Name: 小鼠肾上腺的分离、固定和免疫荧光成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学习小鼠肾上腺分离、固定和免疫荧光染色技术，用于研究肾上腺分区与细胞功能。该方法可保留组织形态，同时检测多种蛋白表达，为内分泌学研究提供重要工具。

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感谢Mohamad Zubair博士在本方案建立过程中提供的有益建议和技术支持。本研究由美国国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所、美国国立卫生研究院研究基金2R01-DK062027（资助给G.D.H）资助。

所有方法均按照密歇根大学动物使用与护理委员会批准的机构规程进行。
1. 手术准备
<ol>
	<li>手术前一天，配制4%多聚甲醛（PFA）/磷酸盐缓冲液（PBS）。若使用冷冻分装样品，需提前解冻一份，并于4 °C保存。 
	注意：4% PFA的稳定性不超过48小时。 
	警告：PFA具有毒性，避免接触皮肤和眼睛，并应弃置于适当的废液容器中。</li>
	<li>手术当天，使用70%乙醇（EtOH）对剪刀和镊子等手术器械进行消毒，并将其置于纸巾上晾干。</li>
	<li>将装有1×PBS（每孔1 mL即可）的24孔板放入冰桶中。 
	注意：肾上腺组织在手术后将保存于该多孔培养板中。</li>
</ol>
2. 肾上腺解剖分离
<ol>
	<li>根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的标准方案对小鼠实施安乐死。需采用第二种辅助安乐死方法以确认动物死亡（例如断头）。
	<ol>
		<li>若采用异氟烷过量法进行安乐死，将小鼠置于充满异氟烷蒸气的密闭舱内，直至呼吸停止，随后将小鼠移出密闭舱，平放在操作台面上并实施颈椎脱位。 
		注意：大多数安乐死方法会引起动物应激反应，因此不适用于应激相关研究，因为这些方法可能引入垂体-肾上腺轴激活和髓质儿茶酚胺释放等混杂变量。在此类研究中，建议采用断头法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，用70%乙醇对腹部及侧腹部的手术区域进行消毒。 
	注意：虽然剃除毛发可提高无菌性，但在此特定操作中并非必需。</li>
	<li>使用剪刀在腹部正中切开皮肤，分离皮肤与腹膜，通过捏住切口周围的皮肤并向头侧和尾侧两个相反方向拉扯以去除皮肤。随后剪开腹膜，直至暴露后部左右侧腹区域。</li>
	<li>围绕肾上腺周围的脂肪组织进行剪切，完整取出小鼠肾上腺，并将其置于盛有1×PBS并置于冰上的24孔板中。</li>
</ol>
3. 肾周脂肪去除
<ol>
	<li>在解剖显微镜下，将肾上腺置于载物台上的玻璃底面或培养皿中，调整光源位置，选择适当的放大倍数并调节焦距，以获得整个肾上腺的清晰视野。 
	注意：放大倍数可根据个人偏好进行调整。使用1倍物镜、3倍变焦和10倍目镜时，总放大倍数为30倍，可实现观察&#160;视野良好地观察整个腺体。</li>
	<li>用两根25 G针头快速去除肾上腺周围的脂肪组织，注意避免肾上腺脱水。如果在脂肪完全去除前发生脱水现象，可将肾上腺移回含有1x PBS的孔中浸泡1–2分钟，然后继续进行脂肪组织的清除操作。</li>
	<li>用1×PBS洗涤2次，每次2分钟。</li>
</ol>
4. 组织处理与包埋
<ol>
	<li>将组织置于4%多聚甲醛/PBS中，在4 °C条件下于摇床上固定2小时。</li>
	<li>去除4%多聚甲醛，用1× PBS洗涤组织，在4 °C条件下每次15分钟，共洗涤3次。 
	注意：多聚甲醛具有毒性，属于危险废物，应在通风橱内小心操作，并放入危险废物容器中处理。</li>
	<li>将肾上腺组织置于50%乙醇中，在4 °C条件下于摇床上孵育2小时。</li>
	<li>将肾上腺组织置于70%乙醇中，在4 °C条件下于摇床上孵育至少2小时。 
	备注：若暂不进行包埋前组织处理，可将肾上腺组织保存在4 °C的70%乙醇中。应避免长期保存于70%乙醇中，并尽快进行组织处理，以获得更高质量的样本。</li>
	<li>将肾上腺组织用纱布包裹后放入组织包埋盒中，以准备后续组织处理。将包埋盒放入盛有70%乙醇的容器中，于4 °C保存，直至准备上机进行组织处理。将包埋盒插入组织处理机中，并按照表1中设定的程序运行。</li>
	<li>将包埋盒转移至装有65 °C熔融石蜡的包埋工作站中。若无专用冷却台，可在其旁放置一个冷的冷却托盘。</li>
	<li>标记一个包埋模具，打开组织包埋盒。使用镊子小心解开纱布，将肾上腺轻柔地置于包埋模具底部中央的所需位置。将熔融石蜡倒入模具覆盖肾上腺组织。如有必要，可用镊子固定肾上腺位置，防止其在模具内移动。</li>
	<li>将包埋模具轻轻移至冷却托盘，等待石蜡完全凝固。完成后，为便于切片，应将包埋模具存放在阴凉处。</li>
</ol>
5. 使用旋转式切片机进行切片
<ol>
	<li>开始操作前检查切片机是否清洁，刷去所有废弃的石蜡残留物，确保刀片（或刀刃）已磨利，对内部机械结构进行润滑，必要时完全缩回组织块夹持器。</li>
	<li>标记一系列显微镜载玻片（使用带正电荷或涂层的载玻片以防止组织脱落（参见材料表）），将其平放在设定为 37 °C 的载玻片加热台上，并在每张载玻片表面滴加适量经高压灭菌的 I 型超纯水。</li>
	<li>将切片厚度设置为 5 µm。</li>
	<li>将切片刀片插入刀片夹持器中，调节刀片角度，确保刀片牢固固定在夹持器内，并检查石蜡块与夹持器之间的间隙。</li>
	<li>将组织块夹持器升至最高位置，如有可能，锁定操作手柄，从模具中取出石蜡包埋块，并用夹具将其牢固固定在夹持器中。刀片中心线与石蜡块表面之间的夹角应约为 20°。如有必要，重新调整石蜡块的位置。 
	注意：刀片锋利，操作需谨慎。</li>
	<li>如之前已锁定，解锁手轮并将石蜡块降低，使其切面与切片机刀片边缘齐平。以稳定节奏旋转手轮，进行初步修片以去除多余石蜡，暴露出肾上腺组织。</li>
	<li>持续旋转手轮进行切片，直至&#160;肾上腺组织完全切完。使用明场显微镜或解剖显微镜检查切片中是否存在组织。将切下的切片带从刀片上取下，借助另一把镊子将其放置在载玻片表面的水滴上。可先将切片带置于平面上小心拉展，再转移至载玻片上，有助于展平。</li>
	<li>将载玻片放在加热板上干燥，随后平放于载玻片架中，在 37 °C 下烘烤过夜或更长时间，直至水分完全蒸发。干燥后，将载玻片存放在室温下的载玻片盒中。</li>
	<li>收好所有使用过的设备，并清洁切片机。</li>
</ol>
6. 免疫荧光
<ol>
	<li>选择用于免疫染色的切片，并将其放入切片架中。</li>
	<li>在加热板上将装有 pH 2.0 的 0.01 M 枸橼酸缓冲液的烧杯加热至沸腾。缓冲液体积取决于烧杯大小，需足以覆盖切片上的组织部分（需考虑部分液体蒸发）。用铝箔覆盖烧杯。 
	注意：其他抗原修复方法也可使用（见讨论部分）。</li>
	<li>用 100% 二甲苯对切片进行脱蜡处理，每次 5 分钟，重复 2 次。然后按以下顺序水化切片：100% 乙醇 2 次，每次 5 分钟；70% 乙醇 2 次，每次 5 分钟；一级超纯水 5 分钟。 
	注意：脱蜡后切勿让组织切片干燥：在整个操作结束前，组织切片必须始终被缓冲液或溶液覆盖，否则可能导致组织结构受损。</li>
	<li>进行抗原修复时，将切片放入金属切片架中，移除铝箔后插入盛有沸腾枸橼酸缓冲液的烧杯中，持续煮沸 10 分钟。</li>
	<li>将烧杯从加热板上取下，静置冷却 20 分钟。确保肾上腺组织切片仍被缓冲液覆盖。</li>
	<li>配制封闭液。若使用代表性结果中所用的商用染色试剂盒（见材料表），在离心管中加入 1.25 mL 1x PBS、1 滴（约 45 µL）小鼠 Ig 封闭试剂和 5% 正常山羊血清。操作过程中将封闭液保存在 4 °C 或冰上。 
	注意：所用血清种类取决于二抗的宿主物种。本实验中使用的二抗由山羊产生。对于其他抗体，可能需要不同浓度的血清。可通过测试多个浓度，经验性地确定最佳血清浓度。</li>
	<li>将切片转移至盛有 1x PBS 的柯林瓶（Coplin jar）中，在摇床上轻轻振荡，每次洗涤 10 分钟，重复 3 次。</li>
	<li>准备一个湿化染色盒用于染色。</li>
	<li>轻轻甩去一张切片上的 PBS，并用无绒布擦拭切片底部以去除多余液体。</li>
	<li>使用具有疏水特性的专用切片标记笔，在每张肾上腺组织切片周围画出圆圈，确保玻璃表面干燥，以避免墨水扩散至组织区域。如有必要，仔细擦干表面。将切片放入湿化染色盒中。</li>
	<li>迅速用移液器将 50 µL（或足以覆盖组织）的封闭液滴加至每个组织区域，室温孵育 1 小时。 
	注意：所需封闭液体积可能有所不同；重要的是确保组织区域被充分覆盖。</li>
	<li>使用商用试剂盒中的稀释液，加入 7.5 mL 1x PBS、600 µL 蛋白浓缩原液和 5% 正常山羊血清（或其他在封闭液中使用的血清及浓度）配制稀释液。操作过程中将稀释液保存在 4 °C 或冰上。</li>
	<li>将一抗按适当浓度用稀释液稀释，配制一抗溶液。若进行共染，将每种一抗的等分试样加入新离心管中，轻轻混匀。将抗体及抗体溶液置于冰上，待用。 
	注意：本实验中使用兔源抗 SF1 抗体和鼠源抗 TH 抗体。请按照说明配制抗体工作液。
	<ol>
		<li>SF1 工作液配制：在一离心管中，将 1 µL 抗 SF1 抗体加入 999 µL 稀释液中（终浓度为 1.5 µg/mL）。TH 工作液配制：在一离心管中，将 1 µL 抗 TH 抗体加入 499 µL 稀释液中（估计终浓度为 2–6 µg/mL）。</li>
		<li>SF1 + TH 抗体混合工作液配制：取一新离心管，加入 250 µL SF1 工作液和 250 µL TH 工作液，用移液器轻轻混匀，置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片转移至盛有 1x PBS 的柯林瓶中，在摇床上轻轻振荡，每次洗涤 5 分钟，重复 3 次。</li>
	<li>擦去多余 PBS 后，将切片放回湿化染色盒中，迅速滴加 SF1 + TH 抗体混合工作液（或其他一抗溶液）至每个组织区域，盖好湿化染色盒，于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>次日，将切片转移至盛有 1x PBS 的柯林瓶中，在摇床上轻轻振荡，每次洗涤 15 分钟，重复 3 次。</li>
	<li>在洗涤切片的同时，用稀释液配制适当浓度的二抗溶液。若进行共染，将等量的每种二抗溶液加入新离心管中，用移液器轻轻混匀。避光保存于冰上，待用。 
	注意：本实验中使用的二抗为山羊抗小鼠 IgG 偶联 488 nm 荧光染料和山羊抗兔 IgG 偶联 549 nm 荧光染料。二抗溶液的配制方法为：将每种二抗各 0.5 µL 加入 799 µL 稀释液中（终浓度为 1.2 µg/mL）。</li>
	<li>去除多余 PBS 后，将切片放回湿化染色盒中，迅速滴加二抗溶液至肾上腺组织区域，盖好染色盒并避光，室温孵育 1 小时。</li>
	<li>将切片放入盛有 1x PBS 的柯林瓶中，在摇床上轻轻振荡，每次洗涤 15 分钟，重复 3 次，全程避光。</li>
	<li>配制用于细胞核染色的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液：将 1 µL DAPI（20 mg/mL）加入 1 mL 1x PBS 中。 
	注意：也可使用 Hoechst 染料实现蓝色荧光核复染。</li>
	<li>将 DAPI 溶液滴加至肾上腺组织区域，避光，室温孵育 7 分钟。</li>
	<li>将切片放入盛有 1x PBS 的柯林瓶中，在摇床上轻轻振荡，每次洗涤 5 分钟，重复 3 次，全程避光。</li>
	<li>在避光区域平放一张盖玻片，沿其表面滴加 60 µL 或约 3 滴适用于免疫荧光的封片剂。</li>
	<li>用无绒布轻轻擦拭切片背面，将切片正面朝下、与盖玻片平行放置，使组织面朝向含封片剂的盖玻片。轻压切片与盖玻片，确保两者之间无气泡残留。
	<ol>
		<li>如有必要，可施加额外压力以排除气泡和多余封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片平放于避光容器中，室温固化至少 24 小时（或根据所用封片剂说明书推荐时间），随后进行成像。</li>
</ol>
7. 成像
注意：检测和采集组织在特定波长激发后发出的荧光，需要配备相机的荧光显微镜。尽管显而易见，但仍需牢记应选择与现有设备的激发和发射光谱相匹配的荧光染料标记的二抗。成像参数设置因所用显微镜及图像采集软件的不同而有所差异。 adrenal 组织切片成像时需遵循一些基本规则，例如保持曝光时间、相机增益设置和光源强度恒定。
<ol>
	<li>打开光源和相机，按照制造商的说明启动成像软件。 
	注意：这些操作的顺序可能因所用设备的不同而有所差异。</li>
	<li>将载玻片固定在载物台上，打开快门，通过显微镜目镜观察，使用核染色（DAPI）通道和低倍率（4X）物镜识别载玻片上的组织：肾上腺切片较小，其观察可能需要一定时间。</li>
	<li>切换至更高倍数（10X），调焦并关闭快门。 
	注意：应避免在光照下进行不必要的长时间曝光，以免造成光漂白，导致信号丢失。</li>
	<li>使用软件命令选择物镜（10X）和正在使用的通道（DAPI），调整曝光时间（1 s，可根据信号强弱进行调整）。如有条件，在实时成像（非图像采集）时将像素合并（binning）设置为“2 × 2”，转换增益设为“mid”，读出速度设为“20 MHz”。如果所用软件在成像结束后不显示比例尺，请从菜单中选择比例尺选项，并将其放置在所需位置。</li>
	<li>打开快门，必要时重新调整焦距，并切换通道（FITC、TRITC、DAPI）。若显微镜未自动化，需在不移动载物台的情况下，依次在各通道下拍摄肾上腺图像，并确保正确选择当前使用的通道。完成后关闭快门。 
	注意：请记录所使用的设置，以防软件未自动保存。</li>
	<li>保存图片。 
	注意：合并图像通常可使用显微镜自带软件或其他图形编辑软件完成。</li>
	<li>对切片的其他区域重复成像和/或使用更高倍镜进行成像。 
	注意：20倍放大通常需要更短的曝光时间（即， 800 毫秒。</li>
	<li>成像结束后，按正确顺序关闭所有设备。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种分离小鼠肾上腺的方法，以及对切片并包埋于石蜡中的小鼠肾上腺进行制备和染色的步骤。
与其他我们测试过的方案相比，该免疫荧光方案已证明适用于本实验室使用的大多数抗体。然而，在某些情况下，可能需要进行一些调整以改善染色效果。其中一个易于修改和测试的变量是固定时间。在本实验室中，4%多聚甲醛的孵育时间可在1小时至4小时之间变化，而其他实验室的固定时间可延长至12–24小时16。但在我们的实践中，较长的固定时间会导致背景噪音增加，对本研究中常规使用的多种抗体并不理想。
抗原修复的pH值也可能影响染色的成功。热诱导表位修复（HIER）可使用市售的从酸性到碱性不同pH值的溶液进行，也可使用实验室自制的缓冲液，如柠檬酸盐缓冲液（pH 6）、乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8）、Tris-EDTA（pH 9）、Tris（pH 10）。酶消化处理也可作为抗原暴露的一种选择。将脱蜡切片与含有适当浓度酶（例如蛋白酶K）的溶液孵育一定时间，可作为HIER的替代方法。然而，必须对酶的浓度进行滴...

免疫组织化学是一种利用针对细胞内特定分子的抗体，并结合后续染色技术来检测组织成分的方法1。该免疫组织化学实验流程需要对组织进行特定的固定和处理，这些条件通常根据所使用的特定抗原、组织类型和抗体通过经验确定2。固定对于保持组织的&#34;原始&#34;状态至关重要，从而确保细胞和亚细胞结构以及表达模式的完整性。此外，还需进行进一步的处理和包埋操作，以制备可用于免疫组织化学等组织学研究的薄切片。
免疫染色可采用显色或荧光检测方法。显色检测需要利用酶将可溶性底物转化为不溶性的有色产物。虽然该酶可直接与识别抗原的一抗相连，但更常见的是将其连接至识别一抗的二抗上即，二抗）。该技术灵敏度高，酶促反应产生的有色产物具有光稳定性，成像仅需使用明场显微镜即可。然而，当需要同时观察两种共定位蛋白时，显色免疫染色可能并不适用，因为一种颜色的沉积可能会掩盖另一种颜色的沉积。在此类共染色情况下，免疫荧光技术已被证明更具优势。免疫荧光技术的诞生归功于 Albert Coons 及其同事，他们开发出一种利用荧光素标记抗体识别组织抗原的系统，并可在紫外光下观察切片组织中的荧光信号。3荧光检测基于与荧光染料偶联的抗体，该抗体在激发后会发射光信号。由于存在多种在不同波长处发射光信号（无或仅有少量重叠）的荧光染料，该检测方法非常适合用于多种蛋白质的研究。
肾上腺是一对位于肾脏上方的器官，由间充质包膜包裹，具有两个胚胎起源不同的组成部分。外层的肾上腺皮质起源于中肾的中胚层，负责分泌类固醇激素；而内层的髓质起源于神经嵴，产生儿茶酚胺类物质，包括肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺。肾上腺皮质在组织学和功能上可分为三个同心环状区域，每个区域分泌不同类别的类固醇激素：最外层的球状带（zG）分泌调节电解质稳态和血管内容量的盐皮质激素；位于球状带下方的中间束状带（zF）分泌糖皮质激素，通过动员能量储备来升高血浆葡萄糖，从而介导应激反应；最内层的网状带（zR）则合成性类固醇前体（即脱氢表雄酮（DHEAS））4。
不同物种之间的肾上腺皮质带状结构存在差异：例如，Mus musculus 缺乏网状带（zR）。M. musculus 所特有的出生后X带是胎儿皮质的残余结构，其特征为含有嗜酸性细胞质、脂质含量较少的小细胞5。X带在雄性小鼠青春期时消失，在雌性小鼠首次妊娠后消失，或在未繁殖的雌性小鼠中逐渐退化6,7。此外，球状带（zG）的扭曲程度和厚度在不同物种间表现出显著差异，围绕zG的外周干细胞和前体细胞的组织方式也存在种间差异。与其他啮齿类动物不同，大鼠在zG与束状带（zF）之间存在一个可见的未分化区（zU），该区域发挥干细胞区和/或短暂扩增前体细胞区的功能。目前尚不清楚zU是大鼠所特有的结构，还是仅是细胞组织更为明显的细胞群集8,9。
肾上腺皮质细胞含有储存胆固醇酯的脂滴，胆固醇酯是所有类固醇激素的前体物质10,11.&#160; 术语 &#34;类固醇生成&#34; 定义了从胆固醇合成类固醇激素的过程 通过 一系列涉及类固醇生成因子1（SF1）活性的酶促反应，其中SF1的表达是类固醇生成潜能的标志物。在肾上腺中，Sf1的表达仅存在于皮质细胞中12一项有趣的研究发现，具有类固醇生成潜能的肾上腺皮质细胞中存在内源性生物素的表达13尽管这可能导致基于生物素/链霉亲和素的染色方法中背景信号升高（由于链霉亲和素偶联的抗体检测到内源性生物素），但这一特性也可用于区分肾上腺中的类固醇生成细胞与其他细胞群体。 即， 内皮、被膜和髓质细胞。
肾上腺髓质受交感节前神经元支配，其特征为具有嗜碱性细胞，胞质内含有颗粒，颗粒中富含肾上腺素和去甲肾上腺素。由于这些细胞含有大量儿茶酚胺，氧化后可形成棕褐色色素，因此被称为&#34;嗜铬细胞&#34;14。酪氨酸羟化酶（TH）是催化儿茶酚胺合成限速步骤的酶，在肾上腺中仅表达于髓质15。
本文介绍了一种分离小鼠肾上腺、将其处理并包埋于石蜡中进行切片，以及在肾上腺切片上进行免疫荧光染色以鉴定构成肾上腺皮质和髓质的细胞类型的实验方案。该方案是本实验室常规用于多种抗体免疫染色的标准方法。

<table><tbody><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>一次性针头 25G × 5/8&quot;</td><td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus&amp;nbsp;</td><td>McCormik scientific</td><td>39502004</td><td>用于组织包埋的石蜡</td></tr><tr><td>Shandon 带盖活检盒 II</td><td>Thermo scientific</td><td>1001097</td><td>用于组织处理的包埋盒</td></tr><tr><td>高剖面切片机刀片</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>一次性不锈钢刀片</td></tr><tr><td>Peel-a-way 一次性塑料组织包埋模具</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986</td><td>截断式，顶部22 mm正方形，底部锥形至12 mm</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>75 mm × 25 mm × 1 mm</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5P1GAL&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Certi-Pad 纱布垫&amp;nbsp;</td><td>Certified Safety Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3&quot; × 3，无菌无乳胶纱布垫</td></tr><tr><td>M.O.M 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>用于检测小鼠组织上的小鼠一抗</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>擦拭纸 4.4 英寸 × 8.4 英寸</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>00-8899</td><td>用于在载玻片上划界的笔</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>尺寸：22 × 50 × 1.5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542&amp;nbsp;</td><td>（配制成20 mg/mL储备液）</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Molecular Probes</td><td>P36930</td><td>免疫荧光封片剂</td></tr><tr><td>X-cite series 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>光源</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Photometrics</td><td></td><td>相机</td></tr><tr><td>Optiphot-2&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>切片机</td><td>American Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织包埋仪</td><td>Leica</td><td>EG1150 H&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>组织脱水机&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗TH抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB318</td><td>一抗</td></tr><tr><td>兔抗SF1抗体</td><td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td><td>&amp;nbsp;custom made</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Alexa-488 标记的山羊抗小鼠IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003&amp;nbsp;</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Dylight-549 标记的山羊抗兔IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>二抗</td></tr><tr><td>无水柠檬酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Basic Research&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>成像软件</td></tr></tbody></table>

小鼠肾上腺的分离、固定与免疫荧光成像

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

免疫荧光是一种利用荧光素标记抗体检测组织中抗原的成熟技术，具有广泛的应用范围。抗原的检测可用于多种细胞类型的表征与鉴定。肾上腺位于肾脏上方，外包一层间充质细胞，是一种内分泌器官，由两种具有不同胚胎起源的组织构成：外层皮质起源于中肾的中胚层，内层髓质则起源于神经嵴。肾上腺皮质分泌类固醇激素（即， 盐皮质激素、糖皮质激素、性激素），而肾上腺髓质则产生儿茶酚胺（即， 肾上腺素，去甲肾上腺素）。在进行肾上腺研究时，能够区分具有不同功能的特异性细胞至关重要。本文提供了本实验室开发的一种实验方案，描述了一系列用于获得免疫荧光染色以鉴定肾上腺细胞类型的连续操作步骤。我们首先聚焦于小鼠肾上腺的解剖，显微镜下剔除肾周脂肪组织，随后进行组织固定、处理及石蜡包埋。接着介绍使用旋转式切片机对组织块进行切片。最后，我们详细阐述了本实验室建立的肾上腺组织免疫荧光染色方案，旨在最大限度减少非特异性抗体结合和自发荧光，以获得最佳信号。

图1 展示了上述完整实验方案的示意图。从小鼠中取出肾上腺，于解剖显微镜下去除周围的脂肪组织，随后将肾上腺在4%多聚甲醛（PFA）中固定。此步骤完成后，对肾上腺进行处理并包埋于石蜡中，再用切片机将组织切成薄片，并转移至显微镜载玻片上。切片干燥后，进行免疫荧光染色，随后在显微镜下成像。
去除周围的脂肪组织（图2A）对于后续肾上腺的处理和切片至关重要。成功去除周围脂肪组织的示例如图2B所示，此时肾上腺清晰可辨，无多余脂肪残留。然而，在此步骤中必须注意避免肾上腺干燥，否则可能破坏组织结构。当肾上腺出现皱缩外观时，表明已发生干燥（图2C</strong...

本文介绍一种从小鼠中分离肾上腺组织、固定组织、切片并进行免疫荧光染色的方法。

免疫荧光是一种成熟的技术，通过使用荧光染料偶联的抗体来检测组织中的抗原，且已……

免疫荧光是一种基础方法，有助于回答肾上腺领域中关于肾上腺带状分布、细胞身份及功能的关键问题。该技术的主要优势在于可在保持肾上腺组织形态的同时，对多种蛋白质进行研究。切除小鼠肾上腺时，应剪除周围脂肪组织，并将腺体置于含有预冷PBS的24孔板中的一个孔内，冰上保存。将腺体转移至培养皿或玻璃载片上，在解剖显微镜下使用两根25号针头去除周围的脂肪组织。当所有脂肪组织被完全去除后，将组织置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度条件下轻轻摇动固定2小时。固定结束后，在4摄氏度下用新鲜PBS溶液清洗腺体，每次清洗15分钟，共清洗三次，每次使用1至2毫升PBS。最后一次洗涤后，在4°C条件下，将腺体依次浸入两份乙醇中进行脱水，每份孵育2小时，期间持续摇动。为准备肾上腺组织的后续处理，用纱布包裹腺体，并将肾上腺放入组织包埋盒中。然后，将包埋盒置于盛有70%乙醇的容器内，于4°C保存，直至进行后续处理。处理组织时，将包埋盒插入组织处理机中，按照表格所示程序进行处理。程序结束后，将包埋盒转移至装有熔融的65℃石蜡的包埋台上，用镊子小心打开纱布。将肾上腺轻柔地转移至包埋模具底部中央的适当位置，并将熔融的石蜡倒入腺体上。然后，小心地将包埋模具转移至冷却盘上，以促进石蜡硬化。在使用旋转式切片机切片前，标记一系列显微镜载玻片，并将载玻片放置于37摄氏度的载玻片加温台上。在每张载玻片上加入约450 µL经高压灭菌的I型超纯水，并将切片机的切片厚度设置为5 µm。将包埋的组织装入切块架，降低石蜡块，直至样本与切片机刀片边缘齐平。以稳定节奏转动手动轮，进行初步修切，去除多余石蜡，暴露出肾上腺组织。随后，使用镊子将肾上腺末端连续切取的5 µm切片逐片转移至预标好的载玻片上的水滴中，每切一片即收集一片。通过显微镜确认切片中存在组织后，将载玻片置于加热板上干燥约两小时，并在37摄氏度的载玻片架上至少烘烤过夜，直至不再有可见水分。干燥后，将载玻片置于室温下的载玻片盒中保存。进行免疫荧光抗原修复时，先用两次五分钟的100%二甲苯浸泡脱蜡，随后通过梯度乙醇和水浸泡系列进行再水化。水浸后，将切片转移至金属切片架中，并将切片架放入盛有沸腾的 0.01 摩尔柠檬酸盐缓冲液的烧杯中，在电热板上加热 10 分钟。孵育结束后，将烧杯从电热板上取下，静置冷却 20 分钟，注意确保所有肾上腺组织切片仍被缓冲液覆盖。待烧杯冷却后，将切片转移至 Coplin 染色缸中，用新鲜的 PBS 缓冲液轻轻振荡洗涤三次，每次 10 分钟。最后一次洗涤后，小心擦拭每张载玻片表面，避免损伤组织切片，并使用疏水性标记笔在每个切片周围画圈。将载玻片置于湿盒中，迅速向每个切片加入至少 50 µL 封闭液，在室温下孵育 1 小时。封闭孵育结束后，用新鲜 PBS 洗涤载玻片三次，每次 5 分钟，置于摇床上轻轻振荡，然后将载玻片放回湿盒中。接下来，将感兴趣的初级抗体混合液加入各切片中，在4摄氏度下过夜孵育。次日早晨，用新鲜的PBS溶液洗涤样本，每次15分钟，共洗涤三次，并在避光条件下用相应的二抗溶液对切片进行标记，孵育1小时。孵育结束后，在摇床上避光进行三次15分钟的洗涤，最后一次洗涤后，在室温下避光用DAPI对切片的细胞核进行7分钟染色。在摇床上用 PBS 洗涤三次，每次五分钟，然后在每个样本的盖玻片表面加入 60 微升适用于免疫荧光的封片剂，并将每张载玻片的组织切片面朝下轻轻压在盖玻片上，注意避免产生气泡。随后，将每张载玻片平放于避光容器中，在室温下静置固化至少 24 小时，再进行成像。在脂肪去除过程中，必须注意不要让肾上腺组织干燥，因为脱水会破坏组织结构。成功去除周围脂肪组织后，肾上腺应清晰可见，无额外可见脂肪。如图所示，对肾上腺组织切片进行免疫染色，可显示肾上腺皮质细胞中类固醇生成因子1（steroidogenic factor one）的核染色、髓质细胞中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）的染色、外层被膜中非类固醇生成细胞的细胞核经DAPI染色，以及皮质细胞与髓质细胞的共染色。在进行该操作时，需注意小鼠肾上腺体积较小，且其位置存在一定变异，因而较难定位。 因此，在解剖过程中必须对操作区域有清晰的视野。这些操作是体内肾上腺研究的基本技术。在此基础上，可进一步开展免疫染色等附加方法，以满足特定的科研需求。免疫染色技术发展之后，为生物医学领域的研究人员探索蛋白质的原位表达开辟了道路，这一技术已成为许多学科和领域中的重要工具。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠肾上腺的分离、固定和免疫荧光成像

肾上腺髓质嗜铬细胞培养系统对于在体外研究兴奋-分泌耦联极为有用。本方案展示了如何解剖肾上腺，并通过剥离肾上腺皮质来分离髓质区域。随后演示了将髓质组织消化为单个嗜铬细胞的过程。...

小鼠肾上腺嗜铬细胞分离

本视频展示了一种使用同一宿主物种来源的一抗进行多重免疫染色的实验方法。该方法中，肾上腺组织切片经历两步免疫染色过程：首先，切片用特异性识别皮质标记物的抗体进行染色；随后，去除已结合的抗体，再用特异性识别髓质标记物的抗体重新染色。...

使用同一种宿主来源的一抗进行多重免疫染色的方法

通过空间调制多焦点双光子显微镜的激发模式，可在成年小鼠淋巴结中实现高达120 µm深度的高分辨率活体成像，并增强对比度。在100 µm深度处，测得的分辨率为487 nm（横向）和551...

高分辨率活体条纹照明显微成像技术观察生发中心

胞吐作用后，融合的质膜通过一种称为内吞作用的过程被回收。该机制可重新形成新的突触小泡，以供下一轮释放使用。通过在小鼠肾上腺嗜铬细胞中采用细胞贴附式电容记录技术，可捕获并分析单个内吞事件。...

小鼠肾上腺嗜铬细胞膜电容细胞贴附式测量方法

本文所述的间接免疫荧光实验方案可用于检测和定位小鼠乳腺组织中的蛋白质。文中提供了完整的实验方法，包括乳腺组织样本的制备、免疫组织化学染色、荧光显微镜下组织切片的成像，以及图像的重建。...

小鼠乳腺组织冰冻切片的间接免疫荧光染色

我们介绍了一种分离和培养小鼠中肾管（WD）的方法。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体对培养后或新鲜分离的中肾管进行整体免疫染色的详细操作步骤。这些技术相结合，可实现对中肾管发育、盘绕及分化过程的研究。...

小鼠中肾管的器官培养与整体免疫荧光染色

我们介绍一种从发育中的小鼠分离垂体并制备垂体冠状切片的实验方案。...

小鼠发育期垂体的分离与冠状切片制备

已建立多种不同方法，用于在同一宿主物种来源的初级抗体基础上进行多重免疫染色。本文描述了在甲醛固定石蜡包埋的小鼠肾上腺切片上进行多重免疫染色时，采用微波介导的抗体剥离以及荧光素-酪胺来阻断抗体交叉反应性的方法。...

微波与荧光素-酪胺信号放大技术用于小鼠肾上腺多重免疫染色——使用同一宿主物种的非偶联一抗

本方案描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的开放状态；3）收缩融合，涉及融合囊泡的收缩。...

利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

本方案概述了从刺鼠（Acomys）中分离骨骼肌和心肌纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）的方法Acomys) 通过 酶解离与荧光激活细胞分选。通过本方案获得的FAPs可有效扩增，并分化为肌成纤维细胞和脂肪细胞。...

棘鼠模型中纤维脂肪生成祖细胞的分离、扩增与分化

建立了一种稳定且可重复的方法，用于培养富含小鼠肾上腺皮质球状带和束状带细胞的二维原代细胞体系。该体系保留了各区域关键的分子和功能特征，可支持对信号通路、激素生成及肾上腺皮质细胞行为的深入研究 离体.

从小鼠肾上腺皮质建立区域富集的原代培养体系

学习小鼠肾上腺分离、固定和免疫荧光染色技术，用于研究肾上腺分区与细胞功能。该方法可保留组织形态，同时检测多种蛋白表达，为内分泌学研究提供重要工具。

小鼠肾上腺的分离、固定与免疫荧光成像

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