发展中雏鸡光学顶盖中切向细胞迁移的可视化
October 24th, 2018
我们描述了通过电穿孔荧光标记切向迁移细胞的方法, 以及在扁平支架培养中标记细胞运动的延时成像, 以可视化发展中的小鸡光学顶盖的迁移细胞行为。.
这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，如神经元细胞迁移的机制。此技术的主要优点是，您可以长期检测单个和集体细胞迁移。通过碱性解解法隔离200毫升细菌培养物后，混合两个质粒，使每个质粒的最终浓度为每微升4微克。
在70%的相对湿度下，在38摄氏度的温度下水平孵育肥卵。两天半后，使用20毫升注射器与18表针，以消除5毫升白素从鸡蛋的尖侧。用胶带密封孔。
接下来，用弯曲的剪刀切割蛋壳的顶部，并打开一个直径两厘米的洞。在立体显微镜下，检查胚胎的发育阶段。用胶带密封这个更大的孔。
在 38 摄氏度和 70% 的相对湿度下继续孵育，直到 E5.5。在电穿孔之前，准备10微升的上述质粒DNA，用0.5微升的快绿色着色。此外，准备10毫升的自专利化PBS，每毫升青霉素含有100个单位，每毫升链霉素含有100微克。
使用微管处理器准备由玻璃毛细管制成微管。将微管的端角切成适当的孔径，以用于注射的 DNA 量。用剪刀切割密封的顶壳，重新打开一个直径两厘米半的孔，并在立体显微镜下稳定地设置鸡蛋。
将几滴准备好的PBS溶液放入鸡蛋中。使用两个精细钳子，剥离覆盖胚胎的艾伦托膜，小心不要引起出血。然后从胚胎的头部取出安尼翁。
使用微孔转头时，使用连接到吸管的微管将 0.1 至 1 微升的彩色 DNA 注入左侧光学肿瘤的心室腔中。在光学图的目标区域周围放置一对钳子型电极。使用脉冲发生器以 5 毫秒的间隔为 30 伏特的预脉冲充电 1 毫秒，以 10 毫秒的间隔为 5 毫秒的后续脉冲充电 5 毫秒。
之后，用胶带密封孔，并在38摄氏度和70%的相对湿度下继续孵育。将电极浸泡在装满 PBS 的塑料盘中，并使用齿间刷去除白化胶。重复从初始壳切割到每个鸡蛋的电穿孔的过程。
平山培养前一天，开始准备编码细胞培养插入通过添加自 <3> <3>ave蒸馏水到10厘米的细胞培养皿。漂浮一些细胞培养物插入水面。在含有8微克每毫升层压，和80微克每毫升波莉L，确保覆盖插入。
在37摄氏度的细胞培养物中孵育过夜的二氧化碳孵化器。在 E7.0 培养之日，从插入中删除层氨和聚 l-lysine 溶液。然后，将插入转移到装满 1.1 毫升培养介质的玻璃底盘。
将菜转移到37摄氏度的细胞培养物二氧化碳培养箱。在倒置共体显微镜上设置一个潮湿的腔室单元，其气体流量为 40% 氧气和 5% 二氧化碳，温度为 38 摄氏度。要开始在插入物上准备组织样本，请使用钳子将胚胎头捏入含有冰冷的HPS的六厘米细胞培养盘中。
使用两个精细钳子隔离电穿孔光学技术。然后用塑料滴管将其转移到一个凹玻璃盘中，该盘以黑色硅为基础，并充满冰冷的HSS。在荧光立体显微镜下检查标签的位置。
使用微型手术刀，切掉标签周围的肠结组织，同时注意到肿瘤中组织的方向。在此之后，使用塑料滴管将标记的组织转移到"插入"，以便销侧连接到"插入"。将肠组织放在所需方向，并去除任何多余的HSS。
对用于同一插入的任何其他组织样本重复组织制备过程。然后将盘子放在倒置共体显微镜的预制室中。使用倒置共聚焦显微镜检查荧光标记并聚焦微观领域。
启动激光共合装置。对共体扫描进行采样，以调整组织沿现场 x 轴和 y 轴的方向和位置。接下来，选择扫描大小。
确定沿 z 轴进行共和扫描的间隔和总范围。在 100 微米范围内，以 5 或 10 微米的间隔。选择共声成像的时间间隔和总成像持续时间。
设置共和运行程序的参数后，开始成像。成像完成后，将不同 C 轴的共聚焦图像组合在一起，生成 z 堆栈图像，并在每个时间点进行最终焦距调整。然后在不同的时间点追加 Z 堆栈图像以构造延时影片。
在这项研究中，细胞迁移通过奥沃的电穿孔、扁平安装细胞培养和延时共合成像在浅层中检测。在记录开始之后零小时、九小时、十八小时和二十七小时，在这里可以看到光学肿瘤表面层的切线迁移细胞和核。在28小时50分钟的间隔10分钟的延时影片，显示了迁移细胞及其核的质量运动。
合并的影片清楚地显示了迁移单元格的质量运动。可以通过聚焦从标记中心到所有方向的分散细胞来检查细胞迁移的方向性。核运动的清晰图像允许使用粒子跟踪插件自动跟踪核迁移。
可以可视化切向迁移轨迹的时态变化，并证明分散迁移是全方位的。可以在五分钟间隔内拍摄更高的放大图像。通过前导过程、尾随过程和核的顺序形态变化来研究单个细胞行为。
按照此过程，可以执行照明操作的标签。为了回答其他问题，如阿克苏姆指导的机制。
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概述
本文描述了用于标记切线迁移细胞的荧光标记方法和时间跨度成像，以可视化发育中的鸡视觉膝盖中的细胞运动。这些技术允许观察随时间变化的单个和集体细胞迁移。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 神经科学
- 细胞迁移
背景
- 理解神经元细胞迁移在发育生物学中至关重要。
- 荧光标记提供了一种跟踪细胞运动的方法。
- 时间跨度成像增强了对动态过程的观察。
- 本研究以鸡视觉膝盖作为模型系统。
研究目的
- 可视化发育中生物体内迁移细胞的行为。
- 探索神经元细胞迁移的潜在机制。
- 提供长期观察细胞动力学的方法。
使用的方法
- 电穿孔用于细胞的荧光标记。
- 平面培养中的时间跨度成像。
- 使用碱性裂解分离细菌培养。
- 在受控条件下孵化鸡蛋。
主要结果
- 成功标记了切线迁移的细胞。
- 观察到单个和集体细胞迁移。
- 展示了成像技术的有效性。
- 对视觉膝盖中细胞行为的洞察。
结论
- 所描述的方法对研究细胞迁移是有效的。
- 荧光标记结合时间跨度成像提供了宝贵的洞察。
- 这种方法可以应用于其他发育生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables long-term visualization of tangential cell migration in developing neural tissue, supporting mechanistic studies of neuronal development. By capturing both individual and collective cell behaviors, it provides predictive insights into cell motility mechanisms relevant to neurodevelopmental disorder modeling. The approach enhances target validation in early discovery by clarifying migratory pathways and functional dynamics in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing tangential migration patterns in developing optic tectum.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of cell dispersal and nuclear tracking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing omnidirectional migration and temporal trajectory changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening via fluorescently labeled migrating cells.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled flat-mount culture and time-lapse imaging.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse for longitudinal studies of cell displacement and axonal elongation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by modeling developmental cell migration processes.
- Mechanistic Value: Focuses on predictive de-risking through visualization of leading/trailing process dynamics and nuclear migration.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying migratory behavior changes over 28-hour intervals.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of neuronal migration mechanisms prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct visualization of tangential cell migration in chick optic tectum.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized flat-mount culture on cell culture inserts with laminin/poly-L-lysine coating.
- Analytics: Provides quantitative outputs including nuclear trajectory tracking and temporal change analysis using particle tracking plugins.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling developmental processes relevant to neurodevelopmental target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for long-term imaging of cell migration across multiple tissue samples and time points.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in cell migration pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of time-lapse imaging in flat-mount neural tissue cultures.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neurodevelopmental programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative migratory behavior metrics.
Implementation Considerations
- Required expertise in avian embryology, electroporation techniques, and confocal microscopy.
- Instrumentation needs include stereo microscope, micropipette processor, pulse generator, and inverted confocal microscope with laser unit.
- Cross-team standardization requires consistent egg incubation conditions (38°C, 70% humidity) and tissue preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems involve optimizing electroporation parameters and culture insert coating for non-avian species.
- Practical limitations include tissue viability constraints beyond 28 hours and dependency on precise ventricular cavity injection accuracy.
