使用 NETQUANT 对中性粒细胞外陷阱的自动基于图像的定量
2019年11月27日
在这里，我们提出了一个协议，用于生成中性粒细胞外陷阱（NETs）和操作NETQUANT，这是一种用于定量免疫荧光图像中的NET的全自动软件选项。
在这里，我们介绍 NETQUANT，一种全自动的方法，用于量化 NETS 和免疫荧光图像。这将有助于研究人员根据多个用户和条件生成的数据进行可比较的图像分析。该技术的优点是易用性、单细胞数据分析、评估NET形成的多种标准以及对多个图像的公正分析。
安装并打开分析软件。可以在 Zenodo GitHub 存档或诺顿费尔特实验室网站上找到最新版本。在"设置"选项卡中，通过单击源菜单中的 get 路径选项选择源文件夹进行分析。
选择要分析的图像序列的文件夹。同样，单击目标菜单中的 get 路径选项，然后选择目标文件夹以在图像分析后保存数据。接下来，当使用单独的通道图像时，命名通道文件夹，使DNA通道与核DNA染色相对应，NET通道描绘图像中的中性粒细胞弹性酶染色。
此外，将包含控件图像文件的文件夹名称为控件。接下来，单击加载图像信息按钮，将图像元数据加载到软件中。然后在通道顺序子菜单中，选择图像中包含的正确通道顺序。
这有助于防止意外不匹配。现在单击准备数据按钮从原始数据获取主图像属性并转换图像。然后，转换后的图像将显示在示例类型子菜单中。
单击示例类型菜单，从子菜单中选择一个图像，然后单击显示图像数据，以显示分别拆分为 DNA 和中性粒细胞外陷阱或 NET 通道的图像。要将细胞分段到各自的通道中，请选择分段方法选项卡，并在方法子菜单中为 DNA 和 NET 通道选择一个方法。默认的分段方法设置为自适应，是推荐的设置。
软件中还有其他选项，包括全局边缘和 chanverse。还包括了一个分水岭选项，以帮助区分放置紧密的细胞或NET。此外，在分段选项卡中，单击分段控件示例选项。
然后从示例类型子菜单中选择 PMA，然后单击批处理选项，开始分割数据集中包含的所有图像。接下来，选择示例类型菜单中的图像，然后单击显示图像数据按钮，以可视化和验证分割后生成的 DNA 和 NET 蒙版的二进制图像蒙版。现在，在分析选项卡中，单击确定阈值按钮以分析控制样本。
然后，在右侧将样本类型更改为 PMA，然后单击 get 单元格属性按钮以完成对受刺激样本的分析。接下来，从示例类型子菜单中选择一个图像，然后单击显示图像数据按钮以显示图像中的叠加以及单元格数和 NET 成形单元格的数量。首先从示例类型子菜单中选择示例。
可以从样本类型子菜单中选择单个图像进行分析，也可以通过选择批处理选项分析整个图像批次。选择后，单击分析 NETs 按钮以完成分析。手动调整 NET 条件，为给定样本生成最佳结果。
将已识别的 性 性 内与原始图像进行比较，以评估识别质量。完成此步骤后，可以在数据集中的所有图像中应用 NET 条件。对 NET 条件所做的任何更改也同时应用于所有控制示例。
检查单元格数据子菜单中的数据摘要，其中显示图像数、每个图像的单元格数和每个图像的 NET 百分比。输入输出选项卡以选择和查看结果输出。通过选择输出的形式并单击输出结果按钮，探索并比较从控制和 PMA 处理样本分析中生成的各种数据输出。
接下来，启动结果数据表 CSV 文件以探索单单元数据，然后单击结果 PDF 文件以可视化样本中的 NET 区域分布和 DNA 与 NET 比率。红线表示图形中的阈值。最后，单击结果双变量分布文件以确定 DNA 的 NET 区域与形状。
在这里，在10分钟内分析了15张控制性嗜中性粒细胞图像和15张PMA刺激的嗜中性粒细胞图像。使用本文中描述的自动定量方法计算细胞总数，确定具有中性粒细胞外陷阱的细胞百分比。这些结果表明，PMA刺激的嗜中性粒细胞具有较大的面积，核变形的增加，并且与对照样品的DNA与NET比更高。
当组合成 3D 图形时，PMA 刺激的样本往往比对照样本显示紧固分组的区域。在尝试该过程时，必须记住，尽管工作流是使用多个捐赠者测试的，但建议用户根据单个数据集适当地决定软件参数。
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概述
本文介绍了NETQUANT，一种用于在免疫荧光图像中定量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的全自动软件。该工具旨在促进在不同研究条件下进行一致的图像分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 图像分析
背景
- 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在免疫反应中发挥着关键作用。
- 定量检测NETs对于理解其功能及在多种疾病中的意义至关重要。
- 现有的NETs定量方法在不同操作者和实验条件下可能存在不一致性。
- NETQUANT旨在通过自动化手段实现该过程的标准化。
研究目的
- 介绍一种用于定量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的用户友好型软件。
- 使研究人员能够对多幅图像进行无偏分析。
- 促进单细胞数据分析及NET形成的评估。
使用的方法
- 从 Zenodo GitHub 归档或 Nordonfelt 实验室网站安装 NETQUANT 软件。
- 通过软件界面选择用于分析的源文件夹。
- 利用多种标准评估中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。
- 对免疫荧光图像进行自动处理以实现定量分析。
主要结果
- NETQUANT 为 NET 的定量分析提供了一种简化的流程。
- 该软件支持在不同实验条件下进行一致性的分析。
- 研究人员可以从多张图像中获得无偏倚的结果。
- 单细胞数据分析有助于深入理解 NET 的形成机制。
结论
- NETQUANT 是研究人员研究中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的有力工具。
- 该软件提高了免疫荧光研究中图像分析的可靠性。
- 未来的研究可利用此工具对与 NET 相关的现象进行更准确的评估。
常见问题
行业高管相关性
基于图像的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）自动化定量分析，通过实现对NET形成过程的客观、高通量分析，解决了免疫学与炎症研究中的一个关键瓶颈。该技术能力支持针对中性粒细胞介导的通路、炎症性疾病及宿主防御机制的药物研发项目中的靶点验证和机制性风险评估。NETQUANT通过提供单细胞分辨率数据以及标准化的NET识别标准，增强了临床前模型中的预测可信度，并促进了免疫学、成像学与数据科学团队之间的跨职能协作。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在疾病模型中探究与NETosis通路及中性粒细胞功能相关的治疗假设。
- 操作价值：提供具有生物学意义的参数，例如表面积增加、DNA与NET标志蛋白比率以及核形态改变，从而以单细胞分辨率定义NET的形成。
- 预测价值：通过量化PMA等刺激下NET的形成，支持功能性靶点的验证，进而评估化合物对中性粒细胞胞外诱捕网释放的影响。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性：通过从免疫荧光图像生成标准化的定量输出，为下游工作流程准备经过验证的生物系统。
- 可重复性：通过自动阈值确定和批量处理，克服手动和半自动方法的关键局限性，实现在不同用户和实验条件下无偏倚的分析。
- 可扩展性：提供一个免费的应用程序，配备用户友好的图形界面，可在十分钟内处理实验数据集的图像序列，从而实现高通量筛选的准备就绪性和平台的重复使用。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：通过量化中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，支持转化生物标志物的比对，该过程与自身免疫性疾病、癌症转移及血栓性疾病相关。
- 临床前连续性：通过提供定量的因变量测量指标（如形成NET的细胞百分比、NET面积分布），实现对照样本与刺激样本之间的比较，助力基于风险评估的推进决策。
- 机制性降险：通过NET面积与DNA形态的多变量分析，聚焦于预测性降险价值，有助于阐明免疫调节化合物筛选中的作用机制。
流程与工作流整合
NETQUANT 适用于从早期靶点验证到先导化合物发现直至临床前研究的整个发现过程，特别是在 NETosis 作为一种相关病理生理机制的免疫学和炎症相关项目中。
- 发现生物学：通过自动化定量分析基因或药物干预下中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，支持假设验证与信号通路的阐明。
- 筛选：通过自动处理免疫荧光图像、提供定量输出结果以及批量分析功能，描述该检测方法的可应用性，确保不同实验条件下结果的可重复性。
- 分析：突出显示每幅图像中的细胞数量、NET百分比、NET面积分布以及DNA与NET比率等测量指标，帮助研究团队比较不同条件并评估化合物效应。
- 转化研究：将该方法与临床前研究的连续性相连接，通过与疾病相关的NET形成系统分析，揭示其在脓毒症、系统性红斑狼疮及癌症相关血栓形成中的潜在意义。
- 企业级复用：将该方法定位为可重复使用的科研能力，而非一次性技术手段，并提供免费软件，支持跨实验室和项目的标准化应用。
运营与企业影响
- 科学价值：预测置信度、靶点验证，以及降低NETosis通路中的机制模糊性。
- 操作价值：基于图像的NET定量分析在不同用户和实验场所间的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：在以炎症为靶向的药物研发项目中，实现更优的立项/终止决策、资本利用效率提升，以及降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于临床前模型中定量的NET形成数据，进行风险校正后的优先排序和推进决策。
实施注意事项
- 需具备免疫荧光显微镜技术及图像分析原理相关的专业知识。
- 需要配备相应的仪器设备和分析基础设施，包括荧光显微镜及兼容的图像文件格式。
- 跨团队需统一标准，包括通道命名、分割方法以及在对照和刺激样本中中性粒细胞胞外诱捕网（NET）判定标准的应用。
- 在不同模型系统中的适应性考虑，例如人源与小鼠中性粒细胞的差异，以及除佛波酯（PMA）以外的不同刺激条件。
- 源材料所支持的实际局限性：用户必须根据各自的数据集合理设定软件参数，且工作流程的验证可能需要针对特定细胞类型或染色方案进行优化。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Analysis and Quantification of Neutrophil Extracellular Traps (NETs)
2:19
Segmentation of Cells in the DNA Channel and the NET Channel
3:41
Single-cell Analysis of Identifiable Properties
4:19
Comparison of Cell Properties to Identify NET-forming Cells
5:23
Result Outputs Demeanor
6:16
Results: Analysis of NET Formation
7:07
Conclusion
