Name: 生态动物的长期视频跟踪: 挪威龙虾 (诺菲氏肾病) 日生物活动的案例研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 学习使用计算机视觉技术对挪威龙虾进行长期视频跟踪的方法。该协议通过简单标签和开源Python工具实现自动化检测，显著缩短分析时间，适用于时间生物学、生态学和神经科学研究。

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作者感谢 Joan B. Company 博士对本研究发表的资助。同时，作者感谢巴塞罗那海洋科学研究所（ICM-CSIC）实验水族区技术人员在实验工作中提供的帮助。
本工作由西班牙科学与创新部（MICINN）资助的RITFIM项目（CTM2010-16274；项目负责人：J. Aguzzi）以及西班牙经济与竞争力部的TIN2015-66951-C2-2-R资助项目支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

通过视频追踪方案获得的性能和代表性结果证实了其在动物行为学应用研究中的有效性，尤其适用于群养动物的社会调节和昼夜节律研究。动物检测效率（69%）和标签识别准确率（89.5%）结合本研究中目标物种的行为特征（如运动速率），表明该方案是长期实验（例如数天至数周）的理想选择。此外，该方案具有操作简便、开发和定制速度快的基本优势，相较于自动学习算法和神经网络等其他技术更具实用性43。本研究所采用的追踪技术是对早期略有不同的实验方法不断优化后的最终成果44。
实验方案中的一个关键步骤是标签设计；应考虑到采用其他标签设计可能会提升大津二值化方法的性能。例如，本文报告的一个误差来源是标签中外圈黑色圆环与内部白色几何形状之间的误检（参见图9，其中显示了一个二值化帧，包含该误差的细节）。可通过增大白色内部几何形状外围黑色圆环的直径（2–3 mm），或交换标签的颜色（白/黑），来改善二值化过程。在尝试纠正此类误差时，我们不建议使用诸如腐蚀或膨胀等图...

近年来，基于图像的自动化追踪技术提供了高度精确的数据集，可用于探索生态学和行为学领域的基本问题1。这些数据集可用于动物行为的定量分析2,3。然而，每种用于动物追踪和行为评估的图像方法都有其优势与局限性。在利用视频中前序帧的空间信息来追踪动物的基于图像的追踪方案中4,5,6，当两只动物的运动路径交叉时，可能引入错误。这类错误通常不可逆，并会随时间推移而累积传播。尽管计算技术的进步已能在一定程度上减轻甚至几乎消除这一问题5,7，但这些技术仍需要均一的实验环境，以实现准确的动物识别与追踪。
在动物中使用可被唯一识别的标记可避免这些错误，并实现对已识别个体的长期追踪。工业和商业领域已广泛使用多种标记（例如，&#160;条形码和二维码），并可通过成熟的计算机视觉技术进行识别，例如增强现实（如 ARTag8）和相机校准（例如，&#160;CALTag9）。此前已有研究将带标记的动物用于多种物种的高通量行为学研究，例如蚂蚁3或蜜蜂10，但部分早期系统并未针对孤立标记的识别进行优化3。
本文介绍的追踪方案特别适用于单通道图像中的动物追踪，例如红外光（IR）或单色光（尤其是蓝光）下的图像。因此，所开发的方法不依赖颜色线索，也可应用于照明条件受限的其他场景。此外，我们使用了定制的标记，设计时确保不会干扰龙虾的行为，同时允许使用低成本相机进行记录。更重要的是，本研究所采用的方法基于帧间独立的标记检测（即.，算法识别图像中每个标记的存在与否时，不依赖于先前的运动轨迹）。这一特性在动物可能暂时被遮挡或其运动轨迹可能发生交叉的应用中尤为重要。
该标签设计可适用于不同类群的动物。一旦设定好方法参数，便可将其推广应用至其他动物追踪问题，而无需训练特定的分类器（例如其他甲壳类或腹足类动物）。该方案在推广时的主要限制在于标签的尺寸，以及需要将其附着于动物体上（因此不适用于果蝇、蜜蜂等小型昆虫），此外还受限于对动物运动的二维假设。这一限制较为显著，因为所提出的方法假设标签尺寸保持不变。在三维环境中自由移动的动物（例如&#160;鱼类），其标签在图像中的尺寸会因其与相机距离的不同而发生变化。
本实验方案的目的是提供一种用户友好的方法，用于在二维环境下长期（即数天或数周）追踪多个标记动物。该方法基于使用开源软件和硬件。自由且开源的软件允许进行适应性调整、修改和自由再分发，因此所生成的软件在每一步都会得到改进11,12。
本文所述方案聚焦于一个实验装置，用于在5天内追踪和评估水箱中四只水生动物的运动活动。视频文件由每秒1帧的时间间隔图像录制而成，并以每秒20帧的速度合成为视频（1天的记录数据约占用1小时的视频时长）。所有视频记录均通过计算机视觉方法和算法进行自动后期处理，以获取动物的位置信息。该方案能够获得大量追踪数据，避免了手动标注，而手动标注在以往的实验研究中已被证明耗时且费力13。
本研究以挪威龙虾（Nephrops norvegicus）为案例，因此我们提供了适合该物种的特定实验室饲养条件。龙虾具有已被深入研究的洞穴出没节律，该节律受昼夜节律钟的调控14,15，当群养时，它们会形成支配等级关系16,17。因此，本文所介绍的模型对于关注社会行为调控、特别是昼夜节律研究的科研人员而言，是一个良好的范例。
本文所述方法易于重复，若可通过个体标记区分动物，则可将其应用于其他物种。在实验室中重复该方法的最低要求包括：(i) 用于实验设置的恒温房间；(ii) 持续的供水系统；(iii) 水温控制装置；(iv) 光照控制系统；(v) 一台USB摄像头和一台普通计算机。
在本方案中，我们使用 Python18 和 OpenCV19（开源计算机视觉库）。我们依赖于快速且广泛应用的操作（无论是在实现还是执行方面），例如背景减除20 和图像阈值化21,22。

<table><tbody><tr><td>三脚架 475</td><td>曼富图</td><td>A0673528</td><td>已停止</td></tr><tr><td>关节臂 143</td><td>曼富图</td><td>D0057824</td><td>已停止</td></tr><tr><td>USB 2.0 uEye LE 相机</td><td>iDS</td><td>UI-1545LE-M</td><td>https://en.ids-imaging.com/store/products/cameras/usb-2-0-cameras/ueye-le.html</td></tr><tr><td>鱼眼镜头 C接口 f = 6 mm/F1.4</td><td>Infaimon</td><td>标准光学&amp;nbsp;</td><td>https://www.infaimon.com/es/estandar-6mm</td></tr><tr><td>玻璃纤维水箱 1500 x 700 x 300 mm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色毛毡织物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>木材结构储罐</td><td></td><td></td><td>5 根木条 50x50x250 mm</td></tr><tr><td>木结构毡织物</td><td></td><td></td><td>10 根木条 25x25x250 毫米</td></tr><tr><td>不锈钢螺钉</td><td></td><td></td><td>根据固定木条结构的需要而定</td></tr><tr><td>PC</td><td></td><td></td><td>2核CPU，4GB内存，1GB显卡，500GB硬盘</td></tr><tr><td>外部存储硬盘驱动器</td><td></td><td></td><td>建议容量为 2 TB</td></tr><tr><td>iSPY Windows PC 软件</td><td>iSPY</td><td></td><td>https://www.ispyconnect.com/download.aspx</td></tr><tr><td>Zoneminder 软件 Linux 个人电脑</td><td>Zoneminder</td><td></td><td>https://zoneminder.com/</td></tr><tr><td>OpenCV 2.4.13.6 库</td><td>OpenCV</td><td></td><td>https://opencv.org/</td></tr><tr><td>Python 2.4</td><td>Python</td><td></td><td>https://www.python.org/</td></tr><tr><td>露营冰盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料托盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯凝胶</td><td></td><td></td><td>粘贴标签&amp;rsquo;s&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1块黑色PVC塑料板（1 mm厚度）</td><td></td><td></td><td>标签的构建</td></tr><tr><td>1 块白色 PVC 塑料板（1 mm 厚度）</td><td></td><td></td><td>标签的构建</td></tr><tr><td>4 标签&amp;rsquo;s &amp;Oslash; 40 mm</td><td></td><td></td><td>用黑色制成 &amp;白色PVC塑料板</td></tr><tr><td>3 m 蓝色斯特林德 LED 光源（480 nm）</td><td></td><td></td><td>防水性能为佳</td></tr><tr><td>3 米红外 Strid LED 光源（850 纳米）</td><td></td><td></td><td>防水性能为理想特性</td></tr><tr><td>6 m&amp;nbsp; 甲基丙烯酸酯管 &amp;Oslash; 15 mm</td><td></td><td></td><td>封闭式斯特里德发光装置</td></tr><tr><td>4 个 PVC 弯头&amp;nbsp; 45&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt; &amp;Oslash; 63 mm</td><td></td><td></td><td>挖掘洞穴的构建</td></tr><tr><td>3 m 柔性聚氯乙烯管 &amp;Oslash; 63 mm</td><td></td><td></td><td>挖掘洞穴的构建</td></tr><tr><td>4 个 PVC 螺口盖 &amp;Oslash; 63 mm</td><td></td><td></td><td>挖掘洞穴的构建</td></tr><tr><td>4 个 O 形圈 &amp;Oslash; 63 mm</td><td></td><td></td><td>挖掘洞穴的构建</td></tr><tr><td>4 个女性PVC插座胶/螺纹 &amp;Oslash; 63 mm</td><td></td><td></td><td>挖掘洞穴的构建</td></tr><tr><td>10 米直流 12V 电缆</td><td></td><td></td><td>光控机制</td></tr><tr><td>直流电源 12 V 300 W</td><td></td><td></td><td>光控机制</td></tr><tr><td>MOSFET，RFD14N05L，N沟道，14 A，50 V，3引脚，IPAK（TO-251）</td><td>RS Components</td><td>325-7580</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>二极管，1N4004-E3/54，1 A，400 V，DO-204AL，2引脚</td><td>RS Components</td><td>628-9029</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>保险丝座</td><td>RS Components</td><td>336-7851</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>2 路电源端子 3.81 mm</td><td>RS Components</td><td>220-4658</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>电容器 220 &amp;micro;F 200 V</td><td>RS Components</td><td>440-6761</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>电阻 2K2 7 W</td><td>RS Components</td><td>485-3038</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>熔断器 6.3 x 32 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 3A</td><td>RS Components</td><td>413-210</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>Arduino Uno Atmel Atmega 328 微控制器板</td><td>RS Components</td><td>715-4081</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>Prototipe Board CEM3,3 孔，RE310S2</td><td>RS Components</td><td>728-8737</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>DC/DC转换器，12 V输入，±5 V输出，100 mA，1 W</td><td>RS Components</td><td>689-5179</td><td>光控机制</td></tr><tr><td>2 支 SERA T8 蓝月光荧光灯管，36 瓦</td><td>SERA</td><td></td><td>已停用/轻度隔离设施</td></tr></tbody></table>

长期共养水生动物的视频追踪：以挪威龙虾（nephrops norvegicus）每日运动活动为例

Long-term Video Tracking of Cohoused Aquatic Animals: A Case Study of the Daily Locomotor Activity of the Norway Lobster (Nephrops norvegicus)

本文介绍了一种基于背景减除和图像阈值分割的视频追踪技术方案，可实现对共养动物的个体追踪。我们利用该追踪程序，在明暗循环条件下连续5天对四只共养的挪威龙虾（Nephrops norvegicus）进行了测试。实验前每只龙虾均已进行个体标记。实验装置及所用追踪技术完全基于开源软件。将自动追踪结果与人工识别进行比较表明，龙虾被正确检测的频率为69%。在被正确检测到的龙虾中，其个体标记被准确识别的比例为89.5%。结合本方案所采用的帧率以及龙虾的运动速度来看，该视频追踪系统具有良好的性能，代表性结果也证实了该方案能够为科研提供可靠数据（如个体空间占用或运动活动模式）。本文所述方案易于定制，因此可推广应用于其他物种，尤其适用于需要对群体中个体进行追踪以回答科学问题的研究场景。

我们手动构建了实验数据的一个子集，以验证自动视频分析的准确性。随机选取了1,308帧作为样本，置信水平为99%（表示样本在误差范围内准确反映总体的可靠性），误差幅度为4%（表示样本结果与总体真实值之间的接近程度的百分比）。随后对每帧中感兴趣区域（ROI）的正确识别以及每个ROI内标签的正确识别进行了人工标注。需要注意的是，单帧图像可能包含数量不定且范围不确定的ROI，因为部分龙虾可能隐藏在洞穴内，或一个ROI中包含两只及以上动物，或存在误检情况。
1,308 帧图像中的动物总数为 3,852 只（人工标注的感兴趣区域）。该方法共检测出 3,354 只动物。其中，701 个检测结果（21%）为假阳性（即龙虾被误认为背景的感兴趣区域数量）。在检测出的动物总数中，2,653 个检测结果（79%）正确匹配.分类器在检测区域中正确识别出龙虾存在的次数；另见 图6a, b...

本文介绍了一种长期对动物个体进行追踪的实验方案。该方法采用计算机视觉技术，通过龙虾作为案例研究对象，识别一组人工构建的标记，同时提供了龙虾的饲养、操作和标记方法的相关信息。

长期共养水生动物的视频追踪：以挪威龙虾（Nephrops norvegicus）每日运动活动为例

我们提出了一种与基于背景减除和图像阈值分割的视频追踪技术相关的实验方案，该技术能够实现……

本方案可实现对多只动物的自动追踪。通过使用简单的标签来识别每只动物，并利用ID分析工具检测这些标签。该方案显著减少了使用leskey数据进行视频记录分析所需的时间。从实验研究中估算出更精确的结果。在其他环境中，只要能够以类似方式标记的动物，均可采用类似的方案进行追踪，从而应用于时间生物学、生态学、病毒学研究或神经科学领域。我们提供了硬件设计和开源编程语言，并提供了一个模型，建议用户在方案中采用该模型来学习 Python 编程语言。为了为目标动物制作标签，首先从黑色塑料板上裁剪出四个直径为40毫米的圆片，并从白色塑料PVC板上裁剪出两个边长为26毫米的等边三角形和两个直径为26毫米的圆片。标记其中一个白色三角形和一个白色圆片的中心，并在每个标记处打一个直径为10毫米的孔。然后将一个白色形状粘贴到每个黑色圆圈的中心。设置实验区域时，将红外暗光LED灯放入水箱中，并始终保持红外灯开启。接下来，将蓝色定时LED灯放入一个装有沙子和四根柔性PVC管洞穴的改良玻璃钢水箱中，并将灯连接至控制光照周期的装置。当所有灯安装完毕后，将冷藏海水进水口置于水箱的一角，相应的出水口置于对角的另一角。检查海水输入的流速是否设置为约4升每分钟。用黑色帘布将实验箱包围，以完全隔绝外部光线。将装有网络摄像头的三脚架放置在实验区域的一侧，使摄像头位于实验区域正上方130厘米处的中心位置。将摄像头连接至帘布外的计算机，并根据物种特性调整视频录制参数，确保在延时视频中生成包含日期的时间戳，以便后续进行行为评分。为了标记动物，将7摄氏度的水加入带有浸没隔间的冰盒中，并将4只龙虾分别放入4个独立的隔间内。让龙虾适应环境约30分钟后，将其中一只转移到盛有碎冰的托盘上，持续5分钟，然后用吸水纸擦干被固定龙虾头胸部的上部区域。在干燥的背甲上滴一滴快干胶，将标签按压在胶水上约20秒，直至胶水固化。然后将龙虾放回冰箱中的相应隔间，并以相同方式标记其余三只动物。当所有龙虾都标记完毕后，将它们放回各自的养殖单元中静置24小时。次日，使用同一冰柜将龙虾从适应性饲养设施转移至实验装置，并开始视频记录。在红光条件下执行标记和转移步骤，以避免光线对龙虾受体造成损伤。其他水生或陆生物种可能不需要此类防护措施。随后，在将动物逐一放入实验水箱各自隔间之前，通过五分钟的视频或前100帧图像获取平均背景图像，并等待龙虾从其隔间中爬出。在此项代表性实验统计的动物总数中，程序正确匹配了79%的动物检测结果，89.5%的标签被准确识别。仅有3.8%的标签被错误分类，而其余6.6%则对应于假阳性结果。在完成特定的视频分析后，所获得的位置数据可用于评估龙虾的不同行为模式。例如，通过使用二维核密度估计，并在由变量对齐的正态核函数生成的方形网格上进行计算，绘制空间占用图，可以利用高颜色强度的图像表示龙虾花费更多时间的区域。龙虾的每日活动节律也可以通过在十分钟时间间隔内随时间变化所移动的毫米距离进行绘图分析。保持尺寸和形状的精确规格非常重要，且始终应在后台执行分箱分析步骤，不显示用户界面。图像分析模型可进一步扩展，以观察甲壳动物的特定组分，从而在动物相互作用方面改进行为学研究。这些复杂的动物社会性相互作用在真实环境中以类似方式发生，使得该方法可用于生物学研究的风格和关键方面，并在生态学和神经科学领域具有一定应用价值。

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