Name: 通过 iscat 显微镜对活细胞分泌的单一蛋白质进行无标签成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习使用干涉散射显微镜对活细胞分泌的单一蛋白质进行无标签实时成像技术。该方法可应用于多种生物系统，为分子水平研究提供强大工具。

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本工作由马克斯·普朗克学会、亚历山大·冯·洪堡讲席教授职位以及德国研究基金会（CRC 1181）资助。我们感谢埃尔朗根大学医院的Stefanie Schaffer提供Laz388细胞并进行有益的讨论。我们感谢马克斯·普朗克研究所的Simone Ihloff和Maksim Schwab提供技术支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

获得有用iSCAT数据最关键的方面之一，是能够找到盖玻片表面的正确焦平面，并且在长时间内保持该位置。若无法做到这一点，将导致点扩散函数（PSF）变宽、iSCAT信号减弱，以及在动力学分析中出现与漂移相关的伪影。事实上，在洁净、裸露的盖玻片表面上确定焦平面并非易事，因为表面特征在强参考光束背景之下无法被观察到（见图4d）。
原始的iSCAT图像常受到来自激发光源波前畸变的背景信号干扰，这可能会妨碍确定正确的成像平面。主动波前扣除是一种有效解决此问题并在测量过程中持续监控iSCAT焦点的方法16。其中一种实现方式是通过空间样品调制。简而言之，函数发生器向压电载物台的外部控制端口施加一个50 Hz的方波信号，从而在样品上产生相应频率的空间调制（振幅为290 nm）。相机同步触发采集，并利用锁相原理对采集到的图像进行组合，最终获得经波前补偿的图像14,16。所得图像通常显示盖玻片的表面粗糙度（图4e）。玻璃表面清洁后残留的微小结构可用于辅助显微镜聚焦。该主动背景扣除步骤所使用的参数可根据帧率、曝光时间或硬件条件进行调整。
如上所述，建议在iSCAT装置（步骤1.2.1）中使用高质量的分束器，因为由薄平面分束器引起的成像伪影（如重影或干涉）会影响图像并干扰测量。图7展示了高质量与低质量分束器之间的对比。两张原始iSCAT图像均显示盖玻片上含有少量残留颗粒的相同区域。两幅图像使用相同的iSCAT装置采集，仅更换了分束器。图7a显示的是使用较厚（5 mm）、带抗反射涂层且呈楔形设计的分束器时，相机所捕获的图像。由于楔形结构，分束器背面反射的光束与前表面反射光束呈反平行，不会进入物镜，因此不会产生干涉伪影。图7b显示的是样品相同视野，但此次使用的是较薄（1 mm）的平面分束器。来自分束器前表面和后表面的两束反射光相互平行，并共同传播至相机，干涉伪影清晰可见。
<img alt="用于样本分析的光学显微镜图像及荧光计数比较示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：使用高质量与低质量分束器所获得的iSCAT图像的比较。 (a) 使用5 mm厚、带抗反射涂层且具有楔形设计的分束器所获得的原始iSCAT图像。 (b) 使用1 mm厚平面分束器对同一区域获得的原始iSCAT图像。两种分束器具有相同的分光比（50%反射，50%透射）。在使用1 mm厚平面分束器所获得的图像中，可明显观察到由菲涅尔反射引起的干涉伪影。比例尺：2 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在本方案中，我们描述了一种用于iSCAT的宽场照明方案，因其速度快、易于实现，并可在大面积上实现并行检测14。另一种常用方法是使用声光偏转器（AODs），将共焦光束扫描穿过样品12,17。该方法无需高质量的波前，但实验复杂度高于传统的宽场成像。此外，共焦照明的速度受限于AODs的响应速度。根据所需的实验参数，原则上可采用共焦或宽场照明方案来检测活细胞分泌的单个蛋白质。
如本方案所述，必须尽量减少显微镜样品台的横向机械波动。即使样品位置发生纳米级的偏移，也可能导致连续相机帧之间的变化，并在差分图像中引入显著的额外噪声。因此，建议使用机械稳定性良好的显微镜载物台和带阻尼的光学平台（步骤 1.1.1），并在实验过程中用光学遮光帘或遮光板覆盖整个装置（步骤 3.5）。
对于长期测量，也可考虑采用主动聚焦稳定方案。该方案将第二束激光以全内反射（TIR）方式引入显微镜，并成像至一个四象限光电二极管上。系统焦距的变化会转化为TIR激光光斑在四象限二极管上的横向位移，该位移信号可用于主动反馈回路，以控制压电载物台的z轴位置26。由此可消除长期的垂直漂移效应。
可根据特定的实验需求，对上述技术进行多种修改和扩展。例如，可采用商用的显微镜载物台培养箱，并将其轻松整合到iSCAT显微镜中，以实现对细胞的长期成像。此外，还可结合其他技术以补充iSCAT成像，如共聚焦显微镜或全内反射荧光显微镜17。为适应所研究的体系，iSCAT分泌测量可在其他细胞培养基中进行，例如DMEM或DPBS，但应避免使用酚红pH指示剂，因其可能因吸收激光而干扰实验。此外，诸如胎牛血清（FCS）或人血小板裂解物（hPL）等添加剂含有可干扰iSCAT检测的蛋白质。根据实验所需的灵敏度，这些添加剂应从显微成像介质中去除。
iSCAT 依赖于分析物散射光的能力——这是所有蛋白质固有的特性，因此本质上是非特异性的。然而，由于 iSCAT 信号与蛋白质质量呈线性关系，仍可在一定程度上实现特异性14,27,28。这使得可以使用标准蛋白质样品（如牛血清白蛋白（BSA）和纤维蛋白原）对 iSCAT 系统进行校准14,27,28。事实上，最近 Young et al.28 在 Piliarik 与 Sandoghdar14 的工作基础上进一步证明，iSCAT 可用于测定小至链霉亲和素（53 kDa）的蛋白质的分子量，质量分辨率达 19 kDa，准确度约为 5 kDa。若干常规方法可通过提供额外的特异性来进一步补充 iSCAT。例如，酶联免疫吸附测定（ELISA）和/或其他表面修饰可限制蛋白质结合事件，从而仅检测目标蛋白质16。
在本实验方案中，我们描述了如何利用干涉散射显微镜（iSCAT）以亚秒级时间分辨率在单蛋白水平上研究细胞分泌物16。该技术具有普适性，可在任何商用或自行搭建的显微镜系统上实现。与单分子荧光方法相比，该方法不受光漂白或闪烁效应的影响，同时仍具备单蛋白检测灵敏度。这些特性使iSCAT成为生物传感与显微成像领域中一种强大的工具。未来的研究应用将聚焦于揭示复杂的细胞相互作用，例如细胞对刺激的免疫应答或细胞间通讯过程。

分泌蛋白在多种生理过程中发挥着重要作用1因此，它们通常被作为整体组分（蛋白质组学）或作为单个实体进行研究2,3蛋白质组学传统上通过研究特定生物系统中存在的全套蛋白质来开展工作 例如， 酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术或质谱分析4,5,6单个蛋白质的检测通常采用基于荧光的各种技术7,8，等离激元学9,10，或低温电子显微镜11 显微技术。所有这些技术都使用复杂的仪器、标记物或二者兼有，且通常缺乏动态信息，因为它们仅能提供关于所研究系统的长期信息。
此处我们使用 iSCAT12,13 利用显微镜以亚秒级时间分辨率检测单个分泌蛋白14重要的是，该技术能够检测到每种蛋白质固有的微弱散射信号12,14小生物颗粒散射的光量与其极化率成正比。假设蛋白质的形状可近似为一个有效散射球体14,15,16，且不同蛋白质的折射率非常相似，因此测得的信号可直接与蛋白质的分子量（MW）相关联。iSCAT对比度的经验校准 与 通过参照测量分子量，可以区分不同大小的蛋白质。iSCAT实验可 easily 与荧光显微镜技术结合使用。17,18免疫吸附试剂，以及荧光或散射标记，以实现对任何目标蛋白的特异性检测14,17,19.
原则上，iSCAT 通过将蛋白质微弱的散射光与一个二次参考光波进行干涉混合来实现信号放大。iSCAT 显微镜中检测到的强度（<img alt="静态平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；用于说明力平衡概念。" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">）可由以下公式描述：
<img alt="用于干涉分析的光强方程示意图，包含相关变量。" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">
其中，<img alt="静态平衡方程 ΣFx=0 示意图；力矢量分析、平衡、物理教学" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3"> 为入射光强，<img alt="用于DNA分离的光谱学装置，结合色谱法；包含 MA=0 方程；示意图" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4"> 为参考波贡献的系数，<img alt="静态平衡 ΣFx=0 示意图；包含力、力矩和矢量分析，用于教学目的" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 5"> 表示所研究纳米物体的散射强度，<img alt="静态平衡，ΣFx=0 公式、方程、物理概念、平衡分析、力计算" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 6"> 为散射波与参考波之间的相位差14。通常使用透射光或后向反射的入射光作为参考波，在这两种情况下，<img alt="静态平衡示意图，ΣFx=0，MA=0，说明力的平衡，物理教学概念" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 7"> 分别表示样品室的透射率或反射率。项 <img alt="静态平衡；ΣFx=0，MA=0；力平衡示意图；关键物理教学资源" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 8"> 与蛋白质的散射截面成正比，相较于交叉项可忽略不计。因此，令 <img alt="φ=π 数学方程符号，表示几何或物理概念中的角度" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 9"> 实现完全相消干涉，探测到的光强为 <img alt="静态平衡方程：I_det ≅ I_i(r² - 2rs)；用于物理中的力分析公式" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 10">，其中 <img alt="光学中平方反比定律的方程，符号：r²Ii = Iref" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 11"> 为参考光强，<img alt="静态平衡方程；公式 ΣFx=0；含平衡概念的示意图" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 12"> 为干涉光强。
iSCAT 显微镜技术为在单分子水平上研究生物过程提供了一种极为优秀的方法。例如，我们研究了 Laz388 细胞——一种 Epstein-Barr 病毒（EBV）转化的 B 淋巴细胞系20,21——在分泌 IgG 抗体等蛋白质时的动态过程16。然而，该方法具有普适性，可应用于多种其他生物系统。iSCAT 本质上不具有特异性，能够检测任何蛋白质或纳米颗粒，也可通过常见的表面功能化方法进行扩展，以实现特异性或多重检测。其操作简便，并可与其他光学技术（如荧光显微镜）联用，使 iSCAT 成为细胞生物学中一种有价值的互补工具。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;物品/设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x / 1.46 NA 物镜</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td>alpha Plan Apochromat 油浸</td></tr><tr><td>20x / 0.4 NA 物镜</td><td>Leica</td><td>566049</td><td>N Plan</td></tr><tr><td>压电载物台</td><td>PI</td><td>P-517k020</td><td>三轴载物台，行程范围为 100×100×10&amp;micro;m</td></tr><tr><td>二极管激光器（445 nm）</td><td>Lasertack</td><td>PD-01236</td><td></td></tr><tr><td>光学元件/光机械元件</td><td>Thorlabs/Newport</td><td>-</td><td>透镜、反射镜、支架、安装座</td></tr><tr><td>针孔</td><td>Thorlabs</td><td>P30H</td><td></td></tr><tr><td>LED 光源</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL5</td><td></td></tr><tr><td>短通滤光片（580 nm）</td><td>Omega Optical</td><td>580SP</td><td>用于调节 LED 光谱以实现荧光激发</td></tr><tr><td>长通滤光片（500 nm）</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0500</td><td>用于调节 LED 光谱以实现荧光激发</td></tr><tr><td>70R/30T 分束器</td><td>Newport</td><td>20Q20BS.1</td><td></td></tr><tr><td>经济型分束器</td><td>Thorlabs</td><td>EBS1</td><td>用于条纹效应的比较</td></tr><tr><td>楔形板分束器</td><td>Thorlabs</td><td>BSW26</td><td>用于条纹效应的比较</td></tr><tr><td>短通二向色镜（550 nm）</td><td>Edmund Optics</td><td>66249</td><td></td></tr><tr><td>8R/92T 分束器</td><td>Thorlabs</td><td>BP108</td><td></td></tr><tr><td>CMOS 相机</td><td>Photonfocus</td><td>MV1-D1024E-160-CL</td><td>用于 iSCAT 采集</td></tr><tr><td>CMOS 相机</td><td>Mightex</td><td>SCE-B013-U</td><td>用于明场/荧光采集</td></tr><tr><td>长通滤光片（600 nm）</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0600</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>Fujitsu Siemens&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Core i7 处理器，16 GB 内存，固态硬盘</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>LabVIEW</td><td>-</td><td>LabVIEW 2016 套件</td></tr><tr><td>分析软件</td><td>Matlab</td><td>-</td><td>Matlab 2014 套件</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Diener</td><td>Diener pico</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Binder</td><td>Model CB</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td>不含酚红</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液（1M）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59205C</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>107052</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td>F8821</td><td>用于校准</td></tr><tr><td>Immersol 浸油</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶染色剂</td><td>Invitrogen</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>小型移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>30075005</td><td></td></tr><tr><td>柔性移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，99.8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>用于配制 0.2M NaOH 溶液</td></tr></tbody></table>

通过iscat显微镜对活细胞分泌的单个蛋白质进行无标记成像

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

我们演示了干涉散射（iSCAT）显微技术，该方法能够实时检测单个活细胞分泌的未标记单个蛋白质。在本方案中，我们涵盖了构建iSCAT显微镜所需的基本步骤，并增加了额外的成像通道，以监测受研究细胞的活力。随后，我们利用该方法实时检测活细胞分泌的单个蛋白质，并以永生化B细胞系（Laz388）为例进行展示。文中还讨论了显微镜与样品制备以及记录数据的分析所涉及的必要步骤。视频方案表明，iSCAT显微技术为在单分子水平上研究分泌过程提供了一种简便的方法。

iSCAT 显微镜的示意图如图4a所示。图4b、4c和4d分别为典型的明场、荧光和原始iSCAT图像16。图4e和4f展示了背景去除和差分后处理的结果；在图4f中，两个吸附的蛋白质以衍射极限的光斑形式可见。图6显示了在125秒内检测到的蛋白质数量分布直方图。这些数据通过对采集的图像应用峰值搜索算法，统计结合事件并记录其对比度而获得16。共检测到503个蛋白质。
接下来，通过与纯化蛋白质溶液的参考测量结果进行比较，或通过在功能化玻璃表面进行额外测量，来鉴定分泌的物质。14,16因此，iSCAT 数据能够在亚秒尺度上直接可视化细胞分泌动力学16例如，我们先前发现，IgG 抗体是 Laz388 分泌组的主要成分，其释放速率为每秒约 100 个分子。16此外，细胞还会分泌其他分子量范围在100 kDa - 1000 kDa的颗粒16所述方法可进一步应用 例如， 研究细胞周围分泌物的空间浓度梯度16，或确定细胞裂解的时间动力学16.
<img alt="显示对比度分布计数的直方图、数据分析、统计图表、科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：单个Laz388细胞分泌蛋白的定量分析。 该直方图显示了在125秒时间范围内检测到的蛋白质。对比度值被累积在宽度为1 × 10-4 的对比度区间内（蓝色柱状图）。在此项测量中，共计数到503个单独的蛋白质分子。该实验重复了10次，结果相似。本图改编自McDonald, M.P. et al.16。版权所有 2018 美国化学会。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们提出了一种实时光学检测单个未标记蛋白质从活细胞分泌过程的实验方案。该方法基于干涉散射（iSCAT）显微技术，可应用于多种不同的生物系统和实验构型。

通过iSCAT显微镜对活细胞分泌的单个蛋白质进行无标记成像

我们展示了干涉散射（iSCAT）显微技术，该方法能够检测单个活细胞分泌的单个未标记蛋白质……

我们首次提出iSCAT技术是在2004年，当时用于金纳米颗粒的检测与光谱分析。在随后的10年中，我们进一步发展了该技术，用于病毒和小分子蛋白质等生物纳米颗粒的检测与追踪。该技术的核心原理在于，任何物质实体，无论其尺寸多么微小，都具有有限的消光截面。该技术的主要优势在于无需标记的检测方式。这意味着，只要灵敏度足够高，我们几乎可以检测任何物质，例如单个细胞分泌的蛋白质或外泌体。需要注意的问题是如何处理散射背景。iSCAT显微镜的一个显著优势是它可以完全自主搭建，并且能够附加到现有的商用显微镜上。这意味着它可以轻松地与其他光学技术（如荧光技术）结合使用，这也是目前许多研究团队开始采用iSCAT及相关技术的原因之一。在此，我们利用LUZ细胞作为模型系统，展示对单个分泌蛋白的检测。然而，该方法也可用于在分子水平上探究几乎任何生物学过程。为了获得稳定的显微镜系统，首先应使用带有减震功能的光学平台以及用于样品台的刚性厚重基座。构建一个显微镜样品台，其中包含高数值孔径物镜，以及一个可实现样品横向移动和调节物镜焦平面位置的平移装置。使用一个45度垂直耦合镜和一个焦距为50厘米的单透镜，将波长为445纳米的半导体激光器的光聚焦到物镜的后焦平面上。该宽场透镜会在物镜的前焦面产生一束准直光，作为iSCAT照明光源。在物镜上滴加一滴浸油，并在显微镜载物台的样品平面上放置一块玻璃盖玻片。这将导致光束经成像物镜反射向下传播。为了设置成像光路，在宽场透镜后约10厘米处，以相对于入射光束45度角的位置引入一个带有抗反射涂层的分光镜。确保抗反射涂层朝向激光光源。请注意，较厚的分束镜会引入显著的光束位移，可能导致激光无法再沿直线进入物镜。如有必要，在分束镜前重新调整激光光路，以确保光束能正确通过物镜。为确保样品平面与相机处于齐焦状态，首先在照明光路中宽场透镜后5厘米处放置一个焦距为-45厘米的凹透镜。这将使一束准直光进入物镜的后光瞳。将屏幕放置在干涉仪的反射臂中，沿垂直方向移动物镜以找到粗略的焦平面位置。当照射到屏幕上的光束为准直光时，物镜即处于焦点位置。粗调完成后，取下负焦距透镜和屏幕。添加第二个焦距为50厘米的单片透镜，以聚焦散射光并准直反射光。确保该透镜放置在物镜后焦平面50厘米处，从而使透射的激光束再次被准直。为完成iSCAT装置的组装，将CMOS相机放置在距离50厘米焦距透镜50厘米的位置，并将光束直接对准芯片中心。为设置额外的成像通道，将LED光源的输出端耦合至长工作距离物镜。在样品室上方安装机械部件，以实现LED输出光在样品上的聚焦及横向定位。横向移动上部物镜，使上部宽场物镜与下部iSCAT物镜共线。通过在下部物镜下方放置屏幕，并使屏幕上透射的LED光强度最大化来确定共线位置。接着，放置一个550纳米短通二向色镜，以将透射的LED光与iSCAT激光光路分离。使用一个反射率为8%、透射率为92%的分光镜将该光束分为两个通道。92%的光路用于荧光通道，8%的光路用于明场成像。通过一个焦距为5厘米的消色差双合透镜，将明场通道成像至CMOS相机上。使用焦距为五厘米的消色差双合透镜，将荧光通道成像至独立的CMOS相机上。同时使用600纳米长通滤光片以阻断激发光。在计算机和软件设置方面，将所有相机连接至计算机。在完全组装好的装置上，通过CMOS相机观察iSCAT图像，并通过查找玻璃盖玻片上残留的灰尘或污物颗粒来确认图像是否聚焦。验证该颗粒的图像是否为具有圆对称性的点扩散函数。如果激光束以微小角度进入显微镜物镜，则点扩散函数将不呈现圆形。可通过轻微调整45度反射镜，确保光路笔直地耦合到物镜中。比较明场与荧光通道的相机成像，确保两者均处于聚焦状态，并通过成像荧光微球或细胞样品来确认显示的是同一区域。确认iSCAT激光的位置大致位于图像中心，并记录其位置以供后续参考。如需调整明场和荧光通道的成像位置及视野，可通过移动相机在载物台上的位置来相对于聚焦透镜进行调节。按照文本方案中的详细步骤准备实验。这包括细胞和显微镜介质的准备，以及显微镜样品比色皿的准备。确保阻挡激光束，以防止细胞直接暴露于iSCAT激光光下。将约三微升制备好的细胞样品略微偏离中心地注入样品比色皿中。轻轻将移液器吸头接触盖玻片，并缓慢注入细胞溶液。让细胞在盖玻片上自然沉降。检查靠近iSCAT激光区域的细胞数量。如果细胞数量过少，请重复此步骤，直至获得足够数量的细胞。如果细胞密度过高，可注入约 20 µL 的额外显微镜成像培养基，使细胞在盖玻片上分散。使用压电平移台，横向移动样品，将细胞移至接近 iSCAT 视场的位置。确保细胞不进入iSCAT的视野，因为直接暴露于445纳米激光可能对细胞有害。解除iSCAT激光束的遮挡，并确保盖玻片表面仍处于焦点位置。封闭隔振台以尽量减少环境周围引起的漂移和声学耦合。通过iSCAT、明场和荧光相机获取图像，开始测量。定期检查细胞的活性和系统的聚焦情况。此处使用自行编写的显微镜软件来显示相机图像。此处通过连续帧相减实现实时差分成像，从而使蛋白质结合事件可见。该处理生成一幅滤波图像，与原始相机图像一同显示在屏幕上。以下是使用iSCAT技术进行细胞分泌实验的代表性结果。视频展示了LAZ细胞在两分钟内的分泌过程。左侧的差分iSCAT图像可可视化单个蛋白质在盖玻片上的吸附情况。右侧的明场图像和荧光通道用于监测细胞活性。该直方图显示了在两分钟时间范围内检测到的蛋白质及其对比度范围。数据是通过使用自定义的峰值搜索算法，分析iSCAT视频数据每一帧中的单个结合事件而获得的。iSCAT显微技术不仅在生物传感中是一种强大的工具，在显微成像中也同样重要，因为它能够实现对纳米级物体的无标记、实时检测。特别是，该技术可应用于多种过程，例如蛋白质的扩散与运输。由于iSCAT对光散射具有极高的灵敏度，因此能够检测视场中的任何蛋白质或实体。当然，这也意味着该技术缺乏荧光技术所具备的特异性；但为解决这一问题，可采用表面功能化等附加方法来检测特定的目标蛋白质。请务必注意，使用激光器可能存在危险，在组装和调试显微镜时应始终佩戴适当的眼部防护装备。对分泌组进行实时检测具有重要意义，是医学诊断领域的一大飞跃；而现有的诊断方法通常耗时较长，且远未达到单蛋白灵敏度水平。该方法在性能提升和应用拓展方面仍有广阔的发展空间。因此，我们希望本视频能够帮助其他研究团队加入这一激动人心的研究工作中。

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