Name: 口服抗生素治疗小鼠肠道微生物群的定量聚合酶链反应分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 了解口服抗生素治疗后小鼠肠道微生物群变化的定量分析方法。本方案通过qPCR技术检测粪便样本中细菌DNA，有效避免小鼠体重下降，为研究微生物失调相关疾病提供可靠工具。

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本工作由英国医学研究理事会（对 P.B. 的资助号 MR/L008157/1）资助；R.J. 获得玛丽·居里欧盟内奖学金（H2020-MSCA-IF-2015-703639）支持；P.M.B. 获得英国医学研究理事会与伦敦国王学院生物医学科学博士培训合作伙伴项目奖学金（MR/N013700/1）支持。

本实验采用6-8周龄的野生型（C57BL6/J）小鼠进行，小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。所有动物实验均经伦敦国王学院、弗朗西斯·克里克研究所动物福利与伦理审查委员会以及英国政府内政部批准。在开展任何动物实验操作前，须确保已通过所在机构/组织获得相应的许可。
1. 抗生素的给药
注意：提供两种抗生素处理的替代方法：口服灌胃（步骤 1.1）和通过饮用水给予抗生素（步骤 1.2）。
<ol>
	<li>口服灌胃
	<ol>
		<li>将下列抗生素分别溶于高压灭菌水中，配制成以下浓度的母液：氨苄青霉素 100 mg/mL、庆大霉素 100 mg/mL、新霉素 100 mg/mL、甲硝唑 10 mg/mL 和万古霉素 100 mg/mL。使用 0.45 µm 滤膜过滤除菌。分装后于 -20 °C 保存。</li>
		<li>将上述配制的抗生素母液混合，制备抗生素混合液。取50 µL氨苄青霉素（终浓度5 mg/mL）、50 µL庆大霉素（终浓度5 mg/mL）、50 µL新霉素（终浓度5 mg/mL）、500 µL甲硝唑（终浓度5 mg/mL）、25 µL万古霉素（终浓度2.5 mg/mL）以及325 µL水，混匀后定容至1 mL。使用前新鲜配制该混合液。</li>
		<li>将抗生素混合液装入无菌的1 mL注射器中并固定&#160;适当规格的灌胃针（15–20 g 小鼠使用 20 G）并排除所有气泡。</li>
		<li>用 200 µL 抗生素混合液对小鼠进行灌胃。
		<ol>
			<li>牢固抓住小鼠肩部上方的皮肤，拉直头颈部以伸展食管。将喂养针的圆头沿上颚向咽后部引导，然后轻柔地将其送入食管，注入200 μL溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在实验期间每天给予一次抗生素混合物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>饮水中抗生素的使用 
	警告：在饮水中给予抗生素的前两周内，需每日密切监测小鼠体重。
	<ol>
		<li>将以下成分溶解于1 L灭菌水中，配制抗生素混合液：1 g氨苄青霉素（终浓度1 g/L）、1 g新霉素（终浓度1 g/L）、1 g甲硝唑（终浓度1 g/L）、0.5 g万古霉素（终浓度0.5 g/L）以及8包人工甜味剂（每包0.75 g，终浓度60 g/L）。振荡至完全溶解，4 °C保存。 
		注意：添加甜味剂是为了掩盖抗生素的味道并防止小鼠脱水。尽管多种甜味剂品牌均可使用，但每种特定品牌所需的最终浓度可能不同。</li>
		<li>将抗生素混合液加入水瓶中（约100 mL/瓶），并将水瓶放置于小鼠笼具上。 
		注意：使用棕色瓶或将瓶子用铝箔包裹，以保护抗生素免受光照。</li>
		<li>每周两次用新鲜的抗生素混合液替换原有混合液，持续整个实验过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 粪便、回肠内容物及回肠壁样品的采集
<ol>
	<li>称重并标记用于样品采集的 2 mL 灭菌管。</li>
	<li>采集新鲜粪便样品时，将每只小鼠放入固定器中，直接从肛门收集粪便颗粒至采集管中。 
	注意：也可将小鼠置于洁净的灭菌笼中，使用洁净灭菌的镊子收集粪便样品。</li>
	<li>采用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱臼。</li>
	<li>将小鼠尸体仰卧放置，充分暴露腹部，并用 70% 乙醇喷洒腹部区域。</li>
	<li>使用灭菌镊子和剪刀，在腹部做横向切口以暴露腹膜，注意不要损伤任何内部组织。提起腹膜并剪开，以暴露肠道。</li>
	<li>用镊子和剪刀取出从结肠至胃的整个肠道，并将其置于无菌培养皿中。</li>
	<li>小心使用镊子将小肠（SI）从肠系膜动脉和脂肪组织中分离出来。拉直肠道并放置在干净的实验纸巾上。</li>
	<li>使用直尺测量并剪取小肠远端回肠的 4 cm 部分（最靠近盲肠的部分）。剪除靠近盲肠近端的 1 cm 肠段并弃去。剩余的 3 cm 回肠段将用于收集肠道细菌。</li>
	<li>将回肠段（3 cm）置于 2 mL 无菌管上方，通过直接挤压肠道内容物的方式收集样品至管中。该样品将含有来自回肠内容物的细菌。</li>
	<li>使用装有冷磷酸盐缓冲液（PBS）的 20 mL 注射器冲洗回肠段（弃去冲洗液）。</li>
	<li>将回肠段放置在干净的纸巾上&#160;，并用剪刀沿纵轴剪开。</li>
	<li>用手术刀刮取回肠壁内侧。</li>
	<li>通过在干净的离心管上方用 1 mL PBS 冲洗手术刀，收集刀上的细菌。在 8,000 × g 条件下离心 5 分钟以沉淀细菌，弃去上清液。该样品将含有来自回肠壁的细菌。 
	注意：来自粪便、回肠内容物及肠壁的样品可冷冻并保存于 -80 °C，直至使用。</li>
	<li>称量含有粪便和回肠内容物样品的试管重量，减去空管重量（步骤 2.1 中的重量），以获得每个样品的粪便重量。</li>
	<li>使用市售试剂盒提取粪便、回肠内容物和回肠壁样品中的细菌 DNA。将 DNA 样品储存于 -20 °C，直至使用。</li>
</ol>
3. 通过qPCR定量肠道微生物群
注意：本步骤包括标准品的制备（步骤 3.1）以及标准品和粪便样本的 qPCR 反应体系设置方法（步骤 3.2）
<ol>
	<li>qPCR标准品的制备
	<ol>
		<li>使用聚合酶链式反应（PCR）扩增从细菌培养物中提取的基因组DNA中的16S rRNA基因，所用试剂包括13 以及详细的PCR条件 表1.</li>
		<li>在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，并使用市售DNA提取试剂盒纯化DNA条带。</li>
		<li>使用克隆试剂盒连接纯化的DNA片段（参见 材料表，使用含有抗生素抗性标记和β-半乳糖苷酶的载体LacZ) 基因融合用于蓝白斑筛选）并转化 DH10 感受态细胞 E. coli 按照制造商说明进行操作。将转化产物接种于含氨苄青霉素（100 µg/mL）、X-gal（20 µg/mL）的LB（Luria Bertani）琼脂平板（10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L 琼脂）上。37 °C 过夜（O/N）培养。</li>
		<li>从平板上挑选一个单个的阳性（白色）菌落，接种于含有100 µg/mL氨苄青霉素的5 mL LB液体培养基中，于37 °C、250 rpm振荡培养过夜。</li>
		<li>从过夜培养物中，使用商品化的质粒小提试剂盒，按照生产商说明书提取并纯化质粒。 
		注意：在此阶段对质粒插入片段进行测序非常重要，以确保质粒仅包含一个拷贝的16S rRNA基因，并确定其长度（以碱基对，bp为单位）。</li>
		<li>使用一种仅在质粒上切割一次的限制性内切酶将质粒线性化。</li>
		<li>使用市售试剂盒纯化线性化质粒。</li>
		<li>使用分光光度计在260 nm处测量吸光度以确定质粒的浓度。</li>
		<li>使用以下公式计算样品中质粒拷贝数/µL14: 
		拷贝数 = (量 * 6.022 × 1023) / (长度 * 1 × 109 * 650) 
		其中 量 是步骤 3.1.8 中获得的 DNA 浓度（单位：ng/µL）；以及 长度 是质粒（含插入片段）的总长度，单位为 bp。该 拷贝数 将获得拷贝数/µL。 
		注意：已有基于上述公式的在线工具，可方便地计算质粒拷贝数。</li>
		<li>根据需要将标准品分装，并于 -20 °C 保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标准样本与粪便样本的qPCR设置
	<ol>
		<li>将qPCR标准品（来自步骤3.1.10）、粪便样本DNA（来自步骤2.15）和qPCR试剂（来自商业试剂盒）置于冰上解冻。 
		注意：本示例中使用的qPCR试剂包括SYBR Green qPCR反应混合液以及正向和反向引物（表2).</li>
		<li>用无菌无DNA的水将标准品稀释至10的范围内7 至 102 拷贝数/µL (例如， 从10开始的1/5倍比稀释7 至 6.4 × 102 拷贝数/µL）。将粪便样本DNA稀释至1/2、1/5、1/10.</li>
		<li>配制总反应数加1个的主混合液表2).</li>
		<li>将30 µL的预混液与5 µL的模板（标准品、样品或用于阴性对照的水）混合</li>
		<li>向384孔光学qPCR板的每个孔中加入10 µL该混合液。每个反应设三个复孔。</li>
		<li>封好qPCR板，短暂离心后将板放入已预设以下扩增程序的qPCR仪中：95 °C 预变性20 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C 变性15 s，60 °C 退火延伸1 min。</li>
		<li>获取 CT 标准品与样品的数值。</li>
		<li>通过绘制C值的标准曲线来生成标准曲线T 标准品的值相对于质粒拷贝数的对数值（按步骤3.1.9计算）作图，对标准曲线进行线性回归分析。</li>
		<li>通过插值法计算粪便样本的16S rDNA拷贝数T 标准曲线中的数值（在步骤 3.2.2 中获得） 
		注意：应根据样本的稀释倍数（按步骤3.2.2制备）、洗脱的核酸最终体积（步骤2.15）以及粪便样本量（步骤2.14计算）对每个样本的16S rDNA拷贝数进行校正，以获得每克粪便中的基因拷贝数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了对小鼠口服给予抗生素以及通过qPCR定量粪便细菌的实验方案。本方案中使用的抗生素组合（包含氨苄青霉素、庆大霉素、新霉素、甲硝唑和万古霉素）可靶向革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，对全谱细菌具有杀菌活性。无论是灌胃给药还是将抗生素加入饮水中给予，均可显著降低粪便中的细菌载量5,6,12。此外，这两种处理均会显著影响小鼠的表型，使其表现出多种无菌小鼠的典型特征，例如脾脏缩小和盲肠扩大。选择何种抗生素给药方式可能取决于实验持续时间，因为灌胃法需要每日给药，长期来看劳动强度较大，且可能对动物造成更多不适。
在通过饮水给予抗生素时，向抗生素混合物中添加甜味剂需格外谨慎，因为这是防止小鼠脱水的关键因素。已有多个研究小组表明，若通过饮水给予抗生素但不添加甜味剂，会导致小鼠出现极为严重且迅速的体重下降，所有小鼠在实验最初几天内体重均减少超过初始体重的20%5,6。在我们的实验方案中，使用基于糖精的甜味剂似乎足以掩盖水中抗生素的苦味；小鼠在给予抗生素后的最初几天内体重有所下降，但随后迅速恢复（图1）。尽管如此，在我们的实验中仍有5%-10%的小鼠达到需实施人道终点的标准，即体重下降超过基础体重的&#62;20%，这些小鼠需被实施安乐死。我们还测试了基于三氯蔗糖的甜味剂，但其完全无法防止小鼠脱水（100%的小鼠体重下降超过&#62;20%）；其他研究人员也曾报道基于阿斯巴甜的甜味剂存在类似失败情况5,6。此外，实验所用小鼠的年龄、遗传背景及其总体健康状况也应予以考虑，因为这些因素可能影响抗生素治疗期间的体重下降程度和动物福利。因此，在口服抗生素给药的前两周内，应每天密切监测小鼠的体重及总体健康状况。
qPCR 方法为粪便样本中 16S rRNA 的定量提供了一种快速且经济有效的手段。然而，该技术也存在一些局限性，需予以考虑：i）需要可靠且高质量的标准品；ii）qPCR 引物的设计及其扩增效率；iii）不同微生物的 16S rRNA 基因拷贝数可能存在差异，因此基因拷贝数未必能直接反映细胞数量15然而，qPCR 是一种稳健且灵敏的方法，可实现对粪便样本的快速分析。该方法特别适用于快速验证各种处理措施（包括抗生素）对粪便细菌载量的影响，具体细节如本文所述。此外，尽管我们提供了一种用于定量分析的方案 总计 16S rRNA，通过设计特异性引物，该方法可轻松适配16以识别特定的细菌分类单元，从而提供关于微生物组大小和组成的定量与定性信息。
综上所述，我们提供了两种小鼠口服抗生素处理的实验方案，以及一种基于qPCR的方法，用于定量分析抗生素诱导的小鼠粪便菌群变化。尽管这些方案可根据具体的实验需求进一步优化并与其他方法结合使用，但它们仍可作为快速、经济且可靠的工具，用于调控小鼠肠道微生物群，并研究抗生素治疗对肠道稳态及疾病的影响。

哺乳动物的胃肠道黏膜是一个独特的环境，定植着高度复杂的微生物群落，这些微生物与宿主建立互惠共生关系。肠道黏膜的防御系统包括上皮层和多种免疫细胞，它们在限制共生微生物局限于肠道内的同时，维持其数量和多样性。相反，共生微生物的存在对于发育出功能完整的免疫系统是必需的。尽管宿主与共生细菌之间的相互作用通常是有益的，但越来越多的研究表明，免疫系统与微生物群之间失调的相互作用可能促进慢性炎症性疾病的发生，例如炎症性肠病、关节炎或哮喘1,2。
肠道微生物群可受多种因素影响而发生改变，但最显著的变化可能由抗生素治疗引起，这种治疗会严重改变细菌群落的规模和组成3,4尽管抗生素在治疗感染方面的益处无可置疑，但人类接触抗生素所引起的微生物群变化也可能改变免疫防御功能，从而对健康产生不利影响。例如，人类使用抗生素已被证实与某些疾病风险增加相关，包括 艰难梭菌诱导的腹泻、哮喘和某些类型的癌症3抗生素处理小鼠能够重现抗生素治疗患者肠道菌群中所观察到的影响及长期改变，并使得研究微生物群落变化与免疫细胞功能之间机制性联系成为可能。然而，多份研究报告指出，通过饮水给予抗生素的方式 随意摄取 导致小鼠因水的难闻味道而拒绝饮水，从而出现明显的体重下降5,6因此，在这些模型中，口服抗生素给药伴随的严重脱水可能会干扰旨在确定抗生素治疗对免疫细胞功能影响的实验结果的解读。
有多种方法可用于研究肠道内微生物群落的规模和组成7。新一代测序技术为此提供了宝贵的数据8，但这些方法相对昂贵，且数据分析需要专业的生物信息学支持。另一方面，传统的微生物培养方法虽可检测细菌种类，但其灵敏度较低，且大量共生细菌（尤其是厌氧菌）利用现有技术难以甚至无法培养8。定量聚合酶链式反应（qPCR）技术正被 increasingly 用于粪便中细菌种类的定量与鉴定，因其能够快速、可靠地提供不依赖培养的总微生物负荷测量结果。因此，qPCR 方法已被证明在研究与年龄相关或与多种疾病（包括炎症性肠病）进展相关的微生物群变化方面具有实用价值9,10。此外，qPCR 方法为验证各种治疗手段（包括抗生素）对粪便细菌载量及微生物群组成的影响提供了一种快速且经济有效的方法10,11,12。
本文详细介绍了两种对小鼠进行口服抗生素给药、收集粪便样本、提取DNA、制备标准品以及通过qPCR定量粪便样本中细菌的独立实验方案。这些方案为调控小鼠肠道微生物群，以及研究抗生素治疗对肠道稳态和疾病影响提供了可靠的方法。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>新霉素三硫酸盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>N1876</td><td></td></tr><tr><td>甲硝唑</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>盐酸万古霉素</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>V2002</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素盐</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>甜味剂 Sweet'n Low</td><td>Sweet'N Low</td><td></td><td>可通过英国 Amazon.co.uk 购买</td></tr><tr><td>X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234923</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>超纯琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR级水</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>含 ROX</td></tr><tr><td>TOPO TA 克隆TM测序试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp 快速粪便DNA小型试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 旋转质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶&amp;nbsp;提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器 0.45 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>10460031</td><td></td></tr><tr><td>Swann-MortonTM 碳钢无菌手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>11792724</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 mL）</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>注射器（20 mL）</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 透明微量离心管</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 超高回收率微量离心管</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>口服给药针头 20 G × 38 mm 弯头（每包3个）</td><td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin 培养皿 50 mm&amp;nbsp;</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR 板密封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM 光学 384 孔板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7TM 7 实时荧光定量 PCR 系统（配备 384 孔模块）</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（Nanodrop 1000）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prism 微型离心机</td><td>Labnet</td><td>C2500</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax 梯度PCR仪</td><td>Labnet</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

口服抗生素处理后小鼠肠道微生物群的定量聚合酶链式反应分析

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

肠道微生物群对人类健康具有核心影响。微生物失衡与多种常见免疫病理状态相关，例如炎症性肠病、哮喘和关节炎。因此，阐明微生物群与免疫系统之间相互作用的机制至关重要。抗生素的使用虽然有助于清除病原体，但也会导致肠道菌群的规模和组成发生显著改变，从而影响人类健康。在小鼠中使用抗生素能够模拟经抗生素治疗患者肠道微生物群所发生的长期变化，进而有助于探究微生物群落变化与免疫细胞功能之间的机制性联系。尽管已有多种小鼠抗生素处理方法被报道，但其中一些方法会引起严重脱水和体重下降，从而增加数据解读的复杂性。本文提供了两种可用于小鼠长期口服抗生素处理的方案，且不会引起显著体重减轻。这些方案采用可同时靶向革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的多种抗生素组合，可通过以下方式给予 随意摄取 通过饮水或口服灌胃给予抗生素。此外，我们描述了一种利用qPCR定量粪便样本中微生物密度的方法，可用于验证抗生素治疗的效果。这些方法的结合为小鼠肠道微生物群的调控及抗生素治疗效应的研究提供了可靠的实验技术体系。

本文提供了两种小鼠口服抗生素治疗的替代方案。 图1 显示经抗生素处理的小鼠体重百分比（相对于每只小鼠初始基线体重），抗生素给药方式分别为连续10天口服灌胃（红色）或饮水中给药（蓝色）。通过口服灌胃给予抗生素的小鼠未见明显体重下降。然而，当小鼠通过饮水中接受抗生素处理时 随意摄取 在饮水中给予抗生素的最初几天内，小鼠体重会下降（约10%），但此后恢复正常的体重增长图1）。然而，约有5-10%接受饮水中添加抗生素的小鼠可达到 &gt;治疗第一周内体重减轻20%，此时应实施安乐死。
粪便样本中细菌的定量需要使用适当的标准曲线，该曲线通过将标准品的拷贝数对数值（按步骤 3.2.2 计算）与 qPCR 获得的 CT 值作图而得到。图 2A 展示了一条符合标准曲线性能标准的代表性标准曲线，其 R2 值为 0.99827，斜率为 -3.09，扩增效率（(-1 + 10^(-1/斜率))×100）为 110%。理想的 R2 值应达到 0.99，PCR 扩增效率应在 90% 至 110% 范围内。在标准曲线的线性范围内，回归分析方程可用于定量粪便样本中的 16S rDNA 拷贝数。图 2B 显示了粪便、小肠内容物（SI content）和小肠壁（SI wall）中的 16S rDNA 拷贝数。图 2B 中，粪便和小肠内容物的数据以每克粪便样本中的 16S rDNA 拷贝数表示；对于小肠壁，则以从 3 cm 小肠壁组织中回收的细菌所获得的 16S rDNA 总拷贝数表示（由于起始材料量过小，无法获得精确重量）。
为了评估抗生素对粪便样本中细菌密度的影响，小鼠通过每日口服灌胃的方式接受抗生素处理，持续10天（第1至第10天），并在处理前（第0天）、抗生素处理期间的不同时间点（第5天和第10天）以及停用抗生素7天后（第17天）收集粪便样本（图3A）。如图3B所示，在第5天和第10天检测到的每克粪便中16S rDNA拷贝数显著减少，表明抗生素处理显著降低了细菌数量；而在停止抗生素给药1周后（第17天），粪便中细菌密度恢复至正常水平，与处理前相当。
<img alt="口服灌胃和饮水给药的小鼠体重变化趋势（%）与时间（天）的关系；线图比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：抗生素给药方式。 小鼠通过口服灌胃（红色）或饮水（蓝色）方式接受抗生素处理，持续10天。图表显示实验期间小鼠体重相对于给药前初始体重（第0天）的变化情况。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="qPCR 标准曲线和 16S rDNA 拷贝数，图表，微生物组分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：标准品和粪便样本的 16S rRNA 基因 qPCR 扩增。（A）含标准曲线参数的标准曲线线性回归。（B）粪便样本中基因丰度的计算。数据以均值 ± 标准误表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抗生素处理时间线及17天内每克粪便中16S rDNA拷贝数的柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：抗生素处理期间的粪便细菌变化。（A）口服灌胃给予抗生素（Ab）及样品采集（以*表示）的时间安排示意图。（B）在指定天数采集的小鼠粪便样本中每克粪便的16S rDNA拷贝数。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA</td>
			<td>8 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 10X</td>
			<td>2 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10mM)</td>
			<td>0.4 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - F primer (10 mM)</td>
			<td>1 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - R primer (10 mM)</td>
			<td>1 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Polimerase</td>
			<td>0.2 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>7.4 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>20 µL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>引物序列</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - F primer</td>
			<td>5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - R primer</td>
			<td>5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>扩增循环条件</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度</td>
			<td>时间</td>
			<td>循环次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>94 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>94 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>30x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：PCR试剂与反应条件。 本表格提供了用于扩增细菌培养物中16S rRNA基因的试剂及PCR循环条件，以生成qPCR实验中所用的标准品。引物序列最初由Kruglov et al.13发表。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green master mix (2x)</td>
			<td>17.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - F 引物 (10 mM)</td>
			<td>0.7 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eubacteria - R 引物 (10 mM)</td>
			<td>0.7 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>11.1 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：qPCR预混液。 表中所示体积（终体积35 µL）适用于单个样本，在384孔qPCR板上进行三复孔检测（每孔10 µL），并额外增加5 µL以补偿移液误差。可根据待分析样本数量按比例放大试剂用量。

本文提供了小鼠口服抗生素给药、粪便样本采集、DNA 提取以及通过 qPCR 定量粪便细菌的详细实验方案。

肠道微生物群对人类健康具有核心影响。微生物失衡与许多常见的免疫病理疾病相关，例如炎症性……

本方案提供了一种可靠的方法，用于定量分析小鼠经口服抗生素处理后肠道微生物群的变化。该方法有助于研究微生物群之间的相互作用，为与菌群失调相关的病理状态（如炎症性肠病）提供见解。这些抗生素处理方案的主要优势在于，能够避免小鼠在口服抗生素后通常出现的显著体重下降。通过口服灌胃进行抗生素处理时，需制备抗生素混合液：按照技术方案中所述方法配制各抗生素储备液，然后将它们混合。配制1毫升混合液时，加入50微升氨苄青霉素、50微升庆大霉素、50微升新霉素、500微升甲硝唑、25微升万古霉素以及325微升水。将抗生素混合液吸入1毫升注射器中，排除所有气泡，并连接合适规格的灌胃针头。牢固抓住小鼠肩部上方的皮肤，并拉直头部与颈部以伸展食管。将喂食针的球形针头沿上颚顶部向咽后部推进，然后轻柔地将其送入食管，并注入200 µL溶液。在实验期间，每天给予一次抗生素混合物。作为通过饮用水给予抗生素的替代方法，按照技术方案中所述配制抗生素混合物。必须在抗生素混合物中加入甜味剂，因为这是防止小鼠脱水的关键因素。将抗生素混合液分装至水瓶中，每瓶约 100 毫升。避光保存，并放置于小鼠笼内。实验期间每周更换两次新鲜的抗生素混合液。在抗生素给药期间，应每天仔细监测小鼠的体重及总体健康状况。称重并标记2毫升的 autoclave 管用于样本采集。采集新鲜粪便样本时，将每只小鼠放入固定器中。然后用收集管直接从肛门采集粪便颗粒。按照技术方案中所述实施安乐死后，将小鼠尸体腹部完全暴露朝上放置，并用70%乙醇喷洒腹部区域。使用灭菌的镊子和剪刀在腹部做横向切口，暴露腹膜，注意不要损伤任何内部组织。提起腹膜，做切口以暴露肠管。用镊子和剪刀取出肠管，并置于无菌的培养皿中。小心使用镊子将小肠从肠系膜动脉和脂肪组织中分离出来。将肠道拉直并放置在干净的实验纸巾上。使用直尺测量，并截取小肠远端回肠的四厘米肠段。剪除并丢弃靠近盲肠端近端的一厘米肠段。将保留一段3厘米长的回肠用于收集肠道细菌。将回肠部分置于一个2毫升无菌管上方，通过直接挤压肠管内容物，将样本收集到管中。该样本将含有来自回肠内容物的细菌。用一个装有冷磷酸盐缓冲液的20毫升注射器冲洗回肠段，弃去冲洗液。将回肠段置于无菌培养皿中，并用剪刀沿纵轴剪开。用手术刀刮取回肠壁内侧。用一毫升磷酸盐缓冲液冲洗手术刀，并将冲洗液收集到干净的离心管中，以获取手术刀上的细菌。在八千倍重力下离心五分钟，使细菌沉淀。离心后弃去上清液。此样品将含有来自回肠壁的细菌。称量含有粪便和回肠样品的离心管。用空管重量减去样品总重量，计算出每个样品的粪便重量。使用市售试剂盒从粪便、回肠内容物和回肠壁样品中提取细菌DNA。将DNA样品于-20°C保存，直至使用。将商用 qPCR 标准品、粪便样本 DNA 及 qPCR 试剂在冰上解冻。用无菌无 DNA 水将标准品稀释至每微升 10⁷ 到 10² 拷贝的浓度范围。将粪便样本 DNA 稀释至二分之一、五分之一和十分之一浓度。然后为总反应数加一个反应配制总反应混合液。将30微升总反应混合液与5微升模板（标准品、样品或用于阴性对照的水）混合。随后将10微升该混合液加入384孔光学qPCR板的每个孔中。每个反应设三个重复。密封qPCR板后短暂离心，然后将板放入已按照技术方案中所列程序设定好的qPCR仪中。最后获取标准品和样品的循环阈值，然后计算粪便样品的16S rDNA拷贝数。代表性结果表明，通过灌胃或饮水给予抗生素后，小鼠出现体重下降。通过灌胃给予抗生素的小鼠未检测到明显的体重下降。当小鼠在饮水中接受抗生素处理时，它们在治疗最初几天内会失去约10%的体重，但随后恢复正常的体重增长。对粪便样本中细菌数量的定量需要使用标准曲线，该曲线通过将标准品的拷贝数对数值与其在qPCR中获得的C-T值进行绘图而得到。在标准曲线的线性范围内，回归分析方程可用于定量粪便样本中16S rDNA的丰度。如图所示，针对粪便、小肠内容物和小肠壁样本。在口服抗生素处理5天或10天后，经抗生素处理小鼠的粪便样本中细菌密度显著下降。然而，在停止抗生素给药一周后，粪便中细菌密度恢复至正常水平。口服灌胃和饮水中给予抗生素均可短暂降低处理小鼠的粪便细菌载量。研究人员可根据实验需求（例如处理时间长短等因素）选择更适合的给药方法。用于细菌定量的qPCR方法可通过使用特异性引物进行修改，以定量特定的细菌分类群。这将提供关于微生物组大小和组成的定量与定性信息。

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科研

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Immunology and Infection

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