小鼠肾上腺的分离、固定与免疫荧光成像

免疫荧光是一种基础方法，有助于回答肾上腺领域中关于肾上腺带状分布、细胞身份及功能的关键问题。该技术的主要优势在于可在保持肾上腺组织形态的同时，对多种蛋白质进行研究。切除小鼠肾上腺时，应剪除周围脂肪组织，并将腺体置于含有预冷PBS的24孔板中的一个孔内，冰上保存。

将腺体转移至培养皿或玻璃载片上，在解剖显微镜下使用两根25号针头去除周围的脂肪组织。当所有脂肪组织被完全去除后，将组织置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度条件下轻轻摇动固定2小时。固定结束后，在4摄氏度下用新鲜PBS溶液清洗腺体，每次清洗15分钟，共清洗三次，每次使用1至2毫升PBS。

最后一次洗涤后，在4°C条件下，将腺体依次浸入两份乙醇中进行脱水，每份孵育2小时，期间持续摇动。为准备肾上腺组织的后续处理，用纱布包裹腺体，并将肾上腺放入组织包埋盒中。然后，将包埋盒置于盛有70%乙醇的容器内，于4°C保存，直至进行后续处理。

处理组织时，将包埋盒插入组织处理机中，按照表格所示程序进行处理。程序结束后，将包埋盒转移至装有熔融的65℃石蜡的包埋台上，用镊子小心打开纱布。将肾上腺轻柔地转移至包埋模具底部中央的适当位置，并将熔融的石蜡倒入腺体上。

然后，小心地将包埋模具转移至冷却盘上，以促进石蜡硬化。在使用旋转式切片机切片前，标记一系列显微镜载玻片，并将载玻片放置于37摄氏度的载玻片加温台上。在每张载玻片上加入约450 µL经高压灭菌的I型超纯水，并将切片机的切片厚度设置为5 µm。

将包埋的组织装入切块架，降低石蜡块，直至样本与切片机刀片边缘齐平。以稳定节奏转动手动轮，进行初步修切，去除多余石蜡，暴露出肾上腺组织。随后，使用镊子将肾上腺末端连续切取的5 µm切片逐片转移至预标好的载玻片上的水滴中，每切一片即收集一片。

通过显微镜确认切片中存在组织后，将载玻片置于加热板上干燥约两小时，并在37摄氏度的载玻片架上至少烘烤过夜，直至不再有可见水分。干燥后，将载玻片置于室温下的载玻片盒中保存。进行免疫荧光抗原修复时，先用两次五分钟的100%二甲苯浸泡脱蜡，随后通过梯度乙醇和水浸泡系列进行再水化。

水浸后，将切片转移至金属切片架中，并将切片架放入盛有沸腾的 0.01 摩尔柠檬酸盐缓冲液的烧杯中，在电热板上加热 10 分钟。孵育结束后，将烧杯从电热板上取下，静置冷却 20 分钟，注意确保所有肾上腺组织切片仍被缓冲液覆盖。待烧杯冷却后，将切片转移至 Coplin 染色缸中，用新鲜的 PBS 缓冲液轻轻振荡洗涤三次，每次 10 分钟。

最后一次洗涤后，小心擦拭每张载玻片表面，避免损伤组织切片，并使用疏水性标记笔在每个切片周围画圈。将载玻片置于湿盒中，迅速向每个切片加入至少 50 µL 封闭液，在室温下孵育 1 小时。封闭孵育结束后，用新鲜 PBS 洗涤载玻片三次，每次 5 分钟，置于摇床上轻轻振荡，然后将载玻片放回湿盒中。

接下来，将感兴趣的初级抗体混合液加入各切片中，在4摄氏度下过夜孵育。次日早晨，用新鲜的PBS溶液洗涤样本，每次15分钟，共洗涤三次，并在避光条件下用相应的二抗溶液对切片进行标记，孵育1小时。孵育结束后，在摇床上避光进行三次15分钟的洗涤，最后一次洗涤后，在室温下避光用DAPI对切片的细胞核进行7分钟染色。

在摇床上用 PBS 洗涤三次，每次五分钟，然后在每个样本的盖玻片表面加入 60 微升适用于免疫荧光的封片剂，并将每张载玻片的组织切片面朝下轻轻压在盖玻片上，注意避免产生气泡。随后，将每张载玻片平放于避光容器中，在室温下静置固化至少 24 小时，再进行成像。在脂肪去除过程中，必须注意不要让肾上腺组织干燥，因为脱水会破坏组织结构。

成功去除周围脂肪组织后，肾上腺应清晰可见，无额外可见脂肪。如图所示，对肾上腺组织切片进行免疫染色，可显示肾上腺皮质细胞中类固醇生成因子1（steroidogenic factor one）的核染色、髓质细胞中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）的染色、外层被膜中非类固醇生成细胞的细胞核经DAPI染色，以及皮质细胞与髓质细胞的共染色。在进行该操作时，需注意小鼠肾上腺体积较小，且其位置存在一定变异，因而较难定位。

因此，在解剖过程中必须对操作区域有清晰的视野。这些操作是体内肾上腺研究的基本技术。在此基础上，可进一步开展免疫染色等附加方法，以满足特定的科研需求。

免疫染色技术发展之后，为生物医学领域的研究人员探索蛋白质的原位表达开辟了道路，这一技术已成为许多学科和领域中的重要工具。