用于评估鼻腔至脑部药物递送的吸入麻醉下鼻内给药新方法
2018年11月14日
本文介绍了两种在吸入麻醉下对实验动物进行稳定经鼻给药的新方法，这些方法可最大限度地减少动物的生理应激。同时，我们还描述了一种利用放射性标记的[14C]-菊粉（一种水溶性大分子的模型底物）通过鼻-脑通路定量评估药物在脑内分布水平的方法。
该方法有助于解答药物科学领域中关于药物经鼻给药、药代动力学及药理学方面的关键问题。该技术的主要优势在于，可在对动物造成最小应激的情况下，用于定量评估经鼻入脑递送的候选药物以及吸入麻醉剂。该技术的应用前景广泛，尤其在中枢神经系统疾病的治疗方面，因其有助于推动经鼻入脑药物递送技术的发展。
演示该实验操作的是我实验室的博士生 Mitsuyoshi Fukuda。在独立的放射性同位素实验室内，通过移液器进行鼻内给药。将小鼠仰卧位固定于软木板上并用胶带固定，随后以每侧鼻孔1至2微升的剂量，交替向小鼠左右鼻孔给予总计25微升的碳-14标记的菊粉溶液。
对于从气道侧经食管进行逆行插管给药，将麻醉后的小鼠置于解剖显微镜下，在喉部区域做一条1.5厘米长的皮肤切口。使用镊子扩大切口，直至暴露气管，然后在暴露的气管上做一处1毫米的切口。将导管插入切口，深入至预先标记的1.2厘米位置，并将导管的另一端连接至吸入式面罩内部。
此后，用镊子从气管下方暴露食管。使用剪刀在食管上做一个1毫米的切口，并将第二根导管插入至预先标记的位置，向鼻腔后端推进1.4厘米。根据实验动物的体重将导管插入适当长度至关重要，并需据此调整其他动物中导管的插入长度。
结扎食管插管，并将27号针头连接至装有给药溶液的1毫升注射器，该注射器与可编程微量注射泵相连。随后以每分钟5微升的恒定速率注入25微升碳-14标记的菊粉，直至全部溶液体积给药完毕。缓慢但恒定的扩散速率对于尽可能保留更多药物溶液在鼻腔内至关重要。
为了定量测定给予菊粉后30分钟穿过血脑屏障的碳-14标记菊粉的量，使用剪刀从延髓侧小心打开每只实验处理动物的颅骨，并用微型刮勺小心取出脑组织。每取出一个脑组织，立即将其置于冰上培养皿中浸有生理盐水的滤纸上。并用浸有生理盐水的棉签清洁每个脑组织表面的血液。
接下来，迅速但小心地将脑组织分离为嗅球、大脑、延髓以及脑桥部分。将脑组织样本置于组织溶解液中，在50摄氏度下孵育1小时，随后加入10微升液体闪烁液。为测定给药溶液的放射性，取25微升给药溶液（溶于闪烁液中）转移至闪烁瓶，使用液体闪烁计数器测量脑组织样本及给药溶液中碳-14放射性的每分钟衰变数（dpm）。
在吸入麻醉条件下，经鼻给药的动物之间未观察到实验个体间差异。当采用食管反向插管鼻腔给药法时，嗅球、大脑和延髓中的碳-14标记菊粉水平显著高于微量移液器给药法。此外，在嗅球和延髓中检测到更高水平的碳-14标记菊粉，这两个脑区在鼻脑通路中具有显著的进化特征，其含量高于大脑。
该技术问世后，为鼻脑递送领域的研究人员探索大分子治疗药物在中枢神经系统中的生物活性开辟了道路。
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概述
本文介绍了两种用于吸入麻醉下稳定经鼻给药的新方法，旨在最大限度地减少实验动物的生理应激。此外，还提出了一种利用放射性标记的[14C]-肌酐通过鼻-脑通路定量评估药物在脑内分布的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 药学科学
- 药物递送系统
- 神经科学
背景
- 鼻内给药是一种有前景的向中枢神经系统递送药物的途径。
- 在实验过程中尽量减少动物应激对于伦理研究实践至关重要。
- 对药物分布进行定量评估有助于深入理解药代动力学。
- 放射性标记化合物可作为研究药物递送机制的有效模型。
研究目的
- 建立稳定的经鼻给药方法。
- 评估通过鼻-脑通路给药的有效性。
- 尽量减少实验操作过程中对实验动物造成的生理应激。
使用的方法
- 通过微量移液器给予碳-14标记的菊粉溶液。
- 使用吸入麻醉以减少小鼠的应激反应。
- 将小鼠仰卧固定于软木板上以保持稳定。
- 交替向右侧和左侧鼻孔给予药物剂量。
主要结果
- 以对动物最小应激的方式成功给药。
- 实现对药物分布水平的定量评估。
- 验证鼻-脑递送方法的有效性。
- 在治疗中枢神经系统疾病方面具有潜在应用价值。
结论
- 所开发的方法为鼻内给药提供了一种可靠的途径。
- 这些技术可推动药理学和药物递送系统领域的研究进展。
- 未来的研究可能会探索其在中枢神经系统治疗中的更广泛应用。
常见问题
行业应用价值
建立可靠的鼻脑递送模型对于绕过血脑屏障、降低靶向中枢神经系统治疗药物的风险至关重要。在受控条件下对大分子转运进行定量评估，可提高候选药物评价的预测可信度。这些方法通过从轻度应激的动物模型中获得可重复的药代动力学数据，支持早期药物发现决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：利用放射性标记示踪剂定量分析，可验证大分子治疗药物经鼻入脑转运假说。
- 操作价值：在吸入麻醉条件下进行标准化给药，以降低实验变异度，提高研究间的可重复性。
- 预测价值：提供嗅球、大脑和延髓中的定量脑分布数据，支持靶点结合及通路验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过注射泵或微量移液器实现稳定的经鼻给药，确保化合物暴露的一致性，适用于筛选实验。
- 操作价值：通过控制给药速率并结合脑区解剖，支持检测方法的标准化，实现精确的检测结果。
- 可扩展性价值：通过调整导管长度和输注参数以适应动物体重及鼻腔解剖结构，可在不同药物候选物研究中重复使用该平台。
转化与临床前研究
- 科学价值：能够评估大分子药物经鼻至脑递送的效率，为转化生物标志物与中枢神经系统暴露量的一致性提供依据。
- 操作价值：通过反向插管减少黏膜纤毛清除效应，提高药物在鼻腔的滞留时间，增强脑组织中的信号检测能力。
- 风险控制：通过提升递送的可靠性和定量敏感性，降低临床前模型中假阴性结果的发生风险。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物发现直至临床前评价的整个发现流程，可提供定量的鼻腔至脑部递送数据，为决策提供依据。
- 发现生物学：通过区域特异性放射性测量，支持鼻腔转运机制的假设验证与通路阐明。
- 筛选：通过标准化、低应激的给药方式和示踪剂分布的定量检测，实现高通量筛选的实验准备。
- 分析：通过液体闪烁计数生成每分钟衰变数（DPM）读数，用于比较不同脑区及给药方式。
- 转化研究：通过量化与中枢神经系统药物靶向相关的生物大分子转运，实现从发现研究到临床前研究的衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的评估能力，通过基于套管、适配吸入麻醉的给药方式，评估多种候选药物。
运营与企业影响
- 科学价值：通过量化示踪剂在鼻脑通路关键脑区的蓄积，提高鼻脑递送预测的可信度。
- 操作价值：通过标准化的麻醉、体位固定和输注速率控制，增强实验的可重复性与标准化水平。
- 战略价值：通过降低中枢神经系统递送潜力中的机制不确定性，优化“推进/终止”决策判断。
- 项目影响：基于定量的脑暴露数据，实现候选药物的风险校正优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备啮齿类动物手术、麻醉管理和放射性示踪剂操作的专业知识。
- 依赖于解剖显微镜、微量注射泵、闪烁计数器以及放射性同位素设施的可及性。
- 需要在团队间对套管插入深度、切口大小和脑组织解剖方案进行标准化。
- 在设定套管长度时，需考虑动物体重和鼻腔尺寸差异带来的适应性调整。
- 实际限制包括反向套管手术的侵入性，以及为保持操作一致性所需的专门培训。
