同时对多个啮齿类动物脑组织进行冷冻切片

这种省时的方法通过将多个大脑组合成一个冷冻组织块，减少了神经科学研究中免疫组织化学实验各轮次之间的差异，从而优化了组织解剖结构、局部蛋白及组织的可视化效果。该技术的主要优势在于缩短了冰冻切片和贴片脑组织所需的时间。尽管该技术主要针对啮齿类动物脑组织的冠状切片进行优化，但也可调整用于矢状切片、横断切片，或其他类型的组织（如肌肉或肝脏）。

成功进行经心脏灌注后，将动物的脑组织置于含有25毫升4%多聚甲醛PBS溶液的容器中后固定24小时。随后，使用钝头镊子将脑组织从多聚甲醛中取出，转移至含有约20毫升TBS配制的30%蔗糖溶液的容器中。

将脑组织和溶液保留，直至它们沉入小瓶底部。接着，将一个500毫升的玻璃烧杯放置在冰桶中盛有干冰的基底上，然后向烧杯中倒入300至400毫升的异戊烷。

将异戊烷温度维持在负45至负50摄氏度之间。在实验台上，取一次性包埋模具，加入约一半体积的OCT包埋剂（Optimal Cutting Temperature compound）。用针头去除模具中的任何气泡。

使用钝头镊子将第一只脑组织从蔗糖溶液中取出。然后使用新的剃刀刀片切除小脑和嗅球，再分离半球。接下来，为脑组织建立数字编号系统。

使用钝头镊子将脑组织拾起并放置于位置二，调整方向使需首先切割的一侧朝上。将脑组织缓慢放入OCT包埋剂中，并用镊子调整其位置，直至能够独立直立。该技术的一个关键改进是在位置一处留出空白区域。

此区域用于方便识别大脑的方向，从而确定每个大脑所对应的动物。待所有大脑均放置于模具中后，加入足够的OCT包埋剂以完全覆盖大脑顶部，然后使用针头去除所有气泡。用镊子夹住模具的一角，确保镊子不会部分浸入OCT中。

然后，将模具放入异戊烷中，使模具底部的三分之一浸没其中。30秒后，将整个模具完全浸入异戊烷，并用镊子松开模具。三分钟后，用镊子将模具从异戊烷中取出。

立即用铝箔包裹模具及其内容物，并做好适当标记。将megabrain转移至-20 °C的冷冻箱中，冷冻至少24小时。首先，将冷冻切片机舱室的温度设置为-19 °C。

从冷冻箱中取出大脑样本，放入冷冻切片机中。然后将样本夹头和两支细头画笔放入冷冻切片机。接着，用大脑样本的编号和玻片编号标记载玻片，并将载玻片放置在玻片加热板上。

接下来，打开megabrain，使用剃刀片切割模具的角落。将一层薄薄的OCT分散到样品台（chuck）上，然后迅速将megabrain放置在样品台上。

待 OCT 完全冻结后，在巨脑组织周围侧面涂上一层 2 毫米厚的 OCT，并使其沿侧面流至样品台底部。使用剃刀刀片去除样品台侧面和底部多余的 OCT。首先，将装有巨脑组织的样品台固定在冷冻切片机的样品头位置上。

然后将切片机设定至所需的切片厚度。根据需要修整OCT包埋剂和组织，以暴露目标脑区用于组织取样。接着降低防卷板，使其贴附在载物台上，转动切片机手柄，切出单个切片。

缓慢取下防卷板，注意不要触碰到组织切片。用画笔轻轻将组织切片展开，直至其完全平铺。如有需要，可用画笔固定OCT包埋剂，防止其卷曲。

然后从载玻片加热板上取下载玻片，将载玻片标签面朝下悬于megabrain切片上方，使其粘附到载玻片上。迅速在组织切片上滴加一滴PBS。用蘸有PBS的细头画笔轻刷组织切片中的气泡，并将组织展开，使其平整地贴附在载玻片上。

最后，将切片置于切片加热板上干燥45分钟，并将切片储存在负80摄氏度条件下。在本实验方案中，同时制备并进行冷冻切片处理来自九只动物的脑组织。完成冷冻切片后，可进行苏木精-伊红（H&E）染色以评估冷冻保护的质量。

小胶质细胞的离子化钙结合接头分子1（Iba1）染色代表性结果表明，在单个大腦切片（megabrain）上，各研究脑组织之间的染色具有一致性。在进行该操作时，重要的是需持续监测大腦切片（megabrain）冷冻过程中的温度，以防止组织出现裂纹，或发生组织解冻后再冻结的情况，这些都会导致组织完整性异常。不建议将不同处理组分别置于不同的大腦切片（megabrain）中，因为这可能在染色过程中引入组间差异，并在成像与分析时增加偏差和主观性。

请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行此操作时必须采取防护措施，例如穿戴个人防护装备（PBE）并在通风橱中操作。