用核磁共振 (nmr) 和微尺度热能 (mst) 测量球状和丝状蛋白的相互作用

在这里, 我们提出了一个协议, 生产和纯化的蛋白质标记与稳定同位素, 以及随后的表征蛋白质相互作用使用核磁共振 (nmr) 光谱和微尺度热像仪 (mst) 实验。

这种方法可以帮助回答蛋白质相互作用领域的关键问题，例如蛋白质是直接与小分子还是大分子结合。这种技术的主要优点是，它是在原子水平上检测直接交互的简单而快速的方法。使用弹出命令 ej 打开气流。

这将把样品从磁铁上拿来。现在，将样品放在开口磁铁顶部的微调器中。使用命令 ij 插入。

等待样品在磁铁内沉淀，然后再继续。通过选择实验 ZGPR，使用 edc 命令和加载标准质子 NMR 参数创建新数据集。填写 NAME、实验编号和已处理的数据文件夹编号字段。

选择"设置溶剂"字段中的溶剂，然后单击执行 getprosol 读取标准探针头和溶剂相关参数。使用锁定命令将样品锁定到脱发溶剂中，并等待其完成清扫并实现锁定。使用自动调谐命令 atma 调整样品，纠正磁体的谐振频率。

监控摆动曲线，直到自动调谐完成。使用顶片将磁场填充。闪闪发光对磁场进行调整。

实现样品周围的均匀性。如果使用相同或类似示例，则将此值存储在命令 wsh 的值中，并使用在 topshim 之前使用 rsh 读取它们。现在，使用 rga 命令调整接收器增益，以实现最大信噪比。

将光谱中心放在水共振偏移上，并使用 calibo1p1 将 90 度质子脉冲设置为高功率。使用零 go zg 命令收集质子光谱，并使用 efp 处理。这包括指数乘法、结合线变宽的自由感应衰减、FID 的 Fourier 变换和 pk 应用相位校正。

使用无集成选项应用自动相位校正 apk 和自动基线校正 absn。通过在实验中选择 SFHMQC3GPPH 为 SOFAST HMBC 实验创建新数据集。从质子光谱复制优化的 P1 和 O1，并使用命令 getprosol 1H p1 plw1 填充 P1 相关脉冲，其中 p1 是优化的 P1 值，plw1 是 P1 的功率级别。现在，优化 CNST54 常量，为中位化学移位设置偏移。

还要优化 CNST55 以定义带宽，以包含感兴趣的光谱区域，从而优化接收方增益。要选择这些参数，请从二维频谱中提取第一个 FID，并查找观测到的信号来定义它们。此外，通过命令 gs 更改松弛延迟、扫描次数和虚拟扫描，以获得可接受的信号灵敏度，从而能够实时监控数据质量。

最后，使用零 Go zg 记录光谱。将处理参数设置为频谱的直接 F2 和间接 F1 尺寸的大小，并在间接尺寸中可选的线性预测。选择 QSINE 作为窗口函数，并输入二的"2"钟移以处理二维频谱。

输入命令 xfb，使用窗口函数和 Fourier 变换在两个方向上处理数据。使用命令 apk2d 在两个方向上执行自动相位校正。使用 2D 数据的自动基线校正功能 abs2 更正基线。

这将在处理参数中定义的 ppm 值之间应用多项式函数，并将生成 2D 频谱以作进一步分析。如果计划执行串行处理以比较与其他分子的相互作用数据，则将处理参数与命令 wpar 存储，然后使用 rpar 进行调用。输入命令 pp 以开始峰值领料过程。

根据预期峰值定义 ppm 范围、最小强度和峰值的最大数量。然后单击"确定"。通过目视检查验证结果。如果需要，请重新运行该过程，直到根据光谱质量获得满意的结果。

使用 pp 命令生成峰值列表。默认情况下，此峰值列表包含数据高度和峰值强度信息。峰值列表可以导出到后续频谱，并可由其他程序读取。

现在观察蛋白质HSQC光谱，观察指示与其他分子相互作用的化学转移的峰值强度或运动的变化。如果相互作用的分子很大，则预计峰值强度会随着一些峰值的消失而减少。通过单击峰值选项卡并在峰值窗口中右键单击选择导入，将峰值列表导入到下一个数据集。

可视化频谱上的峰值，如果需要，将它们转移到新位置。单击完整表的重置强度，为包含强度的频谱生成峰值列表。此峰值列表将从存储的峰值列表中结还位置信息。

通过选择"导出"函数，将不同数据集的峰值列表导出到电子表格或其他数学程序进行分析。计算复杂光谱中功能峰值强度、每个峰的蛋白质谱峰值强度的变化。值可以通过乘法乘以 100 转换为百分比变化。

请注意，峰值体积也很有用，尽管峰值强度更容易测量彼此靠近的峰，对于密度相对较宽的峰值的蛋白质通常如此。N15HSQCs是为野生型E-PRD和R1914E突变体，在VimRod存在或不存在的情况下获得的。野生类型E-PRD的光谱显示预期解决良好的峰值数，表明正确折叠的蛋白质。

在VimRod的存在，频谱显示广泛的线扩大和峰值消失，对应于E-PRD和VimRod之间的绑定。R1914E突变体本身的光谱和VimRod的加入很少变化，表明它缺乏与这种突变E-PRD的结合。在这里，对VimRod存在和不存在的E-PRD峰值强度进行比较并绘制为相对峰值强度，以指示E-PRD综合体中峰值扩大的范围。

为了验证和量化VimRod和E-PRD的结合，MST分析使用以荧光红三酯-NTA染料为标的S His6-VimRod作为靶点，使用E-PRD配体浓度的降低进行。数据与单站点配体绑定的标准模型很合适，给出的 KD 为 25.7 正负 2.1 微摩尔。在尝试此过程时，必须记住使用相同的采集和处理条件。

将挣扎， 因为获得同位素标记蛋白质样品收集 Nmr 光谱。这种技术的影响延伸到癌症，感染，或神经退行性疾病的治疗，因为它们涉及在疾病中妥协的蛋白质相互作用的形成。