利用核磁共振波谱法（NMR）和微尺度热泳法（MST）检测球状蛋白与丝状蛋白的相互作用

该方法有助于回答蛋白质相互作用领域中的关键问题，例如蛋白质是否直接与小分子或大分子结合。该技术的主要优势在于，它是一种简单且快速检测原子水平直接相互作用的方法。使用弹出命令 ej 启动气流。

这将使样品从磁铁上移开。现在，将样品放入磁铁上方开口处的旋转器中。使用命令 ij 插入。

继续操作前，请等待样品在磁体中完全稳定。使用 edc 命令创建新数据集，并通过选择实验 ZGPR 载入标准质子核磁共振参数。填写 NAME、实验编号以及处理后数据文件夹编号字段。

在“设置溶剂”字段中选择溶剂，然后点击“执行 getprosol”以读取标准探头和溶剂相关的参数。使用 lock 命令将样品锁定至氘代溶剂，并等待其完成扫描并实现锁定。通过使用自动调谐命令 atma 对样品进行调谐，校正磁体的共振频率。

监测摆动曲线，直至自动调谐完成。使用顶部匀场（topshim）对磁场进行匀场。匀场可对磁场进行调整。

确保样品周围磁场均匀。建议使用 wsh 命令将匀场值保存，并在使用相同或类似样品时，在执行 topshim 前使用 rsh 命令读取这些值。接下来，使用 rga 命令调节接收增益，以获得最大的信噪比。

将谱图中心置于水共振偏移位置，并使用 calibo1p1 设置高功率的 90 度质子脉冲。使用零等待时间 zg 命令采集质子谱图，并用 efp 进行处理，包括指数乘法、含线宽展宽的自由感应衰减、FID 的傅里叶变换，以及使用 pk 进行相位校正。

使用不带积分选项的多项式进行自动相位校正（apk）和自动基线校正（absn）。通过在实验中选择 SFHMQC3GPPH，为 SOFAST HMBC 实验创建一个新的数据集。从氢谱中复制已优化的 P1 和 O1 参数，并使用命令 getprosol 1H p1 plw1 填充依赖于 P1 的脉冲，其中 p1 为已优化的 P1 值，plw1 为 P1 的功率水平。接下来，优化 CNST54 常数，以设置酰胺化学位移的偏置。

同时优化 CNST55 以定义带宽，从而涵盖感兴趣的光谱区域，使接收机增益得以优化。为选择这些参数，需从二维谱中提取第一个自由感应衰减信号（FID），并根据观测到的信号来确定参数。此外，通过命令 gs 调整弛豫延迟、扫描次数和预扫描次数，该命令可实现边采集边扫描，以实时监测数据质量，从而获得可接受的信号灵敏度。

最后，使用 Zero Go zg 记录谱图。将处理参数设置为谱图的直接 F2 维和间接 F1 维的大小，并可在间接维选择性地使用线性预测。选择 QSINE 作为窗口函数，并输入 2 的正弦钟形偏移值，以处理二维谱图。

输入命令 xfb，使用窗函数和傅里叶变换对数据进行双向处理。使用命令 apk2d 在两个方向上执行自动相位校正。对二维数据使用自动基线校正函数 abs2 进行基线校正。

在处理参数中定义的 ppm 值之间应用多项式函数，并生成用于进一步分析的二维谱图。如果计划进行连续处理以比较与其他分子的相互作用数据，请使用 wpar 命令保存处理参数，并使用 rpar 命令调用这些参数。输入命令 pp 以开始峰提取过程。

根据预期峰设定 ppm 范围、最低强度和最大峰数量，然后点击确定。通过目视检查验证结果。如有需要，可重复运行该过程，直至根据谱图质量获得满意结果为止。

使用 pp 命令生成峰列表。该峰列表默认包含数据高度和峰强度信息。峰列表可导出至后续谱图，并可被其他程序读取。

现在观察蛋白质HSQC谱图中峰强度的变化或化学位移的移动，这些变化可指示与另一分子的相互作用。如果相互作用的分子较大，则预期会出现峰强度降低，并伴随部分峰的消失。通过点击“峰”标签，在峰窗口中右键单击并选择导入，将峰列表导入到下一个数据集中。

在谱图上可视化峰的位置，如有需要，可将其移动至新位置。点击“重置所有强度”以生成包含强度信息的谱图峰列表。该峰列表将继承已保存峰列表中的位置信息。

通过选择“导出”功能，将来自不同数据集的峰列表导出至电子表格或其他数学分析程序中。针对每个峰，使用“复合物谱图中的峰强度”除以“蛋白质谱图中的峰强度”的函数来计算峰强度的变化。通过乘以100，可将数值转换为百分比变化。

需要注意的是，尽管峰强度更易于测量，尤其是对于通常在蛋白质中密集分布且相对较宽的峰而言，但峰体积也同样具有参考价值。在有或无VimRod存在的情况下，分别采集了野生型E-PRD以及R1914E突变体的N15HSQC谱图。野生型E-PRD的谱图显示出预期数量的清晰分辨峰，表明该蛋白质正确折叠。

在VimRod存在的情况下，谱图显示出明显的谱线展宽和峰消失现象，对应于E-PRD与VimRod之间的结合。R1914E突变体在加入VimRod前后谱图变化很小，表明该突变型E-PRD与VimRod无明显结合。此处比较了E-PRD在有无VimRod存在时的峰强度，并将其绘制成相对峰强度图，以反映E-PRD复合物中谱峰展宽的程度。

为了验证并定量分析 VimRod 与 E-PRD 的结合，采用 MST 分析法，以荧光 RED-tris-NTA 染料标记的 His6-VimRod 作为靶标，使用浓度递减的 E-PRD 配体进行实验。数据通过单一位点配体结合的标准模型进行拟合，得到的 KD 值为 25.7 ± 2.1 微摩尔。在进行该实验时，需注意始终使用相同的采集和处理条件。

将因难以获得用于收集核磁共振（NMR）谱图的同位素标记蛋白质样品而面临困难。该技术的影响延伸至癌症、感染性疾病或神经退行性疾病的治疗，因为这些疾病涉及蛋白质相互作用的形成，而这些相互作用在疾病状态下受到破坏。