肾小球的分离及肾小球细胞表面蛋白的活体标记
2019年1月18日
在这里, 我们提出了一个协议的小鼠体内标记肾小球细胞表面蛋白与生物素.该协议包含有关如何灌注小鼠肾脏, 分离肾小球, 并执行内源性免疫沉淀的感兴趣的蛋白质的信息。
该方法有助于回答肾病学领域有关细胞表面蛋白贩运在蛋白尿中作用的关键问题，而不是蛋白尿肾病。该技术的主要优点是，它有利于细胞表面蛋白质在体内的贩运研究，并且每个实验可以分析一种以上蛋白质。虽然这种方法可以提供对球状细胞表面贩运的见解，也可以应用于其他器官系统，这些器官系统被移植，并且可以通过隔离技术获得。
首先确认对头趾捏没有反应，用70%异丙基对麻醉小鼠的腹侧进行消毒。使中位切入皮肤从骨盆到胸骨，并使用钳子去除腹部筋膜的皮肤。切开腹部中线两侧的皮肤，并通过腹部肌肉层从膀胱到西腓的介质。
使用剪刀和钳子将肌肉分成四个象限，然后使用两个手术钳将上两个象限固定到动物的颈部。将动物放在解剖显微镜下，使用无菌交换将内脏器官移出。用细剪刀，切下肝性韧带。
使用精细的手术钳子，在肾动脉的肝肠动脉周围放置一个缝合线。在主动脉周围，与肾动脉近在近，肾上腺。将远大肌从筋膜、脂肪和其他组织中释放。
然后，在分叉的高度夹紧静脉和主动脉，并在肾动脉主动脉周围放置另一个缝合线。使用钳子拧紧近角主动脉缝合，衰减血流，将主动脉直径的一半的小孔切入主动脉，向肾动脉开去。将一个10厘米的导管插入附在10毫升注射器上，注射器中含有5毫升的冰冷PBS加上钙和镁。
用准备好的连字固定导管。然后开始以每分钟两毫升的流速对肾脏进行足衰竭。使用细剪刀在肾动脉的肾静脉中切一个洞，并收紧肝动脉和肠动脉周围的缝合线。
交付整个 PBS 体积后，用五毫升冰冷 PBS 加上钙和镁代替香水，并辅以每毫升 0.5 毫克的生物素进行表面标记。继续以每分钟两毫升的流速使肾脏保持领先。当整个体积已交付时，将含有五毫升冰冷 PBS 的注射器以及钙和镁，并辅以 100 毫升甘氨酸到导管上。
以每分钟两毫升的流速，用甘氨酸溶液的所有五毫升来淬火。然后用五毫升的冰冷PBS加上钙和镁补充肾脏，每毫升200微升磁珠，每分钟流速为2毫升。用棕色磁珠的球状栓塞将在肾脏表面可见。
当所有的珠子已经交付删除肾脏的胶囊和收获肾脏在欣隆。将肾脏放在含有 15 毫升 PBS 加钙和镁的 10 厘米细胞培养盘中。使用新的双刃刀片将肾脏切成尽可能小的碎片。
将组织转移到含有一毫升胶原酶 A 的两毫升管中，在 37 摄氏度下进行 30 分钟，在消化前和消化后用经过修改的 1000 微升移液器尖端轻轻混合组织溶液。在孵育结束时，通过100微米细胞过滤器过滤消化的组织。使用细胞刮刀和冰冷PBS加上钙和镁，通过细胞过滤器捣碎剩余的组织。
将肾单细胞悬浮液的最终体积与新鲜冰冷PBS加钙和镁一起带到50毫升，通过离心收集肾细胞。取出上清液，然后用略低于1.5毫升的冰冷PBS加钙和镁重新悬浮颗粒，同时涡旋并转移球状悬浮液到新的两毫升管中。要清洗球状，请将管子放入磁铁中，以聚合球状体。
一分钟后，使用 1000 微升移液器取出上流液。从磁铁上取下管子。在组织中加入一毫升的 PBS 以及钙和镁。
移液球状上下一次，并漩涡细胞。将管子返回磁铁，然后再次清洗球状，正如刚刚演示的。直到样品纯度达到至少 90%的光显微镜分析在 40 至 100 X 放大倍率。
然后通过离心收集磁珠纯化的光泽。为了达到超过 95% 的纯度，需要彻底清洗，如证明。生物素灌注有助于在生物素中标记毛细管环，但不受控制的灌注小鼠肾脏。
球状提取物生物素部分的免疫沉淀表明，肾上腺素和足腺素是免疫沉淀的生物素，但不是与控制分数。免疫沉淀分数与斯特雷普他丁的染色进一步证实了生物素在生物素中所检发的内腓林的存在，但无法控制被注入的动物。内皮蛋白血管内皮球蛋白和细胞内粘附分子二也是免疫沉淀的生物素分数。
在肾毒性肾炎的早期，与对症相比，肾毒性肾炎动物观察到细胞表面肾素的表达减少。事实上，密度分析显示，与控制者相比，肾毒性性肾炎动物的生物素甲酸肾上腺素显著减少。对肾素与作用素总比例的定量分析表明，对照组与肾毒性肾炎小鼠之间没有显著差异。
此外，在肾毒性肾炎和控制动物中观察到同样数量的豆瓣细胞。在晚期肾毒性肾炎中，肾毒性性肾毒动物表现出肾素表达的恢复，对照组和肾毒性性肾毒小鼠之间测量的细胞表面肾素无显著差异，肾毒性肾毒动物的整体肾素减少。此外，与控制动物相比，豆瓣细胞数量减少。
在尝试此程序时，重要的是要记住，保持注射器在连接过程中无气泡，以避免球状体的空气栓塞，并在肾脏灌注开始后在冰冷的条件下工作。按照这个程序，其他方法，如分离球状RNA和蛋白质可以回答有关蛋白质表达或相互作用在健康和患病肾脏的其他问题。
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概述
本文介绍了一种使用生物素对小鼠肾小球细胞表面蛋白进行体内标记的协议。它详细描述了小鼠肾脏灌流、分离肾小球和进行免疫沉淀的步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 肾脏学
- 细胞生物学
- 蛋白质运输
背景
- 理解细胞表面蛋白运输对肾脏疾病研究至关重要。
- 这种方法可应用于各种器官系统。
- 它允许在单次实验中分析多种蛋白质。
- 体内研究提供了体外方法无法获得的见解。
研究目的
- 调查细胞表面蛋白运输在肾脏疾病中的作用。
- 开发研究肾小球蛋白的可靠协议。
- 增进对蛋白尿和非蛋白尿肾脏疾病的理解。
使用的方法
- 用生物素灌流小鼠肾脏。
- 从肾脏中分离肾小球。
- 靶蛋白的内源性免疫沉淀。
- 确认小鼠的麻醉和手术准备。
主要结果
- 该协议成功标记了肾小球细胞表面蛋白。
- 可以同时分析多种蛋白质。
- 获得了蛋白质运输机制的见解。
- 该方法可以适用于其他器官系统。
结论
- 该协议是肾脏学研究的有价值工具。
- 它为研究体内蛋白质运输提供了框架。
- 未来的研究可以扩展其应用于其他疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
Studying glomerular cell surface protein trafficking in vivo provides mechanistic insights into kidney disease pathogenesis, supporting target validation in nephrology. This method enables semi-quantitative analysis of surface protein abundance under physiologic and pathophysiologic conditions, enhancing predictive confidence in preclinical models. It facilitates biomarker discovery and pathway clarification relevant to proteinuric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking cell surface protein dynamics in intact glomeruli.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of nephrin and podocalyxin trafficking in disease models.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts for assessing target engagement and pathway modulation in vivo.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified glomerular fractions suitable for downstream immunoprecipitation and protein interaction analysis.
- Reproducibility: Standardized perfusion and magnetic bead isolation yield consistent glomerular preparations across experiments.
- Multiplex Capability: Allows simultaneous analysis of multiple surface proteins per experiment, increasing screening efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Captures dynamic changes in nephrin expression during early and late phases of nephrotoxic nephritis.
- Translational Continuity: Links in vivo protein trafficking observations to podocyte loss and disease progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein changes reflect surface trafficking versus total expression shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing functional, in vivo data on glomerular protein behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein trafficking mechanisms in kidney disease models.
- Screening: Delivers quantitative, biotin-dependent immunoprecipitation outputs for comparing protein surface exposure.
- Analytics: Enables semi-quantitation of glomerular cell surface abundance via streptavidin-based detection.
- Translational Research: Connects surface protein dynamics to histologic and functional outcomes in nephritis models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other perfused organ systems, supporting cross-indication target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing surface trafficking from total protein expression changes.
- Operational Value: Standardized perfusion and isolation workflows improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing target accessibility and modulation in physiologic contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo surface protein behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, vascular perfusion, and tissue dissection under sterile conditions.
- Dependent on perfusion equipment, magnetic separation tools, and immunoprecipitation reagents.
- Necessitates standardization of biotin perfusion timing, flow rate, and quenching steps for consistent labeling.
- Adaptation to other organ systems requires validation of accessibility and perfusion efficiency.
- Practical limitations include tissue fragility during digestion and the need for high-purity glomerular isolation (>95%) for reliable downstream analysis.
