Name: 免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1蛋白核细胞质转移的时间分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学习免疫荧光共聚焦显微镜技术，用于分析HSV-1感染期间ICP0蛋白从细胞核向细胞质的时序性转移过程。该方法为研究蛋白质转运机制提供了定量分析框架，可应用于病毒学与细胞生物学领域的蛋白动态研究。

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我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）基金（RO1AI118992）对Haidong Gu的资助。我们感谢显微成像中心 &amp;#38; 韦恩州立大学显微镜与细胞计量资源（MICR）核心设施提供的技术支持。

1. 细胞接种与病毒感染
<ol>
	<li>在病毒感染前 20–24 小时，将 5 × 104 个人类胚胎肺（HEL）成纤维细胞或其他待检测细胞接种于含生长培养基（添加 10% 胎牛血清（FBS）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））的 4 孔 11 mm 错列载玻片中。在 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）条件下培养细胞。 
	注意：感染时每个孔的细胞融合度应达到 70–80%。</li>
	<li>次日，移除生长培养基，并用 Medium-199 培养基以每细胞 4–10 pfu 的感染复数（pfu/cell）感染细胞。将病毒感染的细胞在 37 °C 下孵育 1 小时。孵育期间持续轻轻摇动载玻片。</li>
	<li>孵育 1 小时后，移除 Medium-199 培养基，并补充生长培养基。 
	注意：可在此步骤或病毒吸附前加入干扰不同感染阶段的药物。</li>
	<li>将病毒感染的细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育不同时间段。</li>
</ol>
2. 固定与通透处理
<ol>
	<li>在适当的感染时间，用磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤感染的细胞3次，并加入200 μL新配制的4%多聚甲醛PBS溶液。室温下孵育8–10分钟，以固定每个孔中的细胞。</li>
	<li>吸弃多聚甲醛，用 200 μL PBS 洗涤孔板 3 次。第三次洗涤后彻底吸弃 PBSrd 洗涤。</li>
	<li>每孔加入 100 μL 0.2% 非离子型表面活性剂，孵育 5–10 分钟以通透细胞。</li>
	<li>吸出非离子型表面活性剂，用 200 μL PBS 洗涤孔板 3 次。</li>
</ol>
3. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>彻底吸除 PBS，每孔加入 200 μL 封闭缓冲液（含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 5% 马血清的 PBS），室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。</li>
	<li>在封闭缓冲液中加入经实验确定浓度的一抗（兔抗 ICP0 多克隆抗体12），室温孵育 2 小时，或 4 °C 过夜。</li>
	<li>用封闭缓冲液洗涤 3 次，每次孵育 10 分钟。加入 Alexa 594 标记的山羊抗兔二抗（按 1:400 稀释于封闭缓冲液中），室温孵育 1 小时。随后用封闭缓冲液洗涤切片 3 次，每次间隔 10 分钟。</li>
	<li>最后用 PBS 洗涤切片一次，以去除残留的 BSA 和马血清。</li>
	<li>加入一滴含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，并用透明指甲油封固。</li>
</ol>
4. 共聚焦成像
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜时，将Alexa 594的波长设置为590–650 nm，DAPI的波长设置为410–520 nm。选择1024 × 1024的图像格式和8次线平均，以获取高分辨率图像。</li>
	<li>在共聚焦显微镜下分析4孔载玻片上每个孔的样本。使用100倍物镜获取代表性细胞图像，如图&#160;1和图&#160;2所示。</li>
	<li>若需计数大量细胞，可在40倍物镜下连续拍摄多个视野的图像。 
	注意：每个感染时间点的每个感染样本需拍摄5–10张图像，以累计获得超过200个感染细胞。</li>
	<li>在每次实验中，所有需要比较的样本应使用相同的共聚焦参数进行拍照。</li>
</ol>
5. 细胞核分析 与 细胞质分布
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜应用软件打开项目。从图像中选择需要进行细胞核计数的细胞区域 与 ICP0的胞质分布</li>
	<li>点击标签页 &#34;数量&#34; 从顶部菜单中选择 &#34;排序感兴趣区域&#34; 从工具菜单中。</li>
	<li>沿待分析细胞的长轴画一条线 &#34;画线&#34; 从顶部菜单。 
	注意：直方图将显示沿该线的ICP0和DAPI荧光强度。在直方图中，蓝线代表DAPI像素，标记细胞核边界，而红线代表ICP0像素。</li>
	<li>根据背景染色，为每次实验中ICP0强度设定恒定阈值，以分析ICP0的亚细胞分布。
	<ol>
		<li>如示例所示 图2如果红色信号在核区域内的平均值低于阈值，但在蓝色边界之外高于阈值，则将红色信号归类为主要位于细胞质中。</li>
		<li>如果红色信号在整个细胞核内均高于阈值，并延伸至蓝色信号边界之外，则将红色信号归类为细胞核与细胞质共定位。</li>
		<li>如果红色信号在细胞核内的强度高于阈值，但在蓝色信号边界外的平均强度低于阈值，则将红色信号归类为核定位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每个样本在不同感染时间点统计超过200个感染细胞，并以柱状图展示ICP0随时间变化的定位情况图3).</li>
</ol>

<ol><li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitley%2C+R+%22Human+Herpesviruses%3A+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields%27+Virology%22">Fields' Virology</a>. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li>
<li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li>
<li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+location+of+PML%2C+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family%2C+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li>
<li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li>
<li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tale+of+Two+PMLs%3A+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li>
<li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+ICP0%3A+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li>
<li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="https://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/fvl-2018-0038">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li>
<li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378(2016).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案已用于研究HSV-1 ICP0从细胞核向细胞质的转位过程。在HSV-1感染期间，ICP0会发生亚细胞定位的动态变化（图1）。ICP0可能通过与多种细胞通路相互作用，在不同亚细胞位置执行不同的功能，从而在与人类宿主的相互博弈中精细调控其多种功能13。然而，ICP0如何以时空特异性的方式协调其多种功能，目前尚缺乏深入研究。利用上述荧光显微镜检测方案，我们开始解析ICP0从细胞核向细胞质转位的分子机制。目前，我们已鉴定出ICP0羧基末端的35个氨基酸是该转位过程所必需的关键元件。在缺失C末端的情况下，ICP0在整个感染过程中被限制在细胞核内（图3）。我们还发现，在U2OS细胞中，依赖于ICP0 E3泛素连接酶活性的细胞核滞留力会延迟其向细胞质的转位12。此外，我们发现ICP0的C末端与晚期病毒蛋白的表达协同作用，可克服细胞核滞留效应，促进其向细胞质的转位12。目前，我们正利用该...

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）可引起多种轻重不一的疱疹性疾病，包括唇疱疹、生殖器疱疹、间质性角膜炎和脑炎。感染后，病毒可在神经节神经元中建立终身潜伏感染。在发热、应激和免疫抑制等多种因素刺激下，病毒可偶尔被重新激活。1，导致疱疹反复感染。感染细胞蛋白0（ICP0）是HSV-1裂解期和潜伏期感染的关键病毒调控因子，可转激活下游病毒基因。 通过 抵消宿主固有/先天抗病毒防御机制2,3ICP0 具有 E3 泛素连接酶活性，可靶向多种细胞因子并介导其依赖蛋白酶体的降解3它还与多种细胞通路相互作用，调控其活性，从而抵消宿主的抗病毒限制作用。3随着感染的进行，ICP0 被发现定位于不同的亚细胞区域3,4,5该蛋白在第500至506位氨基酸处含有一段富含赖氨酸/精氨酸的核定位信号（NLS）。6。当 从头合成 在HSV-1感染早期进行合成时，ICP0立即被导入细胞核，并首先定位于一种称为核结构域10（ND10）的动态核结构处。7ICP0 的 E3 泛素连接酶活性可触发 ND10 组织蛋白、早幼粒细胞白血病（PML）蛋白以及 100 kDa 斑点蛋白（Sp100）的降解8,9,10组织蛋白丢失后，ND10核体解体，ICP0扩散至整个细胞核4,11.
有趣的是，在病毒DNA复制开始后，ICP0从细胞核中消失，仅在细胞质中被检测到，提示在HSV-1感染的晚期发生了从细胞核到细胞质的转位。4,12DNA复制的需求暗示了晚期病毒蛋白可能参与促进HSV-1 ICP0的胞质转位4,12显然，ICP0在感染过程中于不同细胞区室间的转运使其能够以时空特异性的方式调节与多种细胞通路的相互作用，从而协调其多重功能，精细调控HSV-1裂解性感染与潜伏性感染之间的平衡。13为了更好地理解ICP0的多功能性及其在裂解感染过程中各功能结构域的协调作用，我们深入剖析了ICP0动态转位的分子基础12进行先前报道的机制研究12，我们采用免疫荧光染色方法，在共聚焦显微镜下观察不同感染状态下ICP0的亚细胞定位。同时，我们还建立了一种定量分析方案，用于分析细胞核内 与 使用共聚焦软件分析ICP0的胞质分布。在不同生化处理条件下，统计了HSV-1感染各阶段的感染细胞群体，并分析了ICP0定位变化的趋势。12. 本文描述了一种详细方案，用于记录 HSV-1 感染过程中 ICP0 的转位。我们建议该方法可作为研究核内事件的通用方法 与 细胞质转位可用于其他病毒或细胞蛋白，当活体成像技术因标记方法、信号强度或蛋白丰度等问题而无法适用时，可作为活体成像的替代方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;细胞与病毒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人胚胎肺成纤维细胞（HEL细胞）</td><td>托马斯·E·申克博士（普林斯顿大学）</td><td></td><td>HEL细胞在添加了10% FBS的DMEM培养基中培养</td></tr><tr><td>HSV-1 病毒储备液（F株）</td><td>Dr. Bernard Roizman 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F0926-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199（10倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4孔11毫米错列载玻片</td><td>Cel-Line/赛默飞世尔科技</td><td>&amp;nbsp;30-149H-黑色</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛溶液（w/v），无甲醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher试剂</td><td>BP151-1C0</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 7.4）</td><td>郭海东博士实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>封闭缓冲液（PBS 加 1% BSA 和 5% 马血清）</td><td>郭海东博士实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗ICP0抗体</td><td>郭海东博士实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PML（PG-M3）-小鼠单克隆IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-966</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-山羊抗兔IgG</td><td>invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-山羊抗小鼠IgG</td><td>invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Vectashield封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦软件</td><td>Leica LAS X 应用套件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 软件</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO₂ 培养箱&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号 51026282</td><td></td></tr></tbody></table>

通过免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染细胞蛋白0（ICP0）是一种含有RING型E3泛素连接酶的即刻早期蛋白。它介导宿主限制性因子的蛋白酶体降解，并促进后续病毒基因的激活。ICP0含有一个经典的核定位序列（NLS），在感染后立即进入细胞核 从头合成 合成，并主要在细胞核内执行其抗宿主防御功能。然而，在感染后期，ICP0 仅存在于细胞质中，表明在 HSV-1 感染过程中发生了从细胞核到细胞质的转位。推测 ICP0 的转位使其能够根据感染不同阶段的亚细胞定位来调节其功能。为了阐明 ICP0 核质转位的生物学功能及其调控机制，我们改进了一种免疫荧光显微镜方法，用于监测 HSV-1 感染过程中 ICP0 的转运。该方案包括免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像以及细胞核 与 细胞质分布分析。本实验方案旨在将时间序列中采集的稳态共聚焦图像转化为对裂解感染过程中 ICP0 运动的定量记录。我们提出，该方法可推广用于对细胞核的定量分析。 与 无需使用活体成像技术即可研究其他病毒或细胞蛋白的细胞质定位。

为了理解HSV-1感染过程中ICP0转运的分子基础和生物学功能，我们采用免疫荧光显微镜方法分析ICP0在不同感染阶段的亚细胞分布。图1展示了随着感染进展，ICP0定位特征明显的代表性细胞。为了定量分析ICP0从细胞核到细胞质的转位，我们通过将感染细胞分为三类——核定位、胞质定位以及核加胞质共定位——来评估ICP0相对于细胞核的分布情况（图2）。为了明确感染过程中ICP0转运所需的元件，我们在野生型或突变型HSV-1感染的不同阶段追踪ICP0的移动。图3展示了在感染不同时间点ICP0亚细胞分布结果的一个示例性数据汇总表。
<img alt="荧光显微镜下PML与ICP0的共定位，显示随时间推移的病毒感染进程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_u...

ICP0 在 HSV-1 感染过程中会发生从细胞核到细胞质的转位。这一事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了使用共聚焦显微镜作为量化 HSV-1 感染中 ICP0 运动的工具，为今后在机制研究中对 ICP0 转位进行定量分析奠定了基础。

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染细胞蛋白0（ICP0）是一种含有RING型E3泛素连接酶的即刻早期蛋白。它是一种……

该方法有助于解答蛋白质运输领域中的关键问题，即在无法进行光学成像的体系内研究蛋白质的核内与细胞质转位。该技术的主要优势在于，可作为一种通用方案用于研究蛋白质随时间变化的动态转运过程，而无需依赖光学成像。在病毒感染前20至24小时，将5×10⁴个人类胚胎肺（HEL）成纤维细胞接种至四孔板中的11毫米错列载玻片上，每孔加入培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下过夜培养。轻轻摇动载玻片至关重要，以确保细胞均匀分布，同时注意避免培养基溢出。第二天，将上清液更换为含有每细胞410个空斑形成单位的Medium 199培养基，使细胞融合度达到70%至80%，并将载玻片置于37摄氏度下振荡孵育1小时。孵育结束后，弃去上清液，加入新鲜的生长培养基，将细胞放回培养箱中，继续进行相应实验所需的感染周期。对于病毒感染细胞的免疫荧光染色，用 PBS 快速洗涤细胞三次。随后每孔加入 200 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS，室温孵育 8 至 10 分钟。固定结束后，每孔用 200 µL PBS 洗涤三次，每次洗涤后每孔加入 100 µL 0.2% 非离子型表面活性剂，室温孵育 5 至 10 分钟以通透细胞。如图所示，用 PBS 清洗透化后的细胞三次，每孔加入 200 µL 封闭缓冲液，在室温下封闭 1 小时。接着，向每孔加入适当浓度的目标一抗，在室温下孵育 2 小时。孵育结束后，用新鲜的封闭缓冲液洗涤三次，每次 10 分钟，以去除未结合的一抗，然后在避光条件下，向每孔加入适当的二抗，在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，如图所示，用封闭缓冲液洗涤细胞三次，随后用 PBS 洗涤一次，每孔加入一滴含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。然后将盖玻片覆盖在载玻片上，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。封片时施加轻柔压力，可去除多余的封片剂，有助于确保获得高质量的图像。对于标记后感染细胞的共聚焦成像，选择合适的二抗和 DAPI 激发波长，将图像格式设置为 1,024 × 1,024 像素，扫描平均线数设为 8。然后在 100 倍物镜下对四孔载玻片上的每个孔进行成像。若需计数大量细胞，可在 40 倍物镜下对同一孔内连续视野采集 5 至 10 张图像。为了分析 ICP0 的核内与胞质分布，需在共聚焦成像应用软件中打开项目并选择一张图像。打开“定量”选项卡，从“工具”菜单中选择“排序感兴趣区域”。选择“绘制线条”，并在待分析的细胞上纵向绘制一条直线。将显示一个直方图，呈现目标蛋白和 DAPI 沿该直线的荧光强度。根据背景染色情况，在每次实验中为目标蛋白的荧光强度设定一个恒定的阈值，用于分析该蛋白的亚细胞分布。如果目标蛋白信号在细胞核区域的平均强度低于该阈值，而在 DAPI 边界以外的区域高于该阈值，则将该蛋白信号归类为主要定位于细胞质中。如果蛋白信号在整个细胞核内均高于阈值，并且超出DAPI信号的边界，则将该蛋白信号归类为细胞核与细胞质共定位。如果蛋白信号在细胞核内高于阈值，但在DAPI信号边界外的平均信号强度低于阈值，则将该蛋白信号归类为细胞核定位。最后，统计每个样本在不同感染时间点的200个以上的感染细胞，并将数据绘制成柱状图，以展示目标蛋白随时间的定位变化。如所示，该方法可促进对目的蛋白从细胞核向细胞质转位的分析。例如，感染细胞蛋白零（ICP0）的亚细胞分布会随着病毒感染的进展而发生变化。为了理解ICP0在感染过程中转运所需的要素，可在野生型和突变型单纯疱疹病毒1型感染的不同阶段，在不同感染时间点追踪ICP0的移动，从而评估ICP0在感染各时间点的亚细胞分布情况。必须注意使用单层细胞培养，以确保病毒颗粒能够均等地接触细胞，并根据病毒滴度对感染复数进行标准化，从而使不同病毒之间及同一病毒内部的感染进程具有可比性。该技术在每一次发展之后，都为生物学和细胞病毒学领域的研究人员探索蛋白质的运动提供了途径，使其能够通过研究目标蛋白质在细胞群体中的时间依赖性亚细胞定位来深入理解其功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1蛋白核细胞质转移的时间分析

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

本方案描述了一种高效且可重复的模型系统，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的潜伏感染与再激活。该检测方法采用均一的交感神经元培养体系，可利用多种工具（包括RNA干扰和重组蛋白表达）对病毒与神经元之间的相互作用进行分子层面的解析。...

一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

本视频展示了一种用于监测单纯疱疹病毒-1型感染过程中感染细胞蛋白0（ICP0）转运的方法。ICP0在新合成后会转位至细胞核，随着感染进程的发展，随后转移至细胞质。通过免疫荧光显微镜可揭示并分析该蛋白的亚细胞定位，从而深入了解其在感染各阶段中的转运动态。...

一种用于感染细胞中病毒蛋白定位的免疫荧光技术

活细胞成像技术可对α疱疹病毒感染过程中的定向运输和细胞间扩散等动态事件进行分析。本文介绍了利用表达荧光融合蛋白的重组病毒株，在原代神经元感染过程中实现病毒组装体可视化的方法。...

活细胞成像观察α疱疹病毒的顺向运输与传播

我们建立了一种荧光原位杂交方案，用于检测动物模型组织切片中持续性DNA病毒基因组。该方案可通过在同一细胞内共检测病毒基因组、其RNA产物以及病毒或细胞蛋白，来研究感染过程。...

通过荧光法检测神经元组织中一种持续性DNA病毒的基因组和转录本 原位 杂交结合免疫染色

皮肤是人类病原体单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的靶组织之一。为探究HSV-1侵入组织的途径，我们建立了一种 离体...

Ex Vivo 小鼠表皮感染单纯疱疹病毒1型

本实验方案的目的是特异性标记并选择性分离感染细胞中的病毒DNA，以用于表征与病毒基因组相关的蛋白质。...

用于鉴定相关病毒和细胞蛋白的病毒DNA纯化

病毒转录工厂是富含细胞RNA聚合酶II的独立结构，在病毒再激活期间可增强病毒基因的转录。本文介绍一种结合免疫荧光染色与三维细胞核空间成像的方法，用于定位活跃转录的病毒染色质位点。 原位...

利用三维荧光显微镜对病毒转录工厂进行功能成像

我们介绍一种利用荧光原位杂交（FISH）技术在裂解感染的人类细胞中可视化多种疱疹病毒RNA的实验方案，适用于悬浮或贴壁细胞。该方案包含荧光信号的定量分析，以生成核质比，并可扩展用于通过免疫荧光（IF）同时可视化宿主和病毒蛋白。...

KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

免疫荧光染色过程中使用酪胺信号放大技术，可灵敏地检测 HSV-1 感染后 ZBP1 介导的坏死性凋亡过程中磷酸化的 RIPK3 和...

酪胺信号放大法用于人细胞中HSV-1感染后ZBP1依赖性RIPK3和MLKL磷酸化的免疫荧光染色

学习免疫荧光共聚焦显微镜技术，用于分析HSV-1感染期间ICP0蛋白从细胞核向细胞质的时序性转移过程。该方法为研究蛋白质转运机制提供了定量分析框架，可应用于病毒学与细胞生物学领域的蛋白动态研究。

通过免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析

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