利用 tap 标签纯化叶绿体转移蛋白配合物的亲和纯化
2018年11月1日
我们在这里提出了一个经过验证和测试的方案, 以纯化叶绿体蛋白进口复合物 (toc-tic 复合物) 使用 tap-tag 标签。一步亲和力隔离协议有可能应用于任何蛋白质, 并可通过质谱技术识别新的相互作用伙伴。
该方法有助于回答叶绿体领域关键问题，例如叶绿蛋白进口机械的组成。它对于绿化和光合作用至关重要，因此对于地球上的粮食生产也至关重要。分子机由两个独立的复合物组成，在叶绿体的外层和内层，称为 TOC 和 TIC，但组成不完全知道。
该技术的主要优点是，Arabidopsis TOC/TIC复合物的纯化可以通过单步纯化方法（TAP-TOC）完成。这是一种具体而有效的方法。一般来说，新采用这种方法的研究人员可能难以为之，因为他们不熟悉叶绿体膜分数的分离、洗涤剂、溶解或亲和力纯化。
在制备了阿拉伯植物后，用液氮研磨10克3周大的幼苗，用冷砂浆和沙子来刺。向地面组织添加 20 毫升的冷磨缓冲液。混合好，让混合物在冰上解冻。
接下来，用研磨缓冲液浸泡两层快速过滤材料。通过两层过滤材料将均质过滤到 50 毫升锥形离心管中。将滤液在4摄氏度的1，500倍g下离心10分钟，然后将上流液转移到一个新鲜、预冷的50毫升锥形离心管中。
在相同条件下再次重复离心。将上清液转移到冷的 38.50 毫升超离心管中，用冷磨缓冲液将其加到 35 毫升。使用超离心机将样品在10万次g和4摄氏度下离心一小时。
使用玻璃特氟龙均质器，在研磨缓冲液中重新填充绿色颗粒。在10万倍的g和4摄氏度的温度下离心一小时，然后丢弃上一代。使用玻璃特氟龙均质器将绿色颗粒重新在 18.75 毫升的 x 研磨缓冲液中重新下水。
然后再添加一个 x 研磨缓冲液的 9.375 毫升。加入 4 个 x 溶解溶液的 9.375 毫升，使最终体积达到 37.5 毫升，并在 4 摄氏度的旋转摇床上孵育 30 分钟。在此之后，使用超离心机将样品以10万倍g和4摄氏度离心一小时。
将含有溶解膜的上流液转移到一个新的 50 毫升锥形离心管中。制备 IGG agarose 树脂后，将先前洗涤的 IGG agarose 树脂转移到含有 37.5 毫升溶解膜的 50 毫升锥形管中。在四摄氏度的旋转摇床上孵育过夜。
第二天，IGG加糖树脂在100倍g和4摄氏度的沉淀5分钟。使用移液器去除上流液。是 IGG agarose 树脂在 37.5 毫升缓冲器 A 中，并在室温下在旋转摇床上孵育 10 分钟。
继续沉淀和清洗树脂，如文本协议中所述。在此之后，将 IGG agarose 树脂转移到 500 微升旋转柱中，并配有 35 微米过滤器。用 300 微升 TEV 洗脱缓冲液清洗珠子两次，以进行平衡。
接下来，添加300微升的TEV洗脱缓冲液，包含10微升的TEV蛋白酶。在 16 摄氏度和 350 rpm 的热混合器中用珠子孵化旋转柱两个小时。然后，打开旋转柱，并放在一个新的，干净的，1.5毫升的管。
旋转这个管在100倍g和4摄氏度5分钟收集水卢酸盐。在这项研究中，一个TATA标记叶绿体包络蛋白复合物从转基因的阿.塔利亚纳植物被纯化。免疫布洛特分析证实，分离的TATA-TOC159与 TOC 综合体的 TOC75 和 TOC33 相互作用。
众所周知的氯层外膜激酶KOC1也是共分离的。TIC110 的存在表明，隔离的 TAP-TOC159 复合体还包含 TIC 复合物的组件。FBN1A抗体无法识别TATA-TOC159复合物，表明不存在污染。
在阴性对照中，免疫沉淀的NTAP蛋白没有与任何 TOC、TIC 蛋白共同分离，并确认 TAP-TOC159纯化的特异性。虽然这种方法可以提供叶绿素蛋白进口的见解，但它有可能应用于阿拉比多普西沙利安娜瓶系统中的任何其他复合物。按照此过程，可以应用其他方法，如西印迹或质谱法，以证明已知组件的存在或识别 TOC 和 TIC 复合体的新组件。
该技术为叶绿体蛋白导入领域的研究铺平了道路，以探索 TOC 和 TIC 复合物新成分的功能。
概述
本文介绍了一种使用TAP标签进行叶绿体蛋白导入复合物（TOC-TIC复合物）纯化的一步亲和分离协议。该方法可以通过质谱鉴定新的相互作用伙伴，对理解叶绿体功能至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 叶绿体生物学
- 蛋白质纯化
- 质谱
背景
- 叶绿体蛋白导入机制对光合作用和食物生产至关重要。
- TOC和TIC复合物参与蛋白质导入，但它们的完整组成尚未完全了解。
- 当前分离这些复合物的方法可能复杂且耗时。
- 本研究旨在简化纯化过程。
研究目的
- 开发一种简单的纯化TOC-TIC复合物的协议。
- 促进识别参与叶绿体蛋白导入的新成分。
- 提供一种可应用于拟南芥中其他蛋白质复合物的方法。
使用的方法
- 拟南芥幼苗的制备和在液氮中研磨。
- 连续离心以分离叶绿体膜。
- 使用IGG琼脂树脂进行亲和纯化。
- 免疫印迹分析以确认特定蛋白质的存在。
主要结果
- TAP-TOC159复合物被成功纯化，并显示与TOC75和TOC33相互作用。
- TIC110的共同分离表明纯化的复合物中存在TIC成分。
- 该方法展示了特异性，因为阴性对照没有显示与TOC和TIC蛋白的共同分离。
- 该技术允许进一步探索叶绿体蛋白导入机制。
结论
- TAP标签纯化方法对于分离叶绿体蛋白复合物是高效和特异的。
- 这种方法可以增强对叶绿体蛋白导入系统的研究。
- 未来的研究可以利用这种方法来识别TOC和TIC复合物的新成分。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
