实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

该方法可用于研究不同力学负荷方案、环境条件或软骨退变阶段对原位关节软骨细胞易损性的影响。与其他技术不同，这些测量可在完全完整的软骨组织中实时进行，且不破坏其天然的边界条件。

该技术的另一个优势在于其采用小鼠模型，可用来检测特定基因如何影响原位软骨细胞对机械性损伤的易感性。解剖股骨远端时，将小鼠置于仰卧位，在膝关节前部做一处五毫米的皮肤切口，然后将切口围绕膝关节一周完全延伸。

向后牵拉皮肤以暴露膝关节和腿部肌肉。从股骨近端开始，使用11号手术刀片沿股骨向远端方向切开，刀片置于股四头肌肌腱单元与股骨干前侧之间。

将切口延伸至髌骨远端。从髌腱中部切开，以取下股四头肌肌腱单元。接着，从股骨近端开始，将手术刀片置于腘绳肌肌腱单元与股骨干后侧之间，沿骨面向远端方向切开。

当切口接近膝关节时，切开软组织，并在越过膝关节后完成切割。向后牵拉股四头肌和腘绳肌以暴露股骨，并切除骨外侧和内侧的多余肌肉。

在胫骨近端后侧切开小腿肌肉。将腿部翻转以观察股骨后侧。清除膝关节周围的多余组织，暴露股骨远端髁和胫骨近端后表面。

切断前交叉韧带和后交叉韧带与股骨髁的连接。将胫骨从股骨上拉开，切断所有韧带，使小腿部分与股骨分离。使用标准解剖剪，从外侧在胫股关节上方约八毫米处的股骨近端横断股骨。

使用钟表镊去除股骨周围的软组织。然后暴露股骨远端两侧髁上的软骨。定期用HBSS润湿关节面。

解剖肱骨时，将小鼠置于仰卧位。使用显微剪刀在肘关节后侧做一处五毫米的切口。延长切口绕过肘关节，并向后牵拉皮肤，以暴露前肢和肩部的肌肉。

从肱骨近端开始，将11号手术刀的刀片置于肱三头肌肌腱单元与肱骨后侧之间，沿骨骼向远端方向切割。将切口延伸至肱骨远端，穿过肱三头肌腱，并将肱三头肌向肱骨近端方向牵开，直至暴露肱骨头。

切除肱骨头周围的结缔组织，注意不要触碰关节面。然后将肢体从身体上取下。用HBSS溶液润湿肱骨头的关节面。

为了将肱骨与前臂分离，使用镊子折断前臂后侧尺骨的近端。然后剪断肱骨远端周围的结缔组织，去除骨头上多余的组织。接着使用标准解剖剪，在肱骨后侧去除三角肌粗隆。

将解剖后的样本放入含有HBSS的1.5毫升微量离心管中。进行Calcein AM染色时，将骨组织转移至含有500微升、浓度为10.05微摩尔的Calcein HBSS溶液的1.5毫升微量离心管中，并将该管置于37摄氏度、800转/分钟的恒温振荡混合仪中避光孵育。

三十分钟后，用新鲜的HBSS冲洗样本十分钟。然后将样本转移至定制显微镜载物台机械测试装置的玻璃载片上，使股骨髁后部或肱骨头的关节面接触玻璃表面。用HBSS润湿样本，并将带有样本的装置放置于荧光显微镜载物台上。

在施加负荷前，使用4倍放大倍率对经Calcein AM染色的关节软骨细胞进行成像。调整采集参数以优化图像质量。为施加静态机械负荷，将规定的静态载荷施加于样本上方，使关节软骨被压缩紧贴盖玻片，持续五分钟，然后移除载荷。

为施加冲击机械载荷，将已知重量的圆柱形冲击头从规定高度自由下落到样品上，并在冲击发生5秒后释放载荷。任一载荷移除后立即进行操作：将样品置于1毫升新鲜配制的60 µM碘化丙啶HBSS溶液中，在室温下孵育5分钟，随后按照前述方法通过荧光显微镜重新成像关节软骨细胞。

为了量化因施加的机械负荷方案而导致的损伤和死亡细胞区域，首先在 ImageJ 中打开施加机械负荷前后获取的关节表面显微图像。将这些图像合并成一个图像栈。根据图像分辨率设置图像的标尺。

接下来，确定细胞变为钙黄绿素阴性且碘化丙啶阳性的区域。这些细胞被视为受损或死亡细胞。然后使用测量工具确定受损死亡细胞的面积。

至少有六种经过测试的加载方案可重复地在8至10周龄C型小鼠的股骨和肱骨软骨中诱导出可量化的局部细胞损伤区域。在所有测试的加载方案中，较高的载荷强度和较高的冲击强度均显著加剧了股骨和肱骨中细胞损伤的空间范围。在进行解剖操作时，必须注意避免手术器械接触关节软骨，因为这可能会影响样本的基线状态。

该镜像模型的使用可能有助于骨关节炎的研究，因为通过基因、饮食或手术操作可轻易在小鼠中诱导该疾病。我们的平台还为探究基础科学问题以及筛选针对软骨细胞机械脆弱性的治疗干预手段提供了工具。