结合组织化学染色与图像分析对甜樱桃子房冬冬期淀粉的定量
2019年3月20日
我们提出了一种方法, 以量化淀粉含量的卵巢原基在冬季休眠期间使用图像分析系统结合组织化学技术。
这种方法可以帮助回答关于木本植物休眠的关键问题，例如为什么花蕾需要在冬季积累寒冷才能正常开花。该技术的主要优点是允许在非常小的花原样品中对淀粉进行定量。这种方法对于检测睡期间花香的生理活性非常有用，也可以应用于其他树种，如杏子或李子。
虽然这种方法可以提供对休眠花蕾的洞察，它也可以应用于其他过程，如生殖阶段从授粉到开花的开始。首先，从现场收集五个拍摄。然后在10毫升玻璃管中称重并固定10个花蕾，用固定溶液在4摄氏度下至少24小时。
在此之后，丢弃固定材料，并添加足够的75%乙醇覆盖样品。获得三个长15至30厘米、直径5毫米的芽，每个芽10个。然后将芽放在水浸花店的泡沫上，放在生长室中。
在生长室10天后，从芽中去除花蕾并称重。每周从秋天开始到春天发芽，评估花蕾的生长。从每个样品中去除外部芽鳞片，然后将每个芽放在含有 75% 乙醇的制表师玻璃杯中。
使用精密钳子和眼科手术刀解剖芽，并获得至少一个花的原芽从每个芽。将样品单独嵌入石蜡中，形成块状物，并将其分在旋转微原子上。分段样品后，在一节上涂抹一滴新鲜的卢戈尔碘。
五分钟后，用印迹纸去除多余的污渍。接下来，涂抹一小滴合成安装介质，在样品上放置一个小盖玻璃，然后用硬按压。安装介质干燥后，在亮场显微镜下观察染色部分。
首先根据文本协议调整光圈隔膜和亮度控制。然后确保滤光片支架中没有过滤器，并在显微镜中选择亮场条件。在此之后，调整相机设置的染色准备没有组织。
将亮度固定为 50% 下一步激活过度曝光/曝光不足功能，并在过度曝光的极限下调整曝光时间。应用白平衡函数和着色校正。测量无组织无污迹制剂的黑白图像的灰色级别。
然后应用 4N 滤镜，获取另一个黑白图像的准备并测量灰度。接下来获取没有光线的相同准备的图像，并测量生成的图像的灰度并进行校准。在此之后，获取分辨率至少为 300 dpi 的 TIFF 格式样本部分的颜色图像。
创建与染色区域对应的二进制图像，然后设置三个颜色阈值，直到二进制图像准确反映染色淀粉颗粒。与其他制剂和组织一起重复此过程，以微调最终检测水平。使用图像分析系统，测量蒙版下每个像素的光学密度之和，以量化现场的淀粉含量。
在该协议中，通过测量10天后在适当条件下的芽体重增加，评估花蕾的生长和休眠状态。在休眠期间，在适当的条件下，10天后未观察到任何变化。一旦休眠被克服，芽膨胀和爆裂在生长室。
卵巢原膜中的淀粉含量通过每个微切分段的图像分析进行量化。一致地，在研究的两年中，早冬淀粉的含量达到4万分之一，最大含量达到12万到14万。考虑到休眠情况，淀粉的最大含量与这两年的寒流同时发生。
重要的是要记住，图像分析器使用的检测级别直接取决于系统的校准。这包括光线条件、污渍强度和显微镜的放大倍率。必须确定此条件，以进行所有准备工作。
将组化学技术与图像分析相结合，对研究花期不同阶段的碳水化合物储备非常有用。它也可以应用于其他物种和组织。使用这种方法在卵巢原体中释放与淀粉积累的关系为理解休眠和冷却需求的生物基础提供了良好的依据。
今后的努力必须集中研究可靠的生物指标，这些指标可以很容易地表明树的休眠状况。同时，随着休眠的淀粉变异模式可用于进一步进行生理和遗传研究。
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概述
本研究提出了一种方法来量化冬季休眠期间甜樱桃（Prunus avium L.）卵巢原基中的淀粉含量。该方法结合图像分析和组织化学技术来评估生理活性。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生理学
- 植物学
- 园艺学
背景
- 了解木本植物的休眠对于园艺实践至关重要。
- 花蕾在冬季积累寒冷以确保正常开花。
- 淀粉定量可以揭示花原基的生理活性。
- 该方法可应用于其他树种，如杏和李。
研究目的
- 量化小样本花原基中的淀粉。
- 研究休眠期间的生理活性。
- 提供从授粉到结果的生殖阶段的见解。
使用的方法
- 从田间收集五根枝条。
- 称重并将10个花蕾固定在固定液中。
- 在4摄氏度下孵育至少24小时。
- 结合组织化学技术进行图像分析。
主要结果
- 该方法允许在非常小的样本中定量淀粉。
- 它检测到休眠期间花原基的生理活性。
- 获得的见解可应用于树种的其他过程。
- 潜在的应用扩展到开花植物的生殖阶段。
结论
- 这种方法增强了对甜樱桃休眠的理解。
- 它为研究木本植物的生理过程提供了宝贵的工具。
- 未来的研究可以扩大其应用到其他物种和阶段。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying starch in small biological structures enables mechanistic de-risking of dormancy-related pathways in plant systems. This approach supports target validation by linking physiological activity to developmental transitions. The method provides predictive confidence for seasonal growth regulation in woody perennials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating starch accumulation with dormancy release in flower primordia.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative assessment of carbohydrate reserves in small tissue samples.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying chilling fulfillment as a key trigger for budburst.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by standardizing starch detection via image analysis.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through fixed calibration of light conditions, stain intensity, and magnification.
- Scalability: Facilitates platform reuse across tree species such as apricot and plum for comparative dormancy studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase starch quantification to reproductive phases from pollination to fruiting.
- Mechanistic De-risking: Links starch dynamics to dormancy status, enabling risk-adjusted advancement decisions in physiological studies.
- Biomarker Alignment: Uses starch content as a translatable indicator of bud dormancy and chilling requirement fulfillment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing on dormancy mechanisms through quantitative starch measurement in ovary primordia.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by measuring starch as a readout of physiological activity during dormancy.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized image analysis that distinguishes starch from background in microtomed sections.
- Analytics: Provides quantitative optical density outputs that allow comparison of starch content across dormancy phases.
- Translational Research: Connects dormancy release to fruiting onset through starch variation patterns applicable to genetic and physiological studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for starch quantification in small floral structures across perennial species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in dormancy mechanisms, reduction of mechanistic ambiguity in bud development.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of starch quantification across species and seasons.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in physiological studies, capital efficiency in dormancy research, reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of chilling requirement studies based on starch accumulation thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histochemical staining, microtomy, and image analysis systems.
- Dependent on brightfield microscopy with calibrated camera settings and fixed illumination conditions.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and binary image thresholds for starch detection.
- Adaptation considerations include tissue fixation, embedding, and sectioning consistency across plant species.
- Practical limitation: Detection levels are dependent on system calibration and must be fixed for all preparations to ensure comparability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Dormancy Determination and Plant Material Collection
1:49
Plant Material Preparation for Starch Quantification
3:07
Quantification of the Starch Content
5:10
Results: Flower Bud Growth and Dormancy Evaluated after 10 Days in Suitable Conditions
6:10
Conclusion
