通过免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析

该方法有助于解答蛋白质运输领域中的关键问题，即在无法进行光学成像的体系内研究蛋白质的核内与细胞质转位。该技术的主要优势在于，可作为一种通用方案用于研究蛋白质随时间变化的动态转运过程，而无需依赖光学成像。在病毒感染前20至24小时，将5×10⁴个人类胚胎肺（HEL）成纤维细胞接种至四孔板中的11毫米错列载玻片上，每孔加入培养基，在37°C、5%二氧化碳条件下过夜培养。

轻轻摇动载玻片至关重要，以确保细胞均匀分布，同时注意避免培养基溢出。第二天，将上清液更换为含有每细胞410个空斑形成单位的Medium 199培养基，使细胞融合度达到70%至80%，并将载玻片置于37摄氏度下振荡孵育1小时。孵育结束后，弃去上清液，加入新鲜的生长培养基，将细胞放回培养箱中，继续进行相应实验所需的感染周期。

对于病毒感染细胞的免疫荧光染色，用 PBS 快速洗涤细胞三次。随后每孔加入 200 µL 含 4% 多聚甲醛的 PBS，室温孵育 8 至 10 分钟。固定结束后，每孔用 200 µL PBS 洗涤三次，每次洗涤后每孔加入 100 µL 0.2% 非离子型表面活性剂，室温孵育 5 至 10 分钟以通透细胞。

如图所示，用 PBS 清洗透化后的细胞三次，每孔加入 200 µL 封闭缓冲液，在室温下封闭 1 小时。接着，向每孔加入适当浓度的目标一抗，在室温下孵育 2 小时。孵育结束后，用新鲜的封闭缓冲液洗涤三次，每次 10 分钟，以去除未结合的一抗，然后在避光条件下，向每孔加入适当的二抗，在室温下孵育 1 小时。

孵育结束后，如图所示，用封闭缓冲液洗涤细胞三次，随后用 PBS 洗涤一次，每孔加入一滴含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。然后将盖玻片覆盖在载玻片上，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。封片时施加轻柔压力，可去除多余的封片剂，有助于确保获得高质量的图像。

对于标记后感染细胞的共聚焦成像，选择合适的二抗和 DAPI 激发波长，将图像格式设置为 1,024 × 1,024 像素，扫描平均线数设为 8。然后在 100 倍物镜下对四孔载玻片上的每个孔进行成像。若需计数大量细胞，可在 40 倍物镜下对同一孔内连续视野采集 5 至 10 张图像。

为了分析 ICP0 的核内与胞质分布，需在共聚焦成像应用软件中打开项目并选择一张图像。打开“定量”选项卡，从“工具”菜单中选择“排序感兴趣区域”。选择“绘制线条”，并在待分析的细胞上纵向绘制一条直线。

将显示一个直方图，呈现目标蛋白和 DAPI 沿该直线的荧光强度。根据背景染色情况，在每次实验中为目标蛋白的荧光强度设定一个恒定的阈值，用于分析该蛋白的亚细胞分布。如果目标蛋白信号在细胞核区域的平均强度低于该阈值，而在 DAPI 边界以外的区域高于该阈值，则将该蛋白信号归类为主要定位于细胞质中。

如果蛋白信号在整个细胞核内均高于阈值，并且超出DAPI信号的边界，则将该蛋白信号归类为细胞核与细胞质共定位。如果蛋白信号在细胞核内高于阈值，但在DAPI信号边界外的平均信号强度低于阈值，则将该蛋白信号归类为细胞核定位。最后，统计每个样本在不同感染时间点的200个以上的感染细胞，并将数据绘制成柱状图，以展示目标蛋白随时间的定位变化。

如所示，该方法可促进对目的蛋白从细胞核向细胞质转位的分析。例如，感染细胞蛋白零（ICP0）的亚细胞分布会随着病毒感染的进展而发生变化。为了理解ICP0在感染过程中转运所需的要素，可在野生型和突变型单纯疱疹病毒1型感染的不同阶段，在不同感染时间点追踪ICP0的移动，从而评估ICP0在感染各时间点的亚细胞分布情况。

必须注意使用单层细胞培养，以确保病毒颗粒能够均等地接触细胞，并根据病毒滴度对感染复数进行标准化，从而使不同病毒之间及同一病毒内部的感染进程具有可比性。该技术在每一次发展之后，都为生物学和细胞病毒学领域的研究人员探索蛋白质的运动提供了途径，使其能够通过研究目标蛋白质在细胞群体中的时间依赖性亚细胞定位来深入理解其功能。