Name: 植物生长与农杆菌介导的植物浸水转化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学习农杆菌介导的花序浸染法转化Schrenkiella parvula，建立稳定转基因株系。该方法适用于研究极端环境适应机制，可与拟南芥进行功能基因组学比较分析。

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本工作由美国国家科学基金会资助项目 MCB 1616827 支持。

1. 植物生长
<ol>
	<li>种子灭菌（可选）
	<ol>
		<li>在50 mL离心管中，用双蒸水（ddH2O）配制50%次氯酸钠溶液，并加入1至2滴非离子型去污剂（参见材料表），反复倒置混匀。 
		注意：建议在超净工作台内操作种子灭菌步骤，并将工作台表面用紫外灯灭菌15分钟。</li>
		<li>将次氯酸钠溶液加入含有约100–200粒S. parvula种子的1.5 mL离心管中，充分混匀后静置5分钟。</li>
		<li>去除次氯酸钠溶液，加入70%乙醇。用移液器反复吹打清洗种子，随后立即去除乙醇溶液。</li>
		<li>用无菌水清洗种子以去除残留的次氯酸钠和乙醇，然后弃去水相。重复此步骤5至6次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>种子层积处理
	<ol>
		<li>将种子浸入无菌水中，在4 °C条件下保存5至7天。或者，将未灭菌的干燥种子直接播种于湿润土壤表面，并将育苗盘置于4 °C环境中5至7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化前植株的培养
	<ol>
		<li>将土壤混合物（参见材料表）装入7 × 6 cm2的花盆中，将花盆浸入水中润湿，并从顶部喷水，确保培养基均匀湿润。在每个花盆的土壤表面添加5–粒肥料珠（参见材料表）。 
		注意：根据我们的经验，S. parvula可在任何适合A. thaliana生长的土壤混合物中良好生长。</li>
		<li>使用湿润的牙签，将每盆20~25粒种子转移至土壤表面。 
		注意：一种简便的方法是将4–5粒种子分别放置在花盆的四个角和中心位置（图1，第15天，左图）。</li>
		<li>用透明罩盖住育苗盘，以在萌发期间保持高湿度环境。</li>
		<li>将育苗盘置于生长室中，光照强度设定为130 µmol m−2 s−1，温度为22–24 °C，光周期为每日14小时光照/10小时黑暗。在种子萌发后7–10天移除透明罩。从育苗盘底部加水，以保持土壤均匀湿润至适宜水平。</li>
		<li>剔除多余的幼苗，每盆仅保留4–5株生长健壮且彼此分离良好的幼苗（图1，第15天，右图）。</li>
		<li>每隔两天轻柔浇水一次，每两周施加一次0.2x Hoagland营养液16。 
		注意：保持土壤湿度均匀是稳定、健康地培养S. parvula的关键。</li>
		<li>继续培养植株8–10周，直至每株产生多个花序，每个植株形成100–150个花芽（图1，第60–80天）。在计划进行花浸法转化的当天（步骤4.5），去除植株上所有成熟和正在发育的角果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 将目的基因/基因组元件克隆至植物转化载体中
<ol>
	<li>使用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标DNA片段17 并使用凝胶回收试剂盒分离PCR产物（参见 材料清单根据试剂盒说明书或采用其他合适的方法，利用琼脂糖凝胶电泳纯化DNA17,18通过Sanger测序验证分离的PCR产物的序列19.</li>
	<li>将目标PCR产物克隆至克隆载体中，并将重组质粒转化至感受态细胞 E. coli 使用基于拓扑异构酶的克隆试剂盒对细胞进行克隆（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。</li>
	<li>将50 µL转化产物涂布于Luria-Bertani培养基上20 (LB) 琼脂细菌培养基（表1）加入适当的抗生素， 例如., 50 µg/mL 斯pectinomycin（见 材料表，并在37 °C下孵育过夜。</li>
	<li>次日，挑选5–10个单菌落，接种于含适当抗生素的液体LB培养基中，于37 °C轻微振荡培养过夜。</li>
	<li>使用质粒提取试剂盒分离质粒（参见 材料表并通过Sanger测序进行验证19 2.1 中扩增的目标序列是否被正确克隆。</li>
	<li>将已克隆并验证的PCR产物转移至适用于基于重组的克隆技术的植物转化载体中（参见 材料表)，使用重组酶酶混合试剂盒（参见 材料表），按照试剂盒制造商的说明进行操作。重复步骤2.3至步骤2.5，以分离并验证含有正确质粒构建体的克隆。</li>
</ol>
3. 将用于植物转化的载体构建体转入 根癌农杆菌
<ol>
	<li>将2.6中的载体构建质粒转化至 A. tumefaciens&#160;菌株 GV3101:pMP90RK21，含有利福平抗性基因，用于染色体背景筛选。使用适当的抗生素，如庆大霉素或卡那霉素（参见 材料表），用于植物转化载体（Ti质粒）的筛选。一种简要的实验方案 A. tumefaciens 第3.2节包含通过电穿孔进行转化的内容。</li>
	<li>A. tumefaciens 电穿孔转化
	<ol>
		<li>解冻 A. tumefaciens 感受态细胞22 置于冰上。将2.6中制备的质粒0.1–1 µg（溶于1–2 µL ddH₂O中）混合。2O，将混合物加入预冷的感受态细胞中并置于冰上。将混合物转移至电穿孔比色皿中（参见 材料表).</li>
		<li>对3.2.1中质粒与感受态细胞的混合物进行电穿孔转化，使用电穿孔仪（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。 
		注意： 在开始电穿孔之前，清洁比色皿的表面。</li>
		<li>将反应混合物从比色皿转移至含有1.5 mL液体LB培养基的微量离心管中，用移液器充分混匀，并在28 °C下轻轻振荡孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种转化后的 A. tumefaciens 在含有适当选择性抗生素（如卡那霉素 25 µg/mL、链霉素 50 µg/mL、庆大霉素 25 µg/mL 和利福平 50 µg/mL）的 LB 平板上划线，于 28 °C 培养 3 天。</li>
</ol>
4. 农杆菌介导的S. parvula转化
<ol>
	<li>从平板上挑取单个转化菌落，接种于含有抗生素（同3.3节）的10 mL LB液体培养基中，置于无菌的50 mL锥形离心管内（参见材料表）。在摇床培养箱（参见材料表）中以250 r.p.m.、28 °C振荡培养24小时。</li>
	<li>将3.4.1步骤中的菌液转移至无菌的250 mL三角烧瓶中，加入40 mL含适当抗生素的LB液体培养基，继续在28 °C下培养12小时，直至600 nm波长下的光密度值（OD600）达到约2.0。</li>
	<li>将A. tumefaciens&#160;菌液在3,100 x g下离心10分钟。弃去上清液，用40 mL的A. tumefaciens&#160;侵染溶液（表1）重悬菌体沉淀。</li>
	<li>用侵染溶液将重悬的A. tumefaciens菌液稀释至最终OD600为0.8。向50 mL稀释后的A. tumefaciens菌液中加入25 µL表面活性剂溶液（表1），轻轻倒置数次混匀。</li>
	<li>将植株的花序浸入4.4节制备的A. tumefaciens菌液中20秒。每处理六盆植株的花序后，需更换新鲜的菌液。确保所有花朵均与菌液充分接触。若花序下部的花朵无法完全浸入菌液，可直接用移液器将菌液滴加至花朵上。 
	注意：进行首次转化时，务必使用锋利的解剖刀或小剪刀去除所有成熟和正在发育的角果。若进行第二次转化，则无需去除角果。</li>
</ol>
5. 转化后植物的养护与第二次转化
<ol>
	<li>将浸花处理后的植株水平放置在带有罩盖的洁净托盘中，覆盖植株，并置于黑暗的培养室中培养1–2天。 
	注意： 此阶段保持花朵处于高湿度环境非常重要（图1，转化后的植株）。</li>
	<li>将植株恢复至直立状态，并转移至光照培养室，培养条件为每日14小时光照/10小时黑暗的光周期，光照强度为130 µmol m-2 s-1，温度为22至24 °C。</li>
	<li>在接下来的一周内观察浸花的花序。若出现大量花朵败育（图2），则约在4周后或待大量新花形成后，重复进行一次浸花处理（步骤4）。 
	注意： 与第一次转化前的准备步骤（步骤1.3.7）不同，在第二次转化前无需去除已存在的或正在发育的角果（图2）。</li>
	<li>继续培养植株直至种子成熟，并在约21周时收获种子。</li>
	<li>将种子在室温下置于装有干燥剂的密闭容器中干燥2–3周（参见材料表）。</li>
</ol>
6. 阳性转化子的筛选
<ol>
	<li>按照步骤1.2至1.3中所述野生型种子的方法播种T1代种子。</li>
	<li>将植物培养至第一片真叶出现&#160;真叶发育，约在萌发后10–14天。</li>
	<li>进行第一次除草剂抗性筛选（图3A 和 3B），如下所述。
	<ol>
		<li>稀释草铵膦铵盐（11.3%）除草剂（或 BASTA）（表1) 稀释至1:1,000（v/v）。将稀释后的BASTA溶液喷洒于幼苗上，并用罩盖覆盖植株过夜。</li>
		<li>每5–7天重复喷洒BASTA 2–3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用BASTA-drop测试进行第二次筛选，具体步骤如下。
	<ol>
		<li>筛选出经3–4次BASTA溶液喷洒后仍存活的植株，继续培养2–3周，直至3–5片叶片发育出相对较大的表面积。</li>
		<li>选取每株植物上最大的成熟叶片，用手指轻轻擦拭叶片表面以去除蜡质层，然后滴加一滴稀释后的BASTA溶液（来自步骤6.3.1）。 
		注意： 在最近的茎上贴上胶带，标记施加草铵膦滴液的叶片位置。</li>
		<li>观察滴加BASTA的叶片，持续一周，记录是否出现萎蔫现象。选择叶片未受BASTA影响的植株。 
		注意： 大多数假阳性植株的叶片在两天内开始萎蔫，而真阳性植株的叶片即使在BASTA溶液滴液干燥后仍保持完整图3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用基因组PCR确认阳性转化子。
	<ol>
		<li>在步骤6.4.5中，从存活的植株上采集2–3片叶片。</li>
		<li>使用CTAB法从叶片中提取基因组DNA23 或任何其他合适的DNA提取方法。</li>
		<li>使用目标植物、野生型植物（作为阴性对照）以及步骤3.1中的质粒构建体（作为阳性对照）提取的基因组DNA样本进行PCR。采用一对针对筛选标记基因的特异性PCR引物，例如, 抗BASTA基因（条TCAGCAGGTGGGTGTAGA（正向）和 GTCAACCACTACATCGAGACAA（反向）。
		<ol>
			<li>以目标为示例的PCR引物 杆 基因扩增采用以下PCR条件：98 °C预变性30 s；随后进行30个循环，每个循环包括98 °C变性30 s、59 °C退火30 s、72 °C延伸30 s；最后72 °C终延伸5 min。 
			注意： 为确保整个T-DNA的插入，我们建议同时进行基因组PCR，所用引物之一来自筛选标记基因，另一引物则针对在植物转化载体中克隆的目标序列</li>
		</ol>
		</li>
		<li>确认扩增产物具有预期大小 杆 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物17 对于目标样本（图4A以及对分离的PCR产物进行测序19 采用与步骤 2.1 相同的程序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

植物的生理状态显著影响转化效率25。S. parvula 转化成功的关键要求之一是使用健康且生长旺盛的植株。与适合转化的健康植株相比，水分或光照胁迫下的植株开花数量更少（图1，中间图）。S. parvula 可在低于 130 µmol m-2 s-1 的光照强度下生长，但植株通常较为脆弱；此类植株在花序浸染后更容易出现花器官败育。S. parvula 花序经农杆菌浸染后花败育的频率高于 A. thaliana。因此，在将花序浸入A. tumefaciens&#160;侵染溶液时，采取任何减少花败育的措施均有助于提高转化效率。我们建议每日光照时间不超过 14 小时。通常，A. thaliana 的转化实验使用生长在长日照条件（例如 18 小时光照、6 小时黑暗）甚至连续光照下的植株进行。然而，我们发现此类培养方式会导致 S. parvula 植株抗逆性降低，从而造成...

在本实验方案中，我们描述了极端环境植物模式物种Schrenkiella parvula的生长及其稳定转基因品系的建立。高效的遗传转化体系是任何多功能遗传模型的重要标志。能够在极端环境中生长的植物，即所谓的极端环境植物（extremophytes），为研究植物对环境胁迫的适应机制提供了重要的资源。Schrenkiella parvula（曾用名Thellungiella parvula和Eutrema parvulum）便是这样一种极端环境植物模式物种，其基因组资源正在不断扩展1,2,3,4,5。然而，迄今为止尚未有已发表的研究报道S. parvula的遗传转化方案。
S. parvula 的基因组是芥菜科（十字花科）中首个发表的嗜极生物基因组，其整体基因组共线性与非嗜极模式生物Arabidopsis thaliana1具有高度相似性。因此，通过比较A. thaliana与S. parvula的研究，可充分利用已有的大量A. thaliana遗传学研究成果，进而对S. parvula基因组如何进化并以不同方式调控以适应极端环境胁迫提出有意义的假设5,6,7。S. parvula是目前已知的A. thaliana野生近缘种中耐盐性最强的物种之一（基于土壤NaCl的LD50）8。除耐NaCl外，S. parvula还能在多种高浓度对大多数植物有毒的盐离子环境中存活并完成其生命周期7。为应对自然栖息地中普遍存在的非生物胁迫，该物种已进化出多种性状，其中部分性状已在生化或生理层面得到研究8,9,10,11。
自2010年以来，已有超过400篇同行评审的出版物将S. parvula作为目标物种，或将其与其他植物基因组进行比较研究。然而，通过更深入地分析已开展的研究类型，可以发现一个明显的瓶颈。这些报告中的大多数仅讨论了S. parvula在未来研究中的潜在用途，或将其用于比较基因组学或系统发育基因组学研究。尽管S. parvula拥有目前可用的最高质量的植物基因组之一（组装并注释为染色体水平的假分子，其contig N50 &#62;5 Mb），但由于尚未建立针对该物种的概念验证转化实验方案，因此它尚未被应用于功能基因组学研究1。
农杆菌介导的花序浸润转化法已成为创建A. thaliana转基因品系应用最广泛的方法，而可重复转化体系的建立是其作为遗传学模式生物取得成功的关键因素12,13。然而，并非所有十字花科物种都能成功应用为A. thaliana开发的花序浸润法进行转化。特别是包含S. parvula的十字花科II系物种，对基于花序浸润的转化方法表现出难转化性14,15。
S. parvula 的无限花序生长习性，加上其叶片形态狭窄，使得采用标准的农杆菌介导的花序浸润转化方法变得困难。在本研究中，我们报道了为实现可重复转化 S. parvula 而开发的改良方案。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>90000-762</td><td>Bacto 琼脂凝固剂，BD 诊断</td></tr><tr><td>B5维生素</td><td>Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州</td><td>G1019</td><td>甘博格&amp;rsquo;维生素溶液</td></tr><tr><td>干燥剂</td><td>W A Hammond Drierite，Xenia，OH</td><td>22005</td><td>指示型DRIERITE 6目</td></tr><tr><td>用于植物转化的载体</td><td>TAIR</td><td>载体：6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>电穿孔比色皿，圆形帽，0.2 cm 间隙</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BIO-RAD Laboratories，Hercules，CA</td><td>1652100</td><td>MicroPulser 电穿孔仪</td></tr><tr><td>肥料珠</td><td>Osmocote 园艺，俄亥俄州玛丽斯维尔</td><td>N/A</td><td>Osmocote 智能释放植物营养肥&amp;nbsp;花 &amp;和蔬菜</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>iNtRON 生物技术公司，波士顿，马萨诸塞州</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin 总片段 DNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>G1914-5G</td><td>硫酸庆大霉素</td></tr><tr><td>草铵膦铵盐（11.3%）除草剂（BASTA）</td><td>拜耳环境科学，新泽西州蒙特瓦尔</td><td>N/A</td><td>FINALE 除草剂</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>200004-444</td><td>卡那霉素单硫酸盐</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld，俄亥俄州都柏林</td><td>41320024-2</td><td>MES，游离酸</td></tr><tr><td>MS盐</td><td>MP Biomedicals，美国加利福尼亚州圣安娜</td><td>092621822</td><td>霍格兰改良基础盐混合物</td></tr><tr><td>N6-苄基腺嘌呤（BA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>B3274</td><td>6-苄氨基嘌呤溶液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>氯化钠</td></tr><tr><td>非离子型去垢剂</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>质粒提取试剂盒</td><td>Zymo Research，加利福尼亚州尔湾市</td><td>D4036</td><td>Zyppy 质粒提取试剂盒</td></tr><tr><td>重组酶酶混合试剂盒</td><td>Life Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonase II 酶混合物</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>R3501-1G</td><td>利福平，粉末， 
&amp;#8805; 97%（HPLC）</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>ThermoFisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 台式轨道摇床</td></tr><tr><td>土壤混合物</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 种植者培养基</td></tr><tr><td>壮观霉素</td><td>VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>无菌50 mL锥形管</td><td>USA Scientific，奥卡拉，佛罗里达州</td><td>1500-1811</td><td>50 mL 圆锥形螺口管，共聚物材质，带支架，无菌</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>57-50-1</td><td>蔗糖，ACS级</td></tr><tr><td>表面活性剂溶液</td><td>Lehle 种子，Round Rock，德克萨斯州</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>基于拓扑异构酶的克隆试剂盒</td><td>Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德</td><td>K240020</td><td>pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒，含 One Shot TOP10 化学感受态细胞 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto 胰蛋白胨，BD Biosciences</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>VWR International，拉德诺，宾夕法尼亚州</td><td>90000-722&amp;nbsp;</td><td>BD Bacto 酵母提取物，BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

植物生长及农杆菌介导的极端植物花序浸润转化 schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula 是一种适应多种非生物胁迫（包括多种离子毒害胁迫）的极端环境植物。尽管已有高质量的基因组资源可用于研究植物如何适应环境胁迫，但由于缺乏可行的遗传转化体系，其作为功能基因组学研究模型和工具的价值一直受到限制。在本实验方案中，我们报道了利用农杆菌介导的花序浸染法（floral-dip）获得稳定转基因 S. parvula 植株的方法。我们对拟南芥（A. thaliana）常用的转化流程进行了改良，以适应 S. parvula 特有的生物学特征，例如无限花序生长习性和叶片表面丰富的表皮蜡质。简要而言，S. parvula 种子在播种前需在 4 °C 下进行为期五天的春化处理。植株在 14 小时光照 / 10 小时黑暗的光周期、光照强度为 130 µmol m-2s-1、温度为 22 °C 至 24 °C 的条件下培养。选择生长 8 至 9 周、具有多个花序的植株进行转化。将这些花序浸入含有携带 pMP90RK 质粒的 Agrobacterium tumefaciens GV3101 菌株的侵染液中。为提高转化效率，我们进行了两轮花序浸染，间隔时间为三至四周。收集 T1 代种子后，将其置于含干燥剂的容器中干燥四周，再进行萌发，以筛选潜在的转化植株。利用对除草剂 BASTA 的抗性对 T1 代植株进行筛选。从两周龄的植株开始，每隔三天喷洒一次 BASTA 溶液，共喷三次，以减少假阳性结果。对存活的单株进行 BASTA 滴液检测，以鉴定真正的阳性转化植株。该方法的转化效率为 0.033%，每 10,000 粒 T1 代种子可获得 3–4 株转基因植株。

我们开发了一种转化方案，可实现对T的收获0 150 天内使用改良的蘸花法 A. thaliana. 图1 展示了时间线的概要 S. parvula 代表通过花浸法进行转化最佳时期的植株。我们选择了 S. parvula 萌发后60–80天、具有70–80朵花且花序多歧的植株作为转化的目标时期。在此阶段，浸润前需去除少量已开放或已受精的花朵及角果。 A. tumefaciens 通过花序浸渍法进行感染。 A. tumefaciens 导致部分花朵流产（图2，括号（a）所示）。经蘸花法处理后完全发育的角果很可能含有转化种子（图2，括号（b）。即使在转化后 S. parvula 只要植株保持健康，便会持续发育出新的花序和花朵（图2<...

利用农杆菌介导的花序浸润法转化，可成功创制耐受极端环境的模式植物Schrenkiella parvula的稳定转基因株系。本文提供了一种基于Arabidopsis thaliana转化方案的改良方法，该方法考虑了该极端环境适应植物在生长习性和生理特性上的差异。

植物生长及农杆菌介导的极端植物花序浸润转化 Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula 是一种适应多种非生物胁迫的极端植物，包括多种离子毒害胁迫。尽管已有高质量的基因组……

该方法是一种可重复的须兰芥（Schrenkiella parvula）遗传转化实验方案，有助于回答植物比较基因组学和功能基因组学领域中的科学问题，尤其适用于研究植物对恶劣环境适应机制的相关研究。该技术能够对须兰芥这种适应多种离子盐胁迫的极端环境植物进行常规功能研究，同时也支持与其近缘物种拟南芥（Arabidopsis thaliana）开展比较研究。将小花南芥（Schrenkiella parvula）与拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行比较，有助于深入了解基因调控和功能上的差异，从而揭示小花南芥独特适应性的机制。拟南芥的遗传转化实验方案已经非常成熟，而本方法的建立使得利用转基因小花南芥植株开展比较研究成为可能。初学者通常会因 Schrenkiella parvula 植物的开花习性和叶片形态而遇到困难，这使得利用农杆菌浸花法进行有效转化以及筛选真正的转化子变得具有挑战性。首先，使用湿润的牙签将约 20 至 25 粒 S. parvula 种子转移到湿润的土壤中，随后在 4°C 下对种子进行 5 至 7 天的春化处理。层积处理后，将种子放回生长室培养7至10天。待所有幼苗萌发后，仅保留每个花盆四个角及中心位置的各一株幼苗。在生长室中继续培养植株8至10周，直至开花。转化当天，根据文本方案选取 S.Parvula 植株。使用镊子和小剪刀去除任何已授粉并正在发育成角果的花序。植株准备就绪后，配制农杆菌侵染液。此后，将 S.Parvula 的花序浸入农杆菌侵染溶液中 20 秒。图中所示为可用于转化的最早发育阶段的植株，只要在转化前去除已经发育的角果，也可使用具有更多花朵的较老植株。转化后，将蘸取过花序的植株水平放置于洁净的托盘中，并用罩盖覆盖植株。然后将植株置于黑暗的培养室中1至2天。将植株恢复直立位置，并转移至培养室。在接下来的一周内，观察浸蘸过的花序。首次花序浸润后十天，S. parvula 植株将继续产生新的花序和角果。可进行第二轮花序浸润，以进一步转化新出现的花序。将植株培养至种子成熟，并在约21周时收获种子。将种子在室温下置于装有干燥剂的密闭容器中干燥两到三周。根据文本方案种植 T one 代种子。将植株培养至前两到三片真叶发育完全。为了进行除草剂抗性的首次筛选，将草铵膦铵盐除草剂稀释后喷洒在幼苗上。用育苗罩覆盖幼苗过夜。将育苗盘放回生长室，并移除育苗罩。等待除草剂筛选出大部分幼苗。开始第二轮筛选时，鉴定出经草铵膦溶液喷洒三到四次后仍存活的植株。将这些植株再培养两到三周后，选取每株上最大的成熟叶片。接着用手指轻轻擦拭叶片表面，以去除蜡质层。然后在叶片上滴加一滴稀释的BASTA溶液。用BASTA溶液处理后，持续观察叶片是否出现萎蔫症状，最长观察时间为一周。最后选择叶片未受BASTA溶液影响的植株用于进一步分析。在本实验方案中，使用农杆菌介导的花序浸润法对S. parvula进行了转化。农杆菌感染导致部分花朵发生败育。然而，S.Parvula 植株在首次浸花后仍能继续产生新的花朵，可进行再次转化。通过使用 BASTA 喷雾和滴加检测，能够准确鉴定真正的阳性转化植株，从而减少需要通过 PCR 验证检测的样本数量。尽管该方法与拟南芥的转化方法相似，但必须牢记卷曲 schrenkiella（Schrenkiella parvula）在生长和形态上的差异。对实验方案进行修改以反映这些差异，对于成功转化至关重要。该技术可帮助研究人员探究基因组变异的演化过程，从而揭示极端环境模式植物卷曲 schrenkiella（Schrenkiella parvula）对多种盐胁迫适应的机制。将该技术与关于拟南芥（Aradopsis Thaliana）功能的信息相结合，拟南芥是与小花南芥（Schrenkiella Parvula）亲缘关系较近的另一种植物。研究人员可借此研究这两种物种间在调控机制和功能上的差异，这些差异源于两者之间两种不同的结构。在转化过程中，务必将所有农杆菌浸润溶液置于可高压灭菌的容器中保存。将所有接触过农杆菌的材料，包括手套、移液器吸头和纸巾，进行灭菌并安全丢弃。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

植物生长与农杆菌介导的植物浸水转化

本文介绍了花序浸渍法 Agrobacterium tumefaciens 介导的转化 拟南芥通过引入细胞周期调控的启动子-报告基因系统， pTSO2::β-葡萄糖醛酸酶（GUS），进入...

花浸法转化 拟南芥 用于检查 pTSO2::β-葡萄糖醛酸酶 报告基因表达

来源：Lee, H. et. al., 利用分裂绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白。J. Vis. Exp.

监测植物细胞中的细菌感染与效应蛋白递送

在本视频中，我们演示了转基因的生成 拟南芥 通过稳定转基因表达的植物...

基于双元细菌人工染色体载体的拟南芥基因转化：一种产生单拷贝插入转基因植株的技术

在此，我们介绍一种利用亚麻进行转化的实验方案...

花序浸渍法转化亚麻（Linum usitatissimum）以获得高转化率的转基因后代

使用pBIBAC-GW双元载体可轻松实现具有完整单拷贝插入的转基因植物的构建。本文提供了一系列实验方案，指导读者完成转基因拟南芥植株的构建过程，并对插入片段的完整性及拷贝数进行检测。...

利用BIBAC-GW双元载体产生单拷贝插入的转基因植物

基于荧光蛋白的方法在监测细菌向宿主细胞分泌效应蛋白时面临挑战，这主要是由于荧光蛋白与III型分泌系统之间存在不兼容性。本文采用一种优化的分裂型超折叠GFP系统，用于可视化细菌向宿主植物细胞中分泌的效应蛋白。...

利用分裂型绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白

本文介绍了两种转化马铃薯植株的实验方案。Agrobacterium tumefaciens 转化可获得完整的转基因植株，而 Agrobacterium rhizogenes...

Agrobacterium tumefaciens 和 Agrobacterium rhizogenes 介导的马铃薯转化及通过 GUS 染色检测木栓质合成基因的启动子活性

本文介绍了通过在大肠杆菌（Escherichia coli）或本氏烟草（Nicotiana...

一种可定制的二萜类天然产物酶法合成与纯化方法

本方案概述了以下方法的使用 根癌农杆菌介导的转化（AMT），用于将目的基因整合到绿色微藻的核基因组中...

Agrobacterium tumefaciens介导的绿色微藻Chlorella vulgaris遗传工程

我们提出了一种高效且经过优化的实验方案 农杆菌介导的无性繁殖两栖型十字花科物种的转化 Rorippa...

基于高效再生的农杆菌介导的水生无性繁殖十字花科植物 Rorippa aquatica 的遗传转化

我们提出了一种简单、有效且可重复的实验方案 农杆菌介导的转化 Phytophthora palmivora 同样适用于 P. capsici...

一种简化的实验方法 农杆菌介导的转化 Phytophthora palmivora

学习农杆菌介导的花序浸染法转化Schrenkiella parvula，建立稳定转基因株系。该方法适用于研究极端环境适应机制，可与拟南芥进行功能基因组学比较分析。

植物生长及农杆菌介导的极端植物花序浸润转化 Schrenkiella parvula

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