗生素给药过程中每天对小鼠体重和总体健康状况进行仔细监测。称重并标注两毫升的分管，用于样品采集。为了收集新鲜的粪便样本，将每只鼠标放在一个约束器中。
然后直接从收集管中的肛门收集粪便颗粒。如技术协议所述实施安乐死后，将一只老鼠尸体与腹部完全暴露，用70%乙醇喷洒腹部区域。使用灭菌钳和剪刀在腹部做一个横向切口，在不损害任何内部组织的情况下暴露腹水。
提起氦，做一个切口，露出肠子。用钳子和剪刀取出肠子，放在消毒培养皿中。小心地使用钳子来取笑小肠远离肠动脉和脂肪。
延长肠子，放在干净的实验室擦拭上。用尺子测量并切开小肠的四厘米。切开并丢弃一厘米的肠子。
还剩下三厘米的肠菌，用于收集肠道细菌。将 ileum 部分放在两毫升无菌管上。通过直接挤出肠道和收集管子中的样品来收集肠道内容。
这个样本中会有细菌。准备一个20毫升的注射器与冷磷酸盐缓冲盐水，并冲洗开液部分丢弃流。将 ileum 部分放在无菌培养皿上，用剪刀纵向打开。
用手术刀刮掉伊勒姆墙的内侧。通过用一毫升PBS在干净的离心管上清洗手术刀上的任何细菌来收集它。在八千次G下旋转五分钟，使细菌产生颗粒。
离心后丢弃上经剂。这个样品将含有来自 ileum 壁的细菌。称重含有粪便和粪便样品的管子。
从空管中减去重量，以获得每个样品中的粪便重量。使用市售的试剂盒从粪便中提取细菌DNA、ileum含量和耳膜壁样品。将DNA样本储存在零下20摄氏度，直到使用。
从商用冰上试剂盒中解冻 qPCR 标准、粪便样本 DNA 和 qPCR 试剂。稀释无菌脱氧核糖核酸无水的标准，范围从10到7到10，每微升2份。将粪便样本DNA稀释至半、五分之一和十分之一浓度。
然后对反应总数加一进行主混合反应。混合主混合的 30 微升和模板的 5 微升，这是负对的标准、样品或水。然后，在 384 井光学 qPCR 板中，将这种混合物的 10 微升添加到每一个井中。
在三次三次中执行每个反应。密封 qPCR 板并短暂关闭离心机。然后将板加载到技术协议中列出的 qPCR 机器上。
最后在计算粪便样品的 16S rDNA 拷贝数之前，获取标准和样品的周期阈值。代表性结果表明，口服抗生素或饮用水给药后，小鼠体重减轻。在通过口服抗生素接受抗生素的小鼠中，未检测到明显的减肥。
当小鼠在饮用水中接受抗生素治疗时，它们在治疗后最初几天内会减轻体重的10%，但之后会恢复正常的体重增加。粪便样本中细菌的定量要求使用通过绘制标准拷贝数对数与 qPCR 中获得的 C-T 值获得的标准曲线。在线性范围内，回归分析方程能够量化粪便样本中的16S rDNA丰度。
如这里所示的粪便，小肠含量和小肠壁样品。口服抗生素给药5天或10天后，抗生素治疗小鼠粪便样本中细菌密度大幅下降。然而，在抗生素给药停止一周后，粪便中的细菌密度恢复到正常水平。
饮用水中的口服加维和抗生素的给药都可短暂地减少治疗小鼠的粪便细菌负荷。选择更适合实验要求的单独方法的研究人员考虑了治疗时间等因素。可以修改用于细菌定量的 qPCR 方法，使用特定的底法来量化单个细菌分类。
这将提供有关微生物群大小和组成的数量和夸类信息。
概述
该协议提供了一种可靠的方法，用于量化小鼠口服抗生素后肠道微生物群的变化。它有助于研究与微生物失调相关的微生物相互作用和病理学。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 神经科学
- 药理学
背景
- 了解抗生素对肠道微生物群的影响对于研究相关疾病至关重要。
- 抗生素治疗可能导致微生物失调，影响整体健康。
- 体重减轻是小鼠口服抗生素的常见副作用。
- 有效的给药和监测协议对于获得准确结果至关重要。
研究目的
- 建立一种不会导致小鼠显著体重减轻的抗生素给药方法。
- 收集和分析粪便样本以进行细菌DNA定量。
- 调查抗生素对肠道微生物群组成的影响。
使用的方法
- 为口服灌胃或饮用水准备抗生素混合物。
- 在实验结束后收集粪便样本和肠道内容物。
- 使用商业试剂盒从样本中提取DNA。
- 通过qPCR分析定量细菌。
主要结果
- 通过口服灌胃给小鼠施用抗生素，没有显著的体重减轻。
- 饮用水中的抗生素导致初始体重减轻，但观察到恢复。
- 细菌DNA定量显示微生物群组成发生了显著变化。
- 建立了标准曲线，用于准确测量16S rDNA的丰度。
结论
- 该协议有效地最小化了小鼠在抗生素治疗期间的体重减轻。
- 它提供了一种研究抗生素对肠道微生物群影响的可靠方法。
- 研究结果有助于理解微生物失调及其对健康的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable quantification of murine intestinal microbiota changes following oral antibiotic treatment, supporting preclinical studies of microbial dysbiosis linked to immunopathologies. By minimizing weight loss artifacts, it improves data interpretability for target validation in inflammation and immune-mediated disease models. The qPCR-based bacterial density assay provides quantitative, reproducible outputs essential for mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbiota-immune crosstalk hypotheses in inflammatory bowel disease and arthritis models.
- Operational Value: Provides weight-stable antibiotic regimens that reduce confounding variables in target phenotype assessment.
- Predictive Value: Supports functional target validation by correlating microbial density shifts with immune cell functional readouts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized fecal sample preparation and DNA extraction compatible with high-throughput qPCR platforms.
- Quantitative Output: Generates 16S rDNA copy number measurements via standard curves, enabling lot-to-lot consistency in microbiome modulation studies.
- Scalability: Supports longitudinal sampling designs for dose-response and time-course screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antibiotic-induced dysbiosis observed in human patients, enhancing translational validity of preclinical findings.
- Mechanistic De-risking: Links microbial community changes to immune cell function, reducing ambiguity in pathway-target relationships.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal tracking of microbiota recovery post-treatment, informing safety and resistance risk assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing microbiota modulation as a mechanistic variable in immunology and infectious disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbiota-dependent phenotypes in disease models via controlled antibiotic perturbation.
- Screening: Enables assay-ready microbiome samples for evaluating compound effects on bacterial load and composition.
- Analytics: Delivers quantitative 16S rDNA abundance data that allows cross-condition comparison and effect size calculation.
- Translational Research: Connects murine microbiota changes to human-relevant dysbiosis patterns, supporting biomarker-aligned study designs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microbiota quantification capability applicable across multiple therapeutic areas and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing weight-loss confounders in microbiota-immune studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized antibiotic cocktails and qPCR validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic links between microbial shifts and immune outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on microbiota-dependent disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, oral gavage technique, and anaerobic sample processing.
- Depends on qPCR instrumentation, standard curve generation, and DNA extraction kit compatibility.
- Necessitates cross-team standardization for sample collection timing, storage, and normalization procedures.
- Involves adaptation considerations when extending to different mouse strains, antibiotic combinations, or intestinal segments.
- Includes practical limitations such as the need for euthanasia to access intestinal tissue and potential variability in fecal pellet yield.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Administration of Antibiotics
2:29
Collection of Fecal Samples from Stool, Ileum Content and Ileum Wall
5:16
Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR
6:33
Results: Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR after Oral Antibiotic Treatment
7:51
Conclusion
