通过 iscat 显微镜对活细胞分泌的单一蛋白质进行无标签成像

2004年，我们首次在金纳米粒子的检测和光谱学中介绍了 iSCAT。在随后的10年中，我们进一步开发了这种技术，用于检测和跟踪生物纳米粒子，如病毒和小蛋白质。该技术的本质是，任何物质物体，无论多么小，都有一个有限的消光截面。

该技术的主要优点是无标签检测。这意味着，如果我们足够敏感，我们可以检测出任何东西，如蛋白质或从单细胞分泌的外体。一个必须小心的问题是如何处理散射背景。

iSCAT 显微镜的一大优点是，它可以完全在家建造，也可以添加到现有的商业显微镜中。这意味着它可以很容易地与其他光学技术（如荧光）结合使用，这也是许多组现在也采用 iSCAT 和相关技术的原因之一。在这里，我们利用LUZ细胞作为模型系统，以显示单个和分泌蛋白的检测。

然而，这种方法也可以用于在分子水平上探索几乎任何生物过程。要获得稳定的显微镜，请从阻尼光学台和样品阶段的刚性块开始。构建一个显微镜采样阶段，该阶段包含高数值孔径目标和一个翻译单元，允许横向样品转换以及更改目标的对焦位置。

使用 45 度垂直耦合镜和 50 厘米焦距单片镜头将波长为 445 纳米的二极管激光器的光线聚焦到目标的后焦平面上。这种宽场镜头在目标的前焦上产生准直光束，这将成为 iSCAT 照明源。将浸入油滴涂抹在目标上，并在显微镜阶段的样品平面上放置玻璃盖玻片。

这将导致光束通过成像目标反射回。要设置成像路径，请引入与射射光束相对 45 度角的防反射涂层光束分片，并在宽场透镜后引入约 10 厘米的防反射涂层光束分片器。确保防反射涂层指向激光源。

注意厚光束分片器会引入显著的光束位移，使激光不再直接进入目标。如有必要，在光束分流器前重新调整激光束路径，以确保在目标中正确传播。为确保样品平面和摄像机具有焦距，请首先将负焦长度为 45 厘米的凹面镜头放置在出射光束路径中宽场镜头后 5 厘米的位置。

这将导致准直光束进入目标的后孔。将屏幕置于干涉仪的反射臂中，在垂直方向上移动目标以查找粗焦位置。当光束击中屏幕时，目标对准。

完成粗焦对焦后，将同时移除负焦距镜头和屏幕。添加第二个 50 厘米焦距单片镜头，对准散射的光线并合二为反射光。确保镜头放置在距目标背面焦平面 50 厘米处，以便再次准直发射激光束。

要完成 iSCAT 设置组件，请将 CMOS 摄像机放在距离 50 厘米焦距镜头 50 厘米的地方，然后将光束直接放置到芯片中间。要设置额外的成像通道，请将 LED 光源的输出转换为长工作距离目标。在样品室上方安装机械部件，以便将 LED 输出对焦和横向定位到样品上。

横向移动上部目标，使上部宽场目标和下部 iSCAT 目标是科林耳的。这通过将屏幕置于较低目标下并最大限度地提高屏幕上传输的 LED 灯的强度来确定。现在，放置一个 550 纳米的短通二色镜，将传输的 LED 灯从 iSCAT 激光路径分割。

将光束分成两个通道，具有 8% 的反射、92% 的透射式、透光式分束器。92% 的路径是荧光通道，8% 的路径用于亮场成像。使用五厘米焦距无色双片镜头将亮场通道成像到 CMOS 相机上。

使用五厘米焦距无色双片镜头将荧光通道成像到单独的 CMOS 摄像机上。此外，使用 600 纳米长通滤波器阻挡激发光。要设置计算机和软件，请将所有摄像机连接到计算机。

在完全组装的设置上，观察 CMOS 摄像机上的 iSCAT 图像，并在玻璃盖玻片上发现残留的灰尘或污垢颗粒，确保其对焦。验证粒子的图像是否为圆形对称点传播函数。如果激光束以轻微角度进入显微镜目标，点扩散功能将不具有圆形。

这可以通过对 45 度镜面的轻微调整进行校正，以确保将直线耦合到目标中。比较亮场和荧光通道的相机图像。确保两者均对焦，并通过成像荧光珠或细胞样本显示同一区域。

验证 iSCAT 激光器的位置是否大约在图像的中心，并记下其位置，以便以后参考。要更改亮场和荧光通道的位置和视野，请移动桌子上的摄像机与对焦镜头。准备实验，如文本协议中详细说明。

这包括制备细胞和显微镜介质，以及显微镜样品盒。确保激光束被阻挡，以防止细胞直接暴露在 iSCAT 激光中。将制备的细胞样品的大约三微升稍微远离中心注入样品盒中。

轻轻触摸移液器尖端到盖玻片，然后慢慢注入细胞溶液。允许单元格在盖玻片上沉淀。检查靠近 iSCAT 激光的细胞数量。

如果单元格数过低，请重复此步骤，直到有足够的数量可用。如果细胞的覆盖范围过于密集，则使用大约 20 微升的额外显微镜注射，将细胞分散到盖玻片上。使用压电转换阶段，横向移动样本以将细胞靠近 iSCAT 视场。

确保电池不进入 iSCAT 视场，因为直接接触 445 纳米激光可能对细胞有害。解除阻止 iSCAT 激光束，并确保盖玻片表面仍对焦。封闭隔离表，以最大限度地减少与周围环境的漂移和声学耦合。

通过从 iSCAT、亮场和荧光摄像机获取图像开始测量。定期检查电池的生存能力和系统的焦点。在这里，自成的显微镜软件用于显示相机图像。

在这里，通过减去连续帧来实时进行差分成像，使蛋白质结合可见。这将导致过滤的图像与原始摄像机图像一起在屏幕上可见。此处显示了使用 iSCAT 进行的细胞分泌实验的代表性结果。

该视频显示 LAZ 细胞在两分钟内的分泌物。左侧的差分 iSCAT 图像可显示单个蛋白质对盖玻璃的吸收。右侧的亮场图像和荧光通道用于监测细胞生存能力。

此直方图显示检测到的蛋白质及其在两分钟内的对比度范围。数据是通过使用自定义峰值寻数算法分析 iSCAT 视频数据每帧中的单个绑定事件而收集的数据。ISCAT 显微镜不仅是生物检测中一个强大的工具，也是显微镜中的有力工具，因为它允许实时检测纳米物体。

特别是，它可以应用于各种过程，如蛋白质的扩散和运输。由于其对光散射的精湛灵敏度，iSCAT可以检测视野中的任何蛋白质或实体。当然，这也意味着该技术缺乏荧光带来的特异性，但为了解决这个问题，可以应用其他方法，如表面功能化，以检测感兴趣的特定蛋白质。

不要忘记，使用激光器可能很危险，组装和调整显微镜时应始终佩戴适当的眼部保护。对分泌物的实时检测非常令人兴奋，也是医学诊断的一大飞跃，目前需要更长的时间，而且远非单一的蛋白质敏感性。在提高该方法的性能和扩展其应用方面仍有很大的空间。

因此，我们希望这个视频帮助其他团体加入这个令人兴奋的努力。